朱向蕾

(上海動物園，上海 200335)

性別是鳥類最重要的特征之一，鳥類的雌雄個體在生理、行為、生態(tài)等方面具有差別。鳥類的性別鑒定，特別是性別的早期鑒定對鳥類的飼養(yǎng)管理、繁殖與育種、遺傳疾病的防治、進化生態(tài)學(xué)、種群結(jié)構(gòu)和群體遺傳分析等方面都有非常重要的意義，尤其是對瀕危珍稀鳥類的保護研究和管理具有重要作用[1-4]。為了保護生態(tài)平衡，許多動物園通過人工飼養(yǎng)繁育的方法來提高瀕危鳥類的存活率和繁殖率，而動物的繁殖育種均離不開性別鑒定，合理的性別比例是動物得以繁殖的必備條件之一。

全世界鳥類中有超50%的鳥類是雌雄同形的單態(tài)性鳥類，這些鳥類無論成幼均很難從外觀形態(tài)上來鑒別性別[5]。對單態(tài)性成鳥或雛鳥/亞成鳥的常規(guī)鑒定方法有：生殖器官形態(tài)學(xué)檢視、生理激素測定等，對鳥類均造成一定的應(yīng)激或侵入式傷害，尤其是雛鳥、珍稀個體。因此，使用快速可靠安全的方法鑒別性別，對鳥類保育研究工作的成功開展尤為重要。

鳥類性別鑒定有很多方法，可以從身體表面的明顯斑塊、個體的行為觀察、形態(tài)學(xué)特征的差異、解剖學(xué)或腹腔鏡檢查以及性染色體的檢查等方面進行。傳統(tǒng)的性別鑒定方法有腹腔鏡檢查、翻肛鑒別、類固醇鑒別、核型分析等[6]。腹腔鏡檢查需要麻醉，有一定風(fēng)險，對于瀕危野生動物并不適宜；翻肛鑒別需要相當(dāng)豐富的經(jīng)驗；利用排泄物進行類固醇鑒別耗時，準(zhǔn)確性低；核型分析獲得結(jié)果時間較長，對于Z染色體和W染色體差異較小的鳥類不適用。隨著時代的進展，分子生物學(xué)飛速發(fā)展，性染色體的鑒定檢查趨于流行，染色體螺旋蛋白(CHD)基因?qū)儆诠δ苄曰?，十分保守，?個同源拷貝CHD-W和CHD-Z，在鳥類性別鑒定中發(fā)揮著巨大作用[7]。

上海動物園目前飼養(yǎng)有鳥類19目42科180余種，超過70%的種類為單態(tài)性鳥類，近90%的個體性別信息尚不明確。自上世紀(jì)70年代起，該園一直開展珍稀鳥類的人工飼養(yǎng)繁育工作。胡瑞穎等[8]已經(jīng)對丹頂鶴、白枕鶴、東方白鶴等9種86只國家一級保護鳥類進行了性別鑒定，田秀華等[9]對7種鶴形目鳥類進行了性別鑒定，相關(guān)成果運用于繁育實踐，為在更廣范圍內(nèi)進一步開展鳥類性別的分子鑒定工作奠定了基礎(chǔ)。

本研究主要通過分子生物學(xué)手段在已有研究的基礎(chǔ)上對鳥類的性別進行快速準(zhǔn)確地鑒定，以便為動物園中鳥類群體的飼養(yǎng)管理和繁殖育種提供性別信息。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

采集上海動物園內(nèi)正常飼養(yǎng)的部分鳥類羽毛，包括斑嘴環(huán)企鵝、鵜鶘、鶴鴕、小天鵝、鞭笞鵎鵼、鶴鸛類、鸚鵡類等共涉及9目26種258只。采集樣品均為鳥類胸部體毛，確保羽根完整，常溫干燥保存，或-80 ℃長期保存。使用含EDTA抗凝管采集鳥翅根處血液，-20 ℃冷凍保存待用。

1.2 主要試劑

使用MiniBEST Whole Blood Genomic DNA Extraction Kit(Code No.9781)提取血液樣本組DNA，-20 ℃冷凍保存待用。MightyAmpTMDNA Polymerase Ver.3 Kit、HaeⅢ、6×Loading Buffer、50 bp DNA Ladder均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 引物設(shè)計

參考文獻[10-11]設(shè)計引物，3對引物序列如下：P2(5′-TCTGCATCGCTAAATCCTTT-3′)、P8(5′-CTCCCAAGGATGAGRAAYTG-3′)；2550 F(5′-GTTACTGATTCGTCTACGAGA-3′) 、 2718R (5′-ATTGAAATGATCCAGTGCTTG-3′)[10]；K7(5′-AGGGTGTCTAGAACAAAAGAGA-3′)、W1(5′-CCTTTAAACAAGCTGTTAAAGCA-3′)[11]，引物由英濰捷基公司合成。

1.4 PCR反應(yīng)與酶切反應(yīng)

PCR反應(yīng)體系為20 μL，其中：MightyAmp DNA Polymerase 0.4 μL，2×MightyAmp Buffer 10 μL，引物各0.6 μL，其中血液樣本DNA 2 μL或剪取1 mm長2～3段羽根，補充ddH2O至20 μL。P2/P8、2550F/2718R退火溫度為48 ℃，K7/W1采用55 ℃、50 ℃、47 ℃溫度降落式PCR，反應(yīng)在PCR儀上進行。1.5%～2.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，產(chǎn)物由寶生物工程(大連)有限公司進行克隆測序。酶切體系為：HaeⅢ 0.5 μL，10×M Buffer 1 μL，PCR產(chǎn)物8.5 μL。37 ℃水浴過夜(16～20 h)[12]。酶切后產(chǎn)物經(jīng)1.5%～2.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結(jié)果

2.1 羽根樣品及PCR方法的有效性驗證

以已知性別的火烈鳥和美洲紅鹮為例，分別以血液抽屜的DNA和羽根樣本作為模板，2550F/2718R為引物，擴增CHD基因片段，驗證以羽根樣品直接PCR檢測的有效性和可靠性。

產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳，結(jié)果顯示2種鳥類的雄性均擴增出1條條帶，經(jīng)克隆測序與NCBI GenBank序列比對，大小為663 bp；雌性均擴增出2條條帶，大小分別為663 和460 bp。兩物種血液組DNA與羽根樣本擴增結(jié)果一致，性別鑒定結(jié)果準(zhǔn)確。從圖1觀察，以未經(jīng)提取純化的羽根為模板的PCR產(chǎn)物，條帶清晰度和產(chǎn)物濃度與血液組DNA相比，無明顯差異，也無明顯非特異性擴增，可用于性別鑒定(圖1)。

1、5. 火烈鳥羽毛毛囊；2、6. 美洲紅鹮羽毛毛囊；3、7. 火烈鳥全血基因組DNA；4、8. 美洲紅鹮全血基因組DNA；M. Marker

2.2 白鵜鶘和斑嘴環(huán)企鵝的性別鑒定

利用P2/P8引物對白鵜鶘進行性別鑒定，鑒定結(jié)果如圖2所示。HaeⅢ酶切后雄性可出現(xiàn)1條條帶，經(jīng)克隆測序與NCBI GenBank序列比對，大小為321 bp;雌性為2條條帶，大小分別為321和234 bp(圖2)。

利用P2/P8引物對斑嘴環(huán)企鵝進行性別鑒定，單純進行PCR擴增后，每個樣品均擴增出1條條帶，經(jīng)克隆測序與NCBI GenBank序列比對，大小367 bp，難以判斷性別。經(jīng)HaeⅢ酶切后雄性可看到2條條帶，其中明顯的一條為302 bp，最下面1條條帶較淡，未測序，大小在50～100 bp;雌性為3條條帶，多了1條大小為367 bp的條帶(圖3)。

1、3、5、7、9. P2/P8引物擴增；2、4、6、8、10. 擴增產(chǎn)物經(jīng)HaeⅢ酶切；M.Marker

1、3、5、7、9. P2/P8引物擴增；2、4、6、8、10.擴增產(chǎn)物經(jīng)HaeⅢ酶切；M.Marker

2.3 鶴鴕的性別鑒定

擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后結(jié)果如圖4，所有樣品均擴增出1條大小約350 bp的條帶，而雌性除了350 bp大小的條帶外，多擴增1條約150 bp的條帶。

1～4. 用K7/W1引物擴增；M.Marker

2.4 檢驗樣品及引物匯總

通過PCR方法對上海動物園中9目26種258只鳥類進行了性別鑒定，其中：鸚形目、鸛形目、鶴形目及鴷形目鳥類應(yīng)用2550F/2718R引物，企鵝目及鵜鶘目應(yīng)用P2/P8引物，鴕形目及鶴鴕目的非平胸類鳥類應(yīng)用K7/W1引物，雁形目鳥類的引物選擇根據(jù)種屬的不同選擇了不同的引物。試驗過程中檢驗樣品及引物匯總見表1。

表1 珍稀鳥類性別鑒定物種及其引物匯總

3 討論

有研究嘗試應(yīng)用鳥類外部形態(tài)進行性別鑒定，如體重和尾長[15]、羽毛和大小[16]、性別特定行為和鳥喙長度[17]。與傳統(tǒng)方法相比，分子生物學(xué)手段鑒定鳥類性別取樣量小、準(zhǔn)確率高、迅速、鳥類應(yīng)激反應(yīng)小，是開展鳥類飼養(yǎng)繁育、生態(tài)學(xué)、形態(tài)學(xué)等領(lǐng)域研究的基礎(chǔ)技術(shù)。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，利用DNA進行性別鑒定被廣泛應(yīng)用，血液和羽毛均可作為樣本來源進行鑒定，為了減少對鳥類的損傷，采集羽毛可以降低鳥類的應(yīng)激反應(yīng)，避免了過度失血。動物園飼養(yǎng)的鳥類大多屬于群養(yǎng)，如果有足夠的籠舍可進行完善的隔離，非損傷性取樣將會是最佳的取樣方式。采集羽毛簡便易行且對研究對象幾乎無傷害，使其在對鳥類性別的分子生物學(xué)鑒定和保護遺傳學(xué)研究領(lǐng)域中得到廣泛的應(yīng)用[18-19]。

3.1 火烈鳥

李文斌等[20]運用2550F/2718R這對引物對火烈鳥進行了性別鑒定，目的條帶分別為800 bp和600 bp左右；陳蓉等[14]也應(yīng)用這對引物進行了火烈鳥的性別鑒定，目的條帶大小分別在750～500 bp，500～250 bp；本文的目的條帶經(jīng)測序后是663 bp和460 bp，與陳蓉等[14]的結(jié)果一致，但與李文斌等[20]結(jié)果略有差異，可能與退火溫度有關(guān)，但并不影響結(jié)果判定。

3.2 企鵝

Zhang等[21]對帝王企鵝(Aptenodytespatagonicus)，鳳冠企鵝(Eudypteschrysocome)，金頭企鵝(Pygoscelispapua)和麥哲倫企鵝(Spheniscusmagellanicus)4種企鵝應(yīng)用(2550F/2718R和P2/P8)2對引物進行了性別鑒定，結(jié)果2對引物并不適用于所有的企鵝。沈瑋等[22]應(yīng)用P2/P8引物對南京海底世界的6只帝企鵝進行了性別鑒定，但是由于CHD-Z和CHD-W的大小相近，瓊脂糖凝膠電泳均顯現(xiàn)出1條條帶，給性別鑒定帶來了一定困難。Costantini等[12]應(yīng)用P2/P8引物對洪堡企鵝(Spheniscushumboldti)進行了性別鑒定，3項研究中都沒有涉及到斑嘴環(huán)企鵝。本研究在洪堡企鵝研究的基礎(chǔ)上應(yīng)用P2/P8引物進行擴增，擴增后均顯示1條條帶，原因在于雌雄條帶相差較小，難以區(qū)分?？紤]到企鵝種間的相近性后續(xù)依舊用HaeⅢ進行了酶切，酶切后雌性可出現(xiàn)3條條帶(367、 302 和 50～100 bp)，不同于洪堡企鵝(380、310和60 bp)；雄性表現(xiàn)為2條條帶(302 和50～100 bp)，不同于洪堡企鵝(310和60 bp)。條帶大小不同顯示了物種間的差異性，但可以準(zhǔn)確地進行性別判定，經(jīng)一定數(shù)量的酶切反應(yīng)試驗，以更好地進行性別的判定。袁夢[23]應(yīng)用引物P2/P8對鵜鶘性別進行鑒定，經(jīng)酶切結(jié)果為雄性個體擴增出1條條帶，大小為550 bp，雌性個體為2條條帶，大小分別為550和490 bp，與本文結(jié)果有差異。分析可能本研究所用樣品為白鵜鶘，可能是鵜鶘種間差異，亦或是退火溫度的影響，具體原因有待進一步研究。

3.3 鶴鴕

非平胸目鳥類的性別鑒定引物無法用于平胸目鳥類性別的鑒定，Bello等[24]利用隨機擴增多態(tài)性DNA法(RAPD)進行鴕鳥的性別鑒定，付晶等[25]建立了鴯鹋性別鑒定的分子標(biāo)記方法，Huynen等[11]采用RAPD進行性別特異性標(biāo)記，利用引物K1、K2、K3、K4對鴯鹋、鴕鳥等平胸目鳥類進行性別鑒定，但有時無法擴增雄性基因片段；進一步設(shè)計了W1和K7引物，該引物雌雄大小差異較大，對鴕鳥、鴯鹋的性別分析更為準(zhǔn)確，但沒有涉及到鶴鴕。本研究在此基礎(chǔ)上改變了部分反應(yīng)條件，縮短了變性和退火時間，降低了延伸的溫度，所得結(jié)果可以準(zhǔn)確有效地判斷鶴鴕的性別，鶴鴕目的條帶大小與 Huynen等[11]研究結(jié)果相符，具體大小有待測序。

3.4 樣本選擇

Jensen等[2]利用全血、卵黃囊和羽毛基因組DNA對47種鳥類進行了性別鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)羽毛中DNA量少，且電泳結(jié)果中有非特異性條帶混入。本次研究中直接采用羽毛毛囊作為模板，未經(jīng)過DNA提取與純化，減少了在 DNA提取過程中造成的損失，節(jié)約了時間和成本，提高了效率，且經(jīng)過反復(fù)試驗，與全血基因組提取的性別鑒定結(jié)果完全一致，這種簡單、快速且非損傷性取樣的性別鑒定檢測方法，為以生物保護為基礎(chǔ)的鳥類學(xué)研究提供了實用有效的選擇。為了提高PCR反應(yīng)的可重復(fù)性，減少交叉反應(yīng)的風(fēng)險，可在加樣過程中增加羽根的數(shù)量，不同樣本間做好采樣工具的消毒清潔工作。

綜上，本研究對動物園內(nèi)部分珍稀鳥類采用分子生物學(xué)手段進行了性別鑒定，準(zhǔn)確性高，樣品大多采用非損傷性取樣，不僅減少了對鳥類的應(yīng)激，而且簡化了操作流程，提高了工作效率，并在此基礎(chǔ)上針對一些新物種進行了性別鑒定的檢驗，為鳥類性別鑒定積累了更多的數(shù)據(jù)。然而鳥類種類繁多，考慮到鳥類的珍稀及采樣難易程度，本研究目前涉及到9目中26種鳥類，鸮形目、隼形目、佛法僧目等鳥類有待進一步研究。

致謝：本研究在采樣及檢測過程中得到了上海動物園獸醫(yī)院桂劍峰院長，陳曉蘭、陸旖旎等獸醫(yī)，以及鳥類飼養(yǎng)隊組黃康寧、張志浩等同事的大力支持，在此表示感謝。