徐艷飛，裴云逸，李本發(fā)，李康銀，徐冬梅

(1.玉溪農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，云南 玉溪 653106;2.昆明市第二十四中學(xué)，云南 昆明 650101)

露水草(Cyanotis arachnoidea C.B.Clark) 又名珍珠露水草、換肺散、雞冠參等，為鴨趾草科(Commelinaceae) 藍(lán)耳草屬(Cynanotis D Don)多年生宿根性草本，分布于中國(guó)、印度、斯里蘭卡及中南半島。我國(guó)主要分布于云南、貴州、廣西、廣東、福建、臺(tái)灣等省( 區(qū)) 海拔1 100～ 1 700 m 的山溝、山坡林緣或林中[1]。露水草以根入藥，夏秋采收(洗凈，鮮用或曬干)。其味甘、性平，具有舒筋活絡(luò)、補(bǔ)虛除濕、退虛熱、通經(jīng)、止痛等功效。露水草可用于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、四肢麻木等癥狀，能促進(jìn)蠶、蝦、蟹生產(chǎn)脫皮等，具有降低人體內(nèi)膽固醇、降低血糖濃度等功效。昆明植物研究所聶瑞麟先生發(fā)現(xiàn)，迄今為止，露水草是自然界中含植物甾酮類成分最豐富的藥用植物之一[2]。其提取物中的β-蛻皮激素具有很多良好的藥理活性。β-蛻皮激素(β-ecdysone)又稱β-蛻皮甾酮或者20-羥基蛻皮甾酮(20-Hydroxy ecdysterone)，是一種昆蟲的變態(tài)激素，可用于防治害蟲及提高蝦蟹產(chǎn)量[3]，化學(xué)式為 C27H44O7[4]。研究表明，β-蛻皮激素能促進(jìn)核酸和蛋白質(zhì)的合成[5]，影響糖代謝和脂類代謝[6]，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫[7]，提高乙酰膽堿酯酶的活性[8]等。廣泛用于養(yǎng)殖、保健、化妝品、醫(yī)藥行業(yè)等。

目前，對(duì)β-脫皮激素的研究大多數(shù)集中在以下幾個(gè)方面，一是提取工藝研究。有恒溫提取、超聲提取、震蕩提取等。二是含量測(cè)定。三是蛻皮激素的生物活性及藥理研究。本實(shí)驗(yàn)以蒸餾水為提取劑，采用恒溫水提、超聲水提和微波水提，結(jié)合HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定露水草提取物中β-脫皮激素的含量，比較恒溫水提、超聲水提和微波水提的提取效果，以便工業(yè)生產(chǎn)參考。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

露水草(產(chǎn)自云南省紅河州石屏縣龍武鎮(zhèn)，由石屏興興生物有限責(zé)任公司提供)，β-蛻皮激素標(biāo)準(zhǔn)品(Purity HPLC：99.9%，上海安譜試驗(yàn)科技股份有限公司)，甲醇(色譜純)，乙腈(色譜純)，95%乙醇(分析純)，屈臣氏蒸餾水，純化水(玉溪農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室自制)。

1.2 儀器設(shè)備

高效液相色譜分析儀(島津LC-10AT/SPD10A)；色譜工作站(LabSolutions LCsolution)，紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(UV-2550)；超聲波清洗器(KQ5200E)；微波爐(MZ-68ES)；電子天平(BT2202S，北京賽多利斯儀器有限公司) ；離心機(jī)(LD5-2A)；超微濾膜(津騰50×0.22 μm)；家用多功能料理機(jī)(CX-301，中山市九陽(yáng)小家電有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

將2019年1月采收自云南省紅河州石屏縣龍武鎮(zhèn)人工栽培的新鮮露水草植物根洗凈，陽(yáng)光暴曬數(shù)天至干燥，用破壁機(jī)(料理機(jī))打粉，備用。

1.3.2 樣品提取方法

咨詢生產(chǎn)企業(yè)水煮法提取經(jīng)驗(yàn)(1噸粉狀露水草在 80 ℃ 左右的儲(chǔ)罐中加水煮 3 h，放出提取液冷卻，再加水煮 2 h，合并提取液，再分離純化得β-蛻皮激素粗品)，并結(jié)合文獻(xiàn)推測(cè)。本實(shí)驗(yàn)采用80 ℃恒溫水浴提取，超聲水提和微波水提取三種方法，并考察采用何種方法提取效果更好。

1.3.3 最大吸收波長(zhǎng)的確定

取β-蛻皮激素標(biāo)準(zhǔn)品1支(20 mg/支)，用95%乙醇溶解并用純化水定容至 20 mL 得質(zhì)量濃度為 1 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品貯備液。取上述貯備液用純化水稀釋配制成質(zhì)量濃度為 0.2 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。以95%乙醇為對(duì)照，用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行光譜掃描。對(duì)露水草提取液同法試驗(yàn)，確定最大吸收波長(zhǎng)為 243 nm。

1.3.4 流動(dòng)相的確定

預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)標(biāo)準(zhǔn)品的處理：取1.3.3所得的質(zhì)量濃度為 1 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品貯備液,稀釋到 0.2 mg/mL 用針孔濾膜(0.22 μm)過(guò)濾得到標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)樣品溶液的處理：準(zhǔn)確稱取 0.2057 g 露水草粉末，置于 250 mL 燒杯中，加 50 mL 純化水，超聲提取 20 min，離心 20 min，取上層清液定容至 100 mL。取一定量用針孔濾膜(0.22 μm)過(guò)濾的質(zhì)量濃度為 0.2057 mg/mL 的樣品溶液。

將上述得到的標(biāo)準(zhǔn)品溶液和樣品溶液分別在檢測(cè)波長(zhǎng)為 243 nm，流動(dòng)相分別為乙腈-水、甲醇-水、乙腈-甲醇-水，在不同體積比條件下進(jìn)樣檢測(cè)。通過(guò)對(duì)比分離效果、保留時(shí)間、色譜峰峰形及峰面積，發(fā)現(xiàn)乙腈-水為70∶30時(shí)(體積比，下同)，分離效果好，但保留時(shí)間稍長(zhǎng)；甲醇-水為40∶60時(shí)，分離效果好，保留時(shí)間也稍長(zhǎng)；乙腈-甲醇-水體積比為1∶2∶4時(shí)，分離效果差；乙腈-甲醇-水體積比為1∶3∶4時(shí)(A泵：乙腈-水1∶4；B泵：甲醇)，保留時(shí)間短，分離效果較好，峰形較好，峰面積較穩(wěn)定。所以確定后期實(shí)驗(yàn)以乙腈-甲醇-水體積比1∶3∶4為流動(dòng)相。

1.3.5 色譜條件

色譜柱：Agilent Extend-C18 ODS柱(4.6 mm×150 mm，粒徑 5 μm) ；柱溫 30 ℃；流動(dòng)相為乙腈-甲醇-水(1∶3∶4)；流速 1.0 mL/min；進(jìn)樣量 10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng) 243 nm。在此色譜條件下，0.2 mg/mL β-蛻皮激素標(biāo)準(zhǔn)品 3.320 min 出峰(圖1)，0.2057 mg/mL 露水草提取液樣品在 3.330 min 處有最大峰(圖2)。

圖1 β-蛻皮激素標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖(0.2 mg/mL)

圖2 露水草提取液樣品色譜圖(0.2057 mg/mL)

1.4 溶液的配制

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液

取β-蛻皮激素標(biāo)準(zhǔn)品1支(20 mg/支)，用95%乙醇溶解并用純化水定容至 20 mL 得質(zhì)量濃度為 1 mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)品貯備液。取標(biāo)準(zhǔn)貯備液用純化水稀釋配制為0.10,0.15，0.20，0.25，0.30 mg/mL 的β-蛻皮激素標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，用針孔濾膜(0.22 μm)濾過(guò)備用。

1.4.2 樣品溶液

1)恒溫(80 ℃)水浴提取樣品溶液

精密稱取露水草粉末樣品 0.221 1 g、0.316 2 g、0.548 8 g，分別置于三個(gè) 250 mL 燒杯中，各加入 50 mL 純化水。置于 80 ℃ 恒溫水浴加熱時(shí)間 50 min ，取出冷卻至室溫，設(shè)置離心機(jī)(LD5-2A)轉(zhuǎn)速為 5 000 r/min，離心 20 min，取上層清液用純化水定容至 100 mL。用針孔濾膜(0.22 μm)過(guò)濾得質(zhì)量濃度為 2.211 mg/mL， 3.162 mg/ mL， 5.488 mg/mL 的三份供試品溶液，置于液相色譜進(jìn)樣瓶待測(cè)。

2)超聲提取樣品溶液

精密稱取露水草粉末樣品 0.205 7 g，0.319 8 g，0.411 3 g 置于三個(gè) 250 mL 燒杯中，加 50 mL 純化水。室溫超聲提取 20 min，離心 20 min，取上層清液定容至 100 mL。取一定量用針孔濾膜(0.22 μm)過(guò)濾得質(zhì)量濃度為 2.057 mg/mL, 3.198 mg/mL,4.113 mg/mL 的三份供試品溶液，置于液相色譜進(jìn)樣瓶待測(cè)。

3)微波提取樣品溶液

精密稱取露水草粉末樣品 0.206 6 g，0.320 9 g，0.412 9 g 置于三個(gè) 500 mL 高燒杯中，加 50 mL 純化水。微波提取1 min，冷卻離心20 min，取上層清液定容至100 mL。取一定量用針孔濾膜(0.22 μm)過(guò)濾得質(zhì)量濃度為2.066 mg/mL，3.209 mg/ mL，4.129 mg/mL的三份供試品溶液，置于液相色譜進(jìn)樣瓶待測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 水煮法提取時(shí)間

精密稱取0.534 6 、0.539 4 、0.541 7 、0.549 8 、0.548 8 、0.541 5 、0.549 0 g 露水草粉末樣品，分別置于7個(gè)250 mL燒杯中，各加入50 mL純化水。置于80 ℃恒溫水浴加熱，時(shí)間分別為：10、20、30、40、50、60、70 min。取出冷卻至室溫，用5 000 r/min，離心20 min，取上層清液用純化水定容至100 mL。用針孔濾膜(0.22 μm)過(guò)濾得樣品溶液，每份進(jìn)樣3針，結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1看出，加熱50～60 min，峰面積最大，60 min后下降。由此得出，加熱時(shí)間控制在50～60 min，提取效果較好。

表1 80℃恒溫水浴提取測(cè)定結(jié)果

2.2 重復(fù)性試驗(yàn)

取上述恒溫(80 ℃)水浴提取50 min所得溶液5份(5.488 mg/mL)，按上述色譜條件測(cè)定，每份進(jìn)樣3針。結(jié)果β-蛻皮激素的峰面積無(wú)明顯差異，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值為0.62%(<2%)，表明該方法重復(fù)性良好。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 水提樣(5.488 mg/mL)峰面積測(cè)定結(jié)果

2.3 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

精密稱取5.018 0 g露水草粉末，加50 mL蒸餾水，80 ℃恒溫水浴加熱55 min，冷卻離心取上層清液定容至250 mL。精密移取50 mL上述樣品溶液4份(每份含供試品1.0036 g)定容至200 mL，分別加入1 mg/mL的標(biāo)品溶液0 、1、2、3 mL。用針孔濾膜(0.22 μm)過(guò)濾，按上述色譜條件測(cè)得回收率介于100.00%～103.00%，RSD值為1.48%(<2%)，表明回收率良好，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 加標(biāo)回收率測(cè)定結(jié)果

2.4 標(biāo)準(zhǔn)品線性范圍的確定

將1.4.1得到的質(zhì)量濃度為0.10，0.15，0.20，0.25，0.30 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，與1.3.4中得到的2.057 mg/mL樣品溶液在上述色譜條件下，每份進(jìn)樣3針，求平均峰面積。結(jié)果見(jiàn)表4。以峰面積A為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度ρ(mg/mL)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。如圖3。β-蛻皮激素標(biāo)準(zhǔn)溶液在0.10～0.30 mg/mL 范圍內(nèi)，峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系。所得回歸方程為A=12 703 408.666 7ρ+141 220.533 3，r2=0.999 5。

表4 標(biāo)準(zhǔn)品峰面積測(cè)定結(jié)果

圖3 β-蛻皮激素0.10～0.30 mg/mL系列標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5 儀器精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取0.2 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣5次，由峰面積計(jì)算RSD值為0.55%(<2%)(表5)。因此，本試驗(yàn)的的精密度滿足實(shí)驗(yàn)要求。

表5 0.2 mg/mL蛻皮激素標(biāo)準(zhǔn)品峰面積測(cè)定結(jié)果

3 樣品測(cè)定

取1.4.2 節(jié)1) 項(xiàng)中的恒溫(80℃)水浴提取樣品溶液3份，按上述色譜條件測(cè)定。計(jì)算含量(本品含量按干燥品計(jì)算)，結(jié)果如表6。

表6 恒溫(80 ℃)水提取樣品含量測(cè)定結(jié)果

取1.4.2 節(jié)2) 項(xiàng)中超聲水提所得樣品溶液3份，按上述色譜條件測(cè)定。計(jì)算含量(本品含量按干燥品計(jì)算)，結(jié)果如表7。

表7 超聲提取樣品含量測(cè)定結(jié)果

取1.4.2 節(jié)3) 項(xiàng)中微波水提所得所得樣品溶液3份，按上述色譜條件測(cè)定。計(jì)算含量(本品含量按干燥品計(jì)算)，結(jié)果如表8。

表8 微波提取樣品含量測(cè)定結(jié)果

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用露水草根部為原料，蒸餾水作提取劑，采用恒溫(80℃)水浴提取、超聲提取和微波提取，結(jié)合HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定露水草根部提取物中β-脫皮激素的含量。恒溫(80℃)水浴提取測(cè)得露水草中β-脫皮激素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.73%，超聲提測(cè)得露水草中β-脫皮激素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.17%，微波提測(cè)得露水草中β-脫皮激素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.02%。可見(jiàn)，微波水提優(yōu)于恒溫水提和超聲水提。微波水提效果好，工藝簡(jiǎn)單，節(jié)能，生產(chǎn)效率高，可供工業(yè)生產(chǎn)參考。