朱向蕾

(上海動(dòng)物園，上海 200335)

性別是鳥(niǎo)類(lèi)最重要的特征之一，鳥(niǎo)類(lèi)的雌雄個(gè)體在生理、行為、生態(tài)等方面具有差別。鳥(niǎo)類(lèi)的性別鑒定，特別是性別的早期鑒定對(duì)鳥(niǎo)類(lèi)的飼養(yǎng)管理、繁殖與育種、遺傳疾病的防治、進(jìn)化生態(tài)學(xué)、種群結(jié)構(gòu)和群體遺傳分析等方面都有非常重要的意義，尤其是對(duì)瀕危珍稀鳥(niǎo)類(lèi)的保護(hù)研究和管理具有重要作用[1-4]。為了保護(hù)生態(tài)平衡，許多動(dòng)物園通過(guò)人工飼養(yǎng)繁育的方法來(lái)提高瀕危鳥(niǎo)類(lèi)的存活率和繁殖率，而動(dòng)物的繁殖育種均離不開(kāi)性別鑒定，合理的性別比例是動(dòng)物得以繁殖的必備條件之一。

全世界鳥(niǎo)類(lèi)中有超50%的鳥(niǎo)類(lèi)是雌雄同形的單態(tài)性鳥(niǎo)類(lèi)，這些鳥(niǎo)類(lèi)無(wú)論成幼均很難從外觀形態(tài)上來(lái)鑒別性別[5]。對(duì)單態(tài)性成鳥(niǎo)或雛鳥(niǎo)/亞成鳥(niǎo)的常規(guī)鑒定方法有：生殖器官形態(tài)學(xué)檢視、生理激素測(cè)定等，對(duì)鳥(niǎo)類(lèi)均造成一定的應(yīng)激或侵入式傷害，尤其是雛鳥(niǎo)、珍稀個(gè)體。因此，使用快速可靠安全的方法鑒別性別，對(duì)鳥(niǎo)類(lèi)保育研究工作的成功開(kāi)展尤為重要。

鳥(niǎo)類(lèi)性別鑒定有很多方法，可以從身體表面的明顯斑塊、個(gè)體的行為觀察、形態(tài)學(xué)特征的差異、解剖學(xué)或腹腔鏡檢查以及性染色體的檢查等方面進(jìn)行。傳統(tǒng)的性別鑒定方法有腹腔鏡檢查、翻肛鑒別、類(lèi)固醇鑒別、核型分析等[6]。腹腔鏡檢查需要麻醉，有一定風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)于瀕危野生動(dòng)物并不適宜；翻肛鑒別需要相當(dāng)豐富的經(jīng)驗(yàn)；利用排泄物進(jìn)行類(lèi)固醇鑒別耗時(shí)，準(zhǔn)確性低；核型分析獲得結(jié)果時(shí)間較長(zhǎng)，對(duì)于Z染色體和W染色體差異較小的鳥(niǎo)類(lèi)不適用。隨著時(shí)代的進(jìn)展，分子生物學(xué)飛速發(fā)展，性染色體的鑒定檢查趨于流行，染色體螺旋蛋白(CHD)基因?qū)儆诠δ苄曰?，十分保守，?個(gè)同源拷貝CHD-W和CHD-Z，在鳥(niǎo)類(lèi)性別鑒定中發(fā)揮著巨大作用[7]。

上海動(dòng)物園目前飼養(yǎng)有鳥(niǎo)類(lèi)19目42科180余種，超過(guò)70%的種類(lèi)為單態(tài)性鳥(niǎo)類(lèi)，近90%的個(gè)體性別信息尚不明確。自上世紀(jì)70年代起，該園一直開(kāi)展珍稀鳥(niǎo)類(lèi)的人工飼養(yǎng)繁育工作。胡瑞穎等[8]已經(jīng)對(duì)丹頂鶴、白枕鶴、東方白鶴等9種86只國(guó)家一級(jí)保護(hù)鳥(niǎo)類(lèi)進(jìn)行了性別鑒定，田秀華等[9]對(duì)7種鶴形目鳥(niǎo)類(lèi)進(jìn)行了性別鑒定，相關(guān)成果運(yùn)用于繁育實(shí)踐，為在更廣范圍內(nèi)進(jìn)一步開(kāi)展鳥(niǎo)類(lèi)性別的分子鑒定工作奠定了基礎(chǔ)。

本研究主要通過(guò)分子生物學(xué)手段在已有研究的基礎(chǔ)上對(duì)鳥(niǎo)類(lèi)的性別進(jìn)行快速準(zhǔn)確地鑒定，以便為動(dòng)物園中鳥(niǎo)類(lèi)群體的飼養(yǎng)管理和繁殖育種提供性別信息。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

采集上海動(dòng)物園內(nèi)正常飼養(yǎng)的部分鳥(niǎo)類(lèi)羽毛，包括斑嘴環(huán)企鵝、鵜鶘、鶴鴕、小天鵝、鞭笞鵎鵼、鶴鸛類(lèi)、鸚鵡類(lèi)等共涉及9目26種258只。采集樣品均為鳥(niǎo)類(lèi)胸部體毛，確保羽根完整，常溫干燥保存，或-80 ℃長(zhǎng)期保存。使用含EDTA抗凝管采集鳥(niǎo)翅根處血液，-20 ℃冷凍保存待用。

1.2 主要試劑

使用MiniBEST Whole Blood Genomic DNA Extraction Kit(Code No.9781)提取血液樣本組DNA，-20 ℃冷凍保存待用。MightyAmpTMDNA Polymerase Ver.3 Kit、HaeⅢ、6×Loading Buffer、50 bp DNA Ladder均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)

參考文獻(xiàn)[10-11]設(shè)計(jì)引物，3對(duì)引物序列如下：P2(5′-TCTGCATCGCTAAATCCTTT-3′)、P8(5′-CTCCCAAGGATGAGRAAYTG-3′)；2550 F(5′-GTTACTGATTCGTCTACGAGA-3′) 、 2718R (5′-ATTGAAATGATCCAGTGCTTG-3′)[10]；K7(5′-AGGGTGTCTAGAACAAAAGAGA-3′)、W1(5′-CCTTTAAACAAGCTGTTAAAGCA-3′)[11]，引物由英濰捷基公司合成。

1.4 PCR反應(yīng)與酶切反應(yīng)

PCR反應(yīng)體系為20 μL，其中：MightyAmp DNA Polymerase 0.4 μL，2×MightyAmp Buffer 10 μL，引物各0.6 μL，其中血液樣本DNA 2 μL或剪取1 mm長(zhǎng)2～3段羽根，補(bǔ)充ddH2O至20 μL。P2/P8、2550F/2718R退火溫度為48 ℃，K7/W1采用55 ℃、50 ℃、47 ℃溫度降落式PCR，反應(yīng)在PCR儀上進(jìn)行。1.5%～2.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，產(chǎn)物由寶生物工程(大連)有限公司進(jìn)行克隆測(cè)序。酶切體系為：HaeⅢ 0.5 μL，10×M Buffer 1 μL，PCR產(chǎn)物8.5 μL。37 ℃水浴過(guò)夜(16～20 h)[12]。酶切后產(chǎn)物經(jīng)1.5%～2.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 羽根樣品及PCR方法的有效性驗(yàn)證

以已知性別的火烈鳥(niǎo)和美洲紅鹮為例，分別以血液抽屜的DNA和羽根樣本作為模板，2550F/2718R為引物，擴(kuò)增CHD基因片段，驗(yàn)證以羽根樣品直接PCR檢測(cè)的有效性和可靠性。

產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳，結(jié)果顯示2種鳥(niǎo)類(lèi)的雄性均擴(kuò)增出1條條帶，經(jīng)克隆測(cè)序與NCBI GenBank序列比對(duì)，大小為663 bp；雌性均擴(kuò)增出2條條帶，大小分別為663 和460 bp。兩物種血液組DNA與羽根樣本擴(kuò)增結(jié)果一致，性別鑒定結(jié)果準(zhǔn)確。從圖1觀察，以未經(jīng)提取純化的羽根為模板的PCR產(chǎn)物，條帶清晰度和產(chǎn)物濃度與血液組DNA相比，無(wú)明顯差異，也無(wú)明顯非特異性擴(kuò)增，可用于性別鑒定(圖1)。

1、5. 火烈鳥(niǎo)羽毛毛囊；2、6. 美洲紅鹮羽毛毛囊；3、7. 火烈鳥(niǎo)全血基因組DNA；4、8. 美洲紅鹮全血基因組DNA；M. Marker

2.2 白鵜鶘和斑嘴環(huán)企鵝的性別鑒定

利用P2/P8引物對(duì)白鵜鶘進(jìn)行性別鑒定，鑒定結(jié)果如圖2所示。HaeⅢ酶切后雄性可出現(xiàn)1條條帶，經(jīng)克隆測(cè)序與NCBI GenBank序列比對(duì)，大小為321 bp;雌性為2條條帶，大小分別為321和234 bp(圖2)。

利用P2/P8引物對(duì)斑嘴環(huán)企鵝進(jìn)行性別鑒定，單純進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，每個(gè)樣品均擴(kuò)增出1條條帶，經(jīng)克隆測(cè)序與NCBI GenBank序列比對(duì)，大小367 bp，難以判斷性別。經(jīng)HaeⅢ酶切后雄性可看到2條條帶，其中明顯的一條為302 bp，最下面1條條帶較淡，未測(cè)序，大小在50～100 bp;雌性為3條條帶，多了1條大小為367 bp的條帶(圖3)。

1、3、5、7、9. P2/P8引物擴(kuò)增；2、4、6、8、10. 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)HaeⅢ酶切；M.Marker

1、3、5、7、9. P2/P8引物擴(kuò)增；2、4、6、8、10.擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)HaeⅢ酶切；M.Marker

2.3 鶴鴕的性別鑒定

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后結(jié)果如圖4，所有樣品均擴(kuò)增出1條大小約350 bp的條帶，而雌性除了350 bp大小的條帶外，多擴(kuò)增1條約150 bp的條帶。

1～4. 用K7/W1引物擴(kuò)增；M.Marker

2.4 檢驗(yàn)樣品及引物匯總

通過(guò)PCR方法對(duì)上海動(dòng)物園中9目26種258只鳥(niǎo)類(lèi)進(jìn)行了性別鑒定，其中：鸚形目、鸛形目、鶴形目及鴷形目鳥(niǎo)類(lèi)應(yīng)用2550F/2718R引物，企鵝目及鵜鶘目應(yīng)用P2/P8引物，鴕形目及鶴鴕目的非平胸類(lèi)鳥(niǎo)類(lèi)應(yīng)用K7/W1引物，雁形目鳥(niǎo)類(lèi)的引物選擇根據(jù)種屬的不同選擇了不同的引物。試驗(yàn)過(guò)程中檢驗(yàn)樣品及引物匯總見(jiàn)表1。

表1 珍稀鳥(niǎo)類(lèi)性別鑒定物種及其引物匯總

3 討論

有研究嘗試應(yīng)用鳥(niǎo)類(lèi)外部形態(tài)進(jìn)行性別鑒定，如體重和尾長(zhǎng)[15]、羽毛和大小[16]、性別特定行為和鳥(niǎo)喙長(zhǎng)度[17]。與傳統(tǒng)方法相比，分子生物學(xué)手段鑒定鳥(niǎo)類(lèi)性別取樣量小、準(zhǔn)確率高、迅速、鳥(niǎo)類(lèi)應(yīng)激反應(yīng)小，是開(kāi)展鳥(niǎo)類(lèi)飼養(yǎng)繁育、生態(tài)學(xué)、形態(tài)學(xué)等領(lǐng)域研究的基礎(chǔ)技術(shù)。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，利用DNA進(jìn)行性別鑒定被廣泛應(yīng)用，血液和羽毛均可作為樣本來(lái)源進(jìn)行鑒定，為了減少對(duì)鳥(niǎo)類(lèi)的損傷，采集羽毛可以降低鳥(niǎo)類(lèi)的應(yīng)激反應(yīng)，避免了過(guò)度失血。動(dòng)物園飼養(yǎng)的鳥(niǎo)類(lèi)大多屬于群養(yǎng)，如果有足夠的籠舍可進(jìn)行完善的隔離，非損傷性取樣將會(huì)是最佳的取樣方式。采集羽毛簡(jiǎn)便易行且對(duì)研究對(duì)象幾乎無(wú)傷害，使其在對(duì)鳥(niǎo)類(lèi)性別的分子生物學(xué)鑒定和保護(hù)遺傳學(xué)研究領(lǐng)域中得到廣泛的應(yīng)用[18-19]。

3.1 火烈鳥(niǎo)

李文斌等[20]運(yùn)用2550F/2718R這對(duì)引物對(duì)火烈鳥(niǎo)進(jìn)行了性別鑒定，目的條帶分別為800 bp和600 bp左右；陳蓉等[14]也應(yīng)用這對(duì)引物進(jìn)行了火烈鳥(niǎo)的性別鑒定，目的條帶大小分別在750～500 bp，500～250 bp；本文的目的條帶經(jīng)測(cè)序后是663 bp和460 bp，與陳蓉等[14]的結(jié)果一致，但與李文斌等[20]結(jié)果略有差異，可能與退火溫度有關(guān)，但并不影響結(jié)果判定。

3.2 企鵝

Zhang等[21]對(duì)帝王企鵝(Aptenodytespatagonicus)，鳳冠企鵝(Eudypteschrysocome)，金頭企鵝(Pygoscelispapua)和麥哲倫企鵝(Spheniscusmagellanicus)4種企鵝應(yīng)用(2550F/2718R和P2/P8)2對(duì)引物進(jìn)行了性別鑒定，結(jié)果2對(duì)引物并不適用于所有的企鵝。沈瑋等[22]應(yīng)用P2/P8引物對(duì)南京海底世界的6只帝企鵝進(jìn)行了性別鑒定，但是由于CHD-Z和CHD-W的大小相近，瓊脂糖凝膠電泳均顯現(xiàn)出1條條帶，給性別鑒定帶來(lái)了一定困難。Costantini等[12]應(yīng)用P2/P8引物對(duì)洪堡企鵝(Spheniscushumboldti)進(jìn)行了性別鑒定，3項(xiàng)研究中都沒(méi)有涉及到斑嘴環(huán)企鵝。本研究在洪堡企鵝研究的基礎(chǔ)上應(yīng)用P2/P8引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增后均顯示1條條帶，原因在于雌雄條帶相差較小，難以區(qū)分?？紤]到企鵝種間的相近性后續(xù)依舊用HaeⅢ進(jìn)行了酶切，酶切后雌性可出現(xiàn)3條條帶(367、 302 和 50～100 bp)，不同于洪堡企鵝(380、310和60 bp)；雄性表現(xiàn)為2條條帶(302 和50～100 bp)，不同于洪堡企鵝(310和60 bp)。條帶大小不同顯示了物種間的差異性，但可以準(zhǔn)確地進(jìn)行性別判定，經(jīng)一定數(shù)量的酶切反應(yīng)試驗(yàn)，以更好地進(jìn)行性別的判定。袁夢(mèng)[23]應(yīng)用引物P2/P8對(duì)鵜鶘性別進(jìn)行鑒定，經(jīng)酶切結(jié)果為雄性個(gè)體擴(kuò)增出1條條帶，大小為550 bp，雌性個(gè)體為2條條帶，大小分別為550和490 bp，與本文結(jié)果有差異。分析可能本研究所用樣品為白鵜鶘，可能是鵜鶘種間差異，亦或是退火溫度的影響，具體原因有待進(jìn)一步研究。

3.3 鶴鴕

非平胸目鳥(niǎo)類(lèi)的性別鑒定引物無(wú)法用于平胸目鳥(niǎo)類(lèi)性別的鑒定，Bello等[24]利用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA法(RAPD)進(jìn)行鴕鳥(niǎo)的性別鑒定，付晶等[25]建立了鴯鹋性別鑒定的分子標(biāo)記方法，Huynen等[11]采用RAPD進(jìn)行性別特異性標(biāo)記，利用引物K1、K2、K3、K4對(duì)鴯鹋、鴕鳥(niǎo)等平胸目鳥(niǎo)類(lèi)進(jìn)行性別鑒定，但有時(shí)無(wú)法擴(kuò)增雄性基因片段；進(jìn)一步設(shè)計(jì)了W1和K7引物，該引物雌雄大小差異較大，對(duì)鴕鳥(niǎo)、鴯鹋的性別分析更為準(zhǔn)確，但沒(méi)有涉及到鶴鴕。本研究在此基礎(chǔ)上改變了部分反應(yīng)條件，縮短了變性和退火時(shí)間，降低了延伸的溫度，所得結(jié)果可以準(zhǔn)確有效地判斷鶴鴕的性別，鶴鴕目的條帶大小與 Huynen等[11]研究結(jié)果相符，具體大小有待測(cè)序。

3.4 樣本選擇

Jensen等[2]利用全血、卵黃囊和羽毛基因組DNA對(duì)47種鳥(niǎo)類(lèi)進(jìn)行了性別鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)羽毛中DNA量少，且電泳結(jié)果中有非特異性條帶混入。本次研究中直接采用羽毛毛囊作為模板，未經(jīng)過(guò)DNA提取與純化，減少了在 DNA提取過(guò)程中造成的損失，節(jié)約了時(shí)間和成本，提高了效率，且經(jīng)過(guò)反復(fù)試驗(yàn)，與全血基因組提取的性別鑒定結(jié)果完全一致，這種簡(jiǎn)單、快速且非損傷性取樣的性別鑒定檢測(cè)方法，為以生物保護(hù)為基礎(chǔ)的鳥(niǎo)類(lèi)學(xué)研究提供了實(shí)用有效的選擇。為了提高PCR反應(yīng)的可重復(fù)性，減少交叉反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，可在加樣過(guò)程中增加羽根的數(shù)量，不同樣本間做好采樣工具的消毒清潔工作。

綜上，本研究對(duì)動(dòng)物園內(nèi)部分珍稀鳥(niǎo)類(lèi)采用分子生物學(xué)手段進(jìn)行了性別鑒定，準(zhǔn)確性高，樣品大多采用非損傷性取樣，不僅減少了對(duì)鳥(niǎo)類(lèi)的應(yīng)激，而且簡(jiǎn)化了操作流程，提高了工作效率，并在此基礎(chǔ)上針對(duì)一些新物種進(jìn)行了性別鑒定的檢驗(yàn)，為鳥(niǎo)類(lèi)性別鑒定積累了更多的數(shù)據(jù)。然而鳥(niǎo)類(lèi)種類(lèi)繁多，考慮到鳥(niǎo)類(lèi)的珍稀及采樣難易程度，本研究目前涉及到9目中26種鳥(niǎo)類(lèi)，鸮形目、隼形目、佛法僧目等鳥(niǎo)類(lèi)有待進(jìn)一步研究。

致謝：本研究在采樣及檢測(cè)過(guò)程中得到了上海動(dòng)物園獸醫(yī)院桂劍峰院長(zhǎng)，陳曉蘭、陸旖旎等獸醫(yī)，以及鳥(niǎo)類(lèi)飼養(yǎng)隊(duì)組黃康寧、張志浩等同事的大力支持，在此表示感謝。