沈明明，季書立，閆恩法，韓紅麗，贠陽，張婧菲，王恬，張莉莉

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，江蘇 南京 210095)

竹葉在我國具有悠久的食用與藥用歷史，而利用竹葉制作的一些產(chǎn)品也進(jìn)入人類生活，如竹葉茶、竹葉啤酒、竹康寧膠囊等[1]。竹葉成分復(fù)雜，但隨著技術(shù)的進(jìn)步，研究人員已經(jīng)利用竹葉開發(fā)出以黃酮、多酚和多糖為主要活性成分的功能性物質(zhì)，即竹葉提取物(bamboo leaf extract，BLE)。研究發(fā)現(xiàn)，BLE具有優(yōu)良的防腐抑菌抗氧化功效[2-3]，目前在食品工業(yè)中已得到廣泛應(yīng)用。據(jù)報(bào)道，肉產(chǎn)品制作過程中添加BLE可減緩衰敗延長保質(zhì)期，在食用油加工、膨化食品和酒水飲料中加入BLE也可有效提高產(chǎn)品品質(zhì)[4]。近些年，有少量工作者將BLE應(yīng)用于畜牧生產(chǎn)中，研究發(fā)現(xiàn)在羅氏沼蝦和中華絨螯蟹中添加BLE可提高產(chǎn)品的抗氧化能力；奶牛全混合日糧中添加BLE可提高其產(chǎn)奶量和奶品質(zhì)[5]；肉雞日糧中添加BLE可提高胸肌肉系水力、pH值和嫩度[6]，并且提高機(jī)體抗氧化能力[7]。而飼料添加劑的安全關(guān)乎人類健康，無論直接添加或者間接添加到動(dòng)物飼料中都必須有一個(gè)安全嚴(yán)格的范圍。因此，本試驗(yàn)以肉仔雞為模型，基于前期試驗(yàn)工作篩選的一個(gè)安全有效劑量(0.30%)，以5倍、10倍高劑量添加到肉雞飼料中，通過研究高劑量竹葉提取物(1.50%和3.00%)對(duì)肉雞生長性能、器官指數(shù)、血常規(guī)、血清生化指標(biāo)和組織病理學(xué)的影響，對(duì)BLE在肉雞上耐受劑量進(jìn)行評(píng)價(jià)，為BLE作為肉雞飼料添加劑在畜牧生產(chǎn)中的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

愛拔益佳(AA)肉雞由安徽和威農(nóng)牧集團(tuán)提供；竹葉提取物由浙江新篁生物科技有限公司提供，有效成分：總黃酮含量70 mg/g，總多酚含量50.42 mg/g；VITALAB Selecta E 全自動(dòng)生化分析儀，荷蘭 MERK 公司。

總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)，血糖(GLU)、尿素氮(BUN)、總膽紅素(TBIL)、肌酐(CRE)試劑盒，上?？迫A生物工程有限公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與日糧

試驗(yàn)設(shè)計(jì)采用隨機(jī)單因子試驗(yàn)，選擇體重相近、1日齡的AA肉雞320只，隨機(jī)分為4組，即對(duì)照組、有效劑量組、5倍劑量和10倍劑量組；每組8個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10只雞。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)日糧，試驗(yàn)組在每千克基礎(chǔ)日糧中分別添加0.30%、1.50%和3.00% BLE。試驗(yàn)分為前期1～21 d和后期22～35 d，共計(jì)35 d。試驗(yàn)基礎(chǔ)日糧配方參照NRC1994《家禽的營養(yǎng)需要量》，日糧組成及營養(yǎng)成分見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平

1.3 飼養(yǎng)管理

所有試驗(yàn)肉雞飼養(yǎng)于同一雞舍和同一飼養(yǎng)條件，試驗(yàn)前對(duì)雞舍及器具進(jìn)行消毒，通風(fēng)散氣1周后引進(jìn)雞苗，置于三層籠養(yǎng)。飲水槽和料槽每日清理1次，每日喂料2次。試驗(yàn)期間肉雞自由采食與飲水，光照管理為23 h光照和1 h黑暗。肉雞免疫接種與雞舍消毒均按常規(guī)進(jìn)行。

1.4 樣品采集

試驗(yàn)第21和35 天每個(gè)重復(fù)選取1只肉雞，翅靜脈采血于EDTA抗凝采血管中用于測(cè)定血常規(guī)指標(biāo)，隨后頸靜脈采血于10 mL非抗凝管中，4 ℃、3 500 r/min離心10 min制備血清，并置于-20 ℃冰箱保存。

1.5 指標(biāo)測(cè)定

1.5.1 生長性能

1日齡試驗(yàn)雞體重于進(jìn)雞當(dāng)日按重復(fù)稱重，于試驗(yàn)第21和35 天早晨稱重(此前停飼12 h，自由飲水)，計(jì)算肉雞平均重(ABW)。每天記錄肉雞的采食量，以重復(fù)為單位分別計(jì)算平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)和料重比(F/G)。

1.5.2 器官指數(shù)

試驗(yàn)第21和35 天每個(gè)重復(fù)選取1只肉雞，頸靜脈放血致死后迅速解剖，取心臟、肝臟、脾臟、胸腺和法氏囊。剔除器官脂肪并迅速稱重，計(jì)算器官指數(shù)(器官重/肉雞活重×100%)。第35天同時(shí)取心臟、肝臟、胰腺、胸腺等組織于4%多聚甲醛固定用于制作HE染色切片。

1.5.3 血常規(guī)指標(biāo)

將采集的抗凝血送至武漢賽維爾生物科技有限公司，使用邁瑞獸用全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀分析血液常規(guī)指標(biāo)，主要包括白細(xì)胞數(shù)(WBC)、紅細(xì)胞數(shù)(RBC)、血紅蛋白濃度(HGB)、紅細(xì)胞壓積(HCT)、血小板數(shù)(PLT)和平均血小板體積(MPV)。

1.5.4 血清生化指標(biāo)

取保存于-20 ℃的血清，4 ℃解融后利用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定TC、TG、TP、ALB、GLU、BUN、TBIL、CRE含量和AST、ALT活力。

1.5.5 器官組織學(xué)觀察

心臟、肝臟、胰腺、胸腺等組織經(jīng)多聚甲醛固定后，經(jīng)水洗、包埋、切片、染色后，進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。

1.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析采用完全隨機(jī)化設(shè)計(jì)，以重復(fù)為試驗(yàn)單位。所有數(shù)據(jù)經(jīng) Excel 2016 進(jìn)行初步處理，采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，采用單因素方差分析(One-way ANOVA)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，LSD進(jìn)行多重比較，同時(shí)進(jìn)行線性二次分析，以P<0.05為差異顯著判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 日糧添加不同劑量竹葉提取物對(duì)肉雞生長性能的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明(表2)，在試驗(yàn)前期，與對(duì)照組相比，添加高劑量BLE對(duì)肉雞ADFI、ADG、F/G和21 d時(shí)ABW無顯著影響(P>0.05)。試驗(yàn)后期，添加高劑量BLE則顯著提高肉雞ADFI和ADG，其中ADFI分別提高14.31%和14.49%；ADG分別提高11.80%和11.93%，且線性升高顯著(P<0.05)；但添加高劑量BLE對(duì)F/G無顯著影響(P>0.05)。以整個(gè)試驗(yàn)周期來看，添加BLE對(duì)肉雞ADFI、ADG和F/G均無顯著影響(P>0.05)。

表2 日糧添加不同劑量竹葉提取物對(duì)肉雞生長性能的影響

2.2 日糧添加不同劑量竹葉提取物對(duì)肉雞器官指數(shù)的影響

試驗(yàn)前期(表3)和后期(表4)，與對(duì)照組相比，添加BLE對(duì)肉雞各器官指數(shù)無顯著影響(P>0.05)，但試驗(yàn)前期肉雞肝臟指數(shù)有線性升高的趨勢(shì)(P<0.1)，前期和后期肉雞胸腺指數(shù)有降低的趨勢(shì)(P<0.1)。

表3 日糧添加不同劑量竹葉提取物對(duì)肉雞前期器官指數(shù)的影響 %

表4 日糧添加不同劑量竹葉提取物對(duì)肉雞后期器官指數(shù)的影響 %

2.3 日糧添加不同劑量竹葉提取物對(duì)肉雞血常規(guī)指標(biāo)的影響

由表5可知，試驗(yàn)前期，與對(duì)照組相比，添加不同劑量BLE對(duì)肉雞WBC、RBC、HGB和HCT無顯著影響，但高劑量組PLT顯著降低，且線性降低顯著(P<0.05)，BLE可顯著提高肉雞MPV，且線性升高顯著(P<0.05)。

由表6可知，試驗(yàn)后期，與對(duì)照組相比，添加不同劑量BLE對(duì)肉雞血常規(guī)指標(biāo)無顯著影響(P>0.05)。

表5 日糧添加不同劑量竹葉提取物對(duì)肉雞前期血常規(guī)的影響

表6 日糧添加不同劑量竹葉提取物對(duì)肉雞后期血常規(guī)的影響

2.4 日糧添加不同劑量竹葉提取物對(duì)肉雞血清生化指標(biāo)的影響

試驗(yàn)前期(表7)，與對(duì)照組相比，添加高劑量BLE可顯著降低肉雞血清TC含量，分別降低16.88%和16.24%，且線性和二次性降低顯著(P<0.05)；0.30%和1.50%組肉雞血清總TG水平顯著低于對(duì)照組，分別降低46.00%和36.00%，且隨著BLE添加劑量的提高，血清TG水平呈線性降低(P<0.05)。

試驗(yàn)前期0.30%和3.00%組肉雞血清AST活力顯著低于對(duì)照組，且隨著BLE添加量的升高，血清AST活力前期(表7)呈線性顯著降低和后期(表8)呈二次性降低(P<0.05)。與對(duì)照組相比，試驗(yàn)前期和后期0.30%和3.00%組肉雞血清ALB含量顯著升高，分別提高17.63%、18.37%和18.12%、19.39%。并且隨著BLE添加量的升高，血清ALB線性升高顯著(P<0.05)。試驗(yàn)前期1.50%組和后期1.50%、3.00%組肉雞GLU含量顯著高于對(duì)照組，且肉雞前期血清GLU含量隨BLE劑量呈顯著二次性升高，后期呈線性升高(P<0.05)。

表7 日糧添加不同劑量竹葉提取物對(duì)肉雞前期血清生化指標(biāo)的影響

表8 日糧添加不同劑量竹葉提取物對(duì)肉雞后期血清生化指標(biāo)的影響

2.5 日糧添加不同劑量竹葉提取物對(duì)肉雞器官組織病理學(xué)的影響

在對(duì)肉雞進(jìn)行解剖時(shí)發(fā)現(xiàn)肉雞腹腔、胸腔結(jié)構(gòu)完整，內(nèi)部無積水或異物出現(xiàn)，心、肝、脾、胰腺、腎臟表面光滑，結(jié)構(gòu)完整，大小適中。食管、腺胃、十二指腸和空腸等消化組織表面顏色正常，未見出血點(diǎn)和糜爛等情況。通過對(duì)照組和BLE劑量組的組織切片觀察發(fā)現(xiàn)，添加BLE未對(duì)實(shí)質(zhì)性組織造成病變(如心、肝和胰腺)。各組肉雞心臟(圖1)HE染色切片觀察發(fā)現(xiàn)心肌著色均勻，心肌纖維結(jié)構(gòu)完整清晰、排列規(guī)則整齊，隔膜清晰可辨，肌漿豐富飽滿，內(nèi)部未見明顯異常，視野內(nèi)未見炎性細(xì)胞浸潤與結(jié)節(jié)病變。各組肝臟HE(圖2)切片觀察表明：肝臟結(jié)構(gòu)清晰可辯，肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞排列呈索狀，無壞死及變性，肝竇無擴(kuò)張，匯管區(qū)無可見炎性細(xì)胞浸潤，視野內(nèi)未發(fā)現(xiàn)脂肪樣變化，核細(xì)胞及細(xì)胞邊界結(jié)構(gòu)清晰。胰腺HE(圖3)切片觀察發(fā)現(xiàn)胰腺結(jié)構(gòu)清晰，腺泡細(xì)胞分葉少，排列緊密，胰島排列呈團(tuán)索狀，數(shù)量較多，形狀規(guī)則，邊界分明，胰島內(nèi)細(xì)胞數(shù)量多。

A. 對(duì)照組；B. 0.30%BLE組；C. 1.50%BLE組；D. 3.00%BLE組。下同

圖2 肉雞肝臟病理切片(比例尺=50 μm)

圖3 肉雞胰腺病理切片(比例尺=50 μm)

3 討論

BLE是由竹葉黃酮、多酚和多糖組成的生物活性物質(zhì)。據(jù)報(bào)道黃酮、多酚類物質(zhì)具有類雌激素作用，可促進(jìn)機(jī)體生長發(fā)育[8]；但有報(bào)道稱機(jī)體攝入高劑量大豆黃酮會(huì)抑制睪酮和生長激素的合成與釋放，反而抑制生長[9]。張錦玥等[10]報(bào)道竹葉黃酮可以緩解肉雞免疫抑制導(dǎo)致的生長受限。

舒剛等[11]以7日齡肉雞為模型，在飲水中加入1、3、5和10 g/L竹葉黃酮連續(xù)添加7 d，同樣發(fā)現(xiàn)10 g/L劑量飲水添加未造成肉雞生長受限，這與本試驗(yàn)結(jié)果類似，可見BLE并不會(huì)影響肉雞生長。此外，Lu等[12-13]對(duì)小鼠90 d口服BLE溶液進(jìn)行毒性的研究表明，小鼠采食量與日增重并沒發(fā)生顯著變化，其中最高劑量4.3 g/kg也未對(duì)小鼠產(chǎn)生毒害作用，可推斷BLE毒性較小。整體而言，從表觀上看肉雞飼料最高添加3.00% BLE對(duì)機(jī)體生長發(fā)育不會(huì)造成影響，BLE具有一定的安全性。

大多數(shù)研究報(bào)道器官指數(shù)越高說明機(jī)體發(fā)育越好[14]，李正田等[15]報(bào)道日糧中添加適量竹葉黃酮可提高濟(jì)寧百日雞早期肝臟指數(shù)，這與本試驗(yàn)結(jié)果類似。丁紅秀等[16]闡明BLE能夠顯著改善小鼠肝腫大、降低肝臟粗脂肪含量，而本試驗(yàn)后期BLE對(duì)肝臟指數(shù)無顯著影響可能與降低脂肪含量有關(guān)。雖然胸腺指數(shù)有降低的趨勢(shì)，但和對(duì)照組相比無顯著差異，且組織病理學(xué)檢查表明胸腺皮髓、皮質(zhì)結(jié)構(gòu)正常，胸腺小葉結(jié)構(gòu)完整體積正常，因此認(rèn)為該降低趨勢(shì)與竹葉提取物添加量無關(guān)。從器官指數(shù)可見BLE未對(duì)肉雞器官發(fā)育造成影響。

血常規(guī)指標(biāo)對(duì)診斷機(jī)體健康具有重要臨床意義。白細(xì)胞是體內(nèi)重要的免疫細(xì)胞，通過分泌白介素、干擾素、腫瘤壞死因子等參與機(jī)體炎癥與免疫調(diào)控[17]；當(dāng)機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)失衡時(shí)會(huì)導(dǎo)致紅細(xì)胞增多或減少，而血小板是重要的凝血因子[18]。本試驗(yàn)中雖然BLE顯著降低前期PLT，但可通過提高血小板的體積來彌補(bǔ)血小板數(shù)目的減少，從而維持肉雞凝血功能。BLE對(duì)肉雞后期血液常規(guī)指標(biāo)也未造成影響，可見肉雞代謝正常，并未產(chǎn)生毒害作用。

研究表明BLE可改善高脂血癥小鼠脂質(zhì)代謝，降低血清TC含量[16]；且BLE對(duì)糖尿病并發(fā)癥小鼠也有改善糖脂代謝作用[19]。大量研究證實(shí)植物源性黃酮、多酚類物質(zhì)在肉雞機(jī)體發(fā)揮明顯的降脂作用，如染料木黃酮[20]和大豆黃酮[21]。先前研究表明BLE可能通過上調(diào)膽固醇 7-α羥化酶 (CYP7A1)、低密度脂蛋白受體 (LDLR)和下調(diào)3-羥-3-甲基戊二酸單酰輔酶 A 還原酶 (HMGCR)基因的表達(dá)來降低血清TC含量[22]，而本試驗(yàn)結(jié)果說明即便BLE添加量很高的情況下仍然可以改善肉雞脂質(zhì)代謝，并且存在劑量效應(yīng)。當(dāng)肝臟受損時(shí)，血清中ALT和AST會(huì)顯著升高。Zhang等[23]研究表明BLE可以緩解肝損傷，并且降低血清ALT和AST活力，這與本試驗(yàn)結(jié)果類似，機(jī)體從食物中吸收蛋白質(zhì)進(jìn)行合成ALB，肝臟是合成ALB的場(chǎng)所，當(dāng)機(jī)體消化吸收功能出現(xiàn)障礙時(shí)，肝細(xì)胞則無法獲取前體物質(zhì)進(jìn)行蛋白合成，從而血清ALB水平降低，并且ALB水平與免疫功能密切相關(guān)[24]。本試驗(yàn)中血清ALB變化與吳紅燕等[25]研究結(jié)果相同，但蛋白含量升高可能也與竹葉黃酮減少體內(nèi)蛋白質(zhì)分解和糖原消耗有關(guān)。以上結(jié)果提示BLE未對(duì)肝臟合成ALB能力造成影響，可見添加BLE未引起肝臟損傷。Yang等[26]闡明黃酮類物質(zhì)可與α淀粉酶活性部位發(fā)生作用，從而抑制葡萄糖生成。本試驗(yàn)中血糖變化與吳紅燕等[25]研究結(jié)果不一致，推測(cè)可能是BLE富含竹葉多糖所致。TBIL是血液循環(huán)中衰老紅細(xì)胞在肝臟、脾臟及骨髓的單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)中分解和破壞的產(chǎn)物；血清中CRE濃度可以衡量腎小球功能，而BUN則反映蛋白質(zhì)和氨基酸之間的平衡狀況[21]。本試驗(yàn)結(jié)果表明BLE對(duì)肉雞血清TBIL、CRE和BUN含量無顯著影響，可見肉雞肝臟、腎臟等器官功能正常。器官組織的病變會(huì)影響血液指標(biāo)的變化，而本試驗(yàn)結(jié)果表明肉雞血液指標(biāo)無異常，可見各器官結(jié)構(gòu)完整、功能正常。舒剛等[11]同樣發(fā)現(xiàn)肉雞飲水中添加BLE也不會(huì)影響肉雞器官組織結(jié)構(gòu)，這與本試驗(yàn)結(jié)果類似?？梢夿LE的安全性不會(huì)因?yàn)樘砑臃绞降母淖兌l(fā)生變化。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，肉雞日糧添加BLE可提高肉雞后期ADFI和ADG，BLE對(duì)肉雞器官指數(shù)無顯著影響。血常規(guī)和血清生化指標(biāo)表明BLE對(duì)肉雞脂質(zhì)代謝具有改善作用，且未對(duì)肉雞內(nèi)臟器官功能造成影響，病理切片顯示BLE對(duì)肉雞器官未造成損傷。綜上所述，肉雞對(duì)BLE具有一定的耐受性，BLE可作為一種安全肉雞飼料添加劑使用。