王 喆 綜述 姜埃利 審校

急性腎損傷(AKI)是以腎功能的迅速惡化為特征的臨床常見疾病。10%～15%住院患者存在AKI，重癥監(jiān)護室中AKI的患病率超過50%[1]。持續(xù)惡化的AKI增加住院率、慢性腎臟病(CKD)、終末期腎病(ESRD)及死亡風險，同時AKI增加卒中、心血管疾病、上消化道出血等風險，嚴重影響患者的生活質(zhì)量[2]。因此，需要可靠的生物學標志物早期診斷AKI，早期治療，進而減輕腎臟損傷。此外，腎臟組織具有一定的修復能力，需要深入了解相關(guān)機制，采用新的治療方法促進腎臟功能的恢復，改善患者預后。Klotho主要來源于腎臟，以往研究多關(guān)注Klotho對慢性腎臟病礦物質(zhì)和骨異常的調(diào)節(jié)作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)，Klotho在AKI早期呈現(xiàn)特征性變化，診斷AKI的敏感性和特異性優(yōu)于傳統(tǒng)標記物，可能成為AKI早期診斷的新型生物學標記物。同時，體內(nèi)和體外研究均發(fā)現(xiàn)Klotho在不同病因?qū)е碌腁KI中均存在腎保護作用，可能成為AKI治療的新靶點。本文綜述Klotho在AKI診斷和治療中的研究進展。

Klotho的來源和生物學作用

Klotho發(fā)現(xiàn)于1997年，是一種抗衰老基因，位于染色體13q12。Klotho主要表達于腎遠曲小管，其次是近曲小管，也表達于腦、胰腺、甲狀旁腺等器官。Klotho有膜型和分泌型兩種形式。膜型Klotho是其基因編碼的130 kD單次跨膜蛋白。蛋白酶可以裂解Klotho的部分細胞外結(jié)構(gòu)域，產(chǎn)生分泌型Klotho。分泌型Klotho也來自于可變剪接。分泌型Klotho釋放到血液循環(huán)成為可溶性Klotho。可溶性Klotho作用于骨骼、腦、心臟、肺、內(nèi)皮細胞等多種遠端器官。Klotho可以結(jié)合成纖維細胞生長因子(FGF)受體1，增加FGF23與其受體的親和力，抑制腎臟對磷的重吸收，促進尿磷排泄。Klotho直接促進腎近曲小管鈉磷協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白的內(nèi)化和降解，增加尿磷排泄。Klotho還具有多種生物學作用：抗氧化應激、抗衰老、抗凋亡，以及上調(diào)自噬[3]。

對AKI的診斷價值

現(xiàn)有診斷AKI的血、尿生物標志物血清肌酐(SCr)是診斷AKI常用的生物標記物，但是它受年齡、性別、肌肉含量、飲食情況、藥物、殘余腎功能等因素影響，診斷AKI的敏感度和特異度均較低[1]。目前文獻報道的AKI早期診斷的生物標記物包括：中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白(NGAL)、腎損傷分子1(KIM-1)和白細胞介素18(IL-18)[4]。大型前瞻性多中心研究發(fā)現(xiàn)，血漿NGAL、尿液NGAL、尿液KIM-1和尿液IL-18診斷AKI的ROC曲線下面積均<0.77[5-6]。因此，我們亟需可靠的生物標記物對AKI進行早期診斷和評估預后。

血漿和腎臟Klotho在AKI早期診斷的應用多項研究分析了Klotho在不同病因AKI的表達情況，并探討Klotho對AKI的診斷價值(表1)。Hu等[7]建立小鼠的腎缺血再灌注損傷(IRI)的AKI模型。術(shù)后第1天和第2天，腎臟Klotho蛋白質(zhì)和mRNA均降低。術(shù)后第7天，腎臟、血漿、尿液Klotho水平與陰性對照組接近。血漿和腎臟Klotho水平在IRI后1h升高，3h后迅速降低。血漿和腎臟NGAL水平在IRI后5h才開始升高。因此，Klotho可能是腎損傷的最早期的生物標記物。王順等[8]將重癥監(jiān)護病房的患者分為AKI組和非AKI組，AKI組患者基線血清Klotho水平低于非AKI組。血清Klotho早期診斷AKI 的曲線下面積為0.945，臨界值為1.76 μg/L，敏感性92%，特異性94%，其敏感性高于NGAL，特異性相近。Seo等[9]分析不同病因AKI患者的腎臟Klotho水平，其與SCr水平呈負相關(guān)，組織學檢查顯示Klotho低值組腎損傷較重。Liu等[10]觀察了心臟瓣膜置換術(shù)后的AKI患者，術(shù)后0h血清Klotho預測AKI的ROC曲線下面積為0.806，臨界值是119.145 U/L，敏感度和特異度分別為0.895、0.572。SCr和胱抑素C診斷AKI的ROC曲線下面積分別為0.875和0.742。Klotho診斷AKI的特異度及敏感度均高于SCr，敏感度高于NGAL。Seibert等[11]研究結(jié)果不同于以往研究，人體非手術(shù)相關(guān)AKI中，急性腎損傷網(wǎng)絡(AKIN)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級的血Klotho分別為485.3 pg/ml、432 pg/ml、748.4 pg/ml，AKIN分級越高、估算的腎小球濾過率(eGFR)越低，血清Klotho越高。可能該研究沒有在腎損傷早期檢測Klotho，錯過了血清Klotho的下降期，但是在臨床工作中，很難確定非手術(shù)相關(guān)腎損傷的檢測截點。AKI病因差異也可能影響Klotho表達。尿液中Klotho能預測AKI，Qian等[12]評價了尿液Klotho對心臟術(shù)后AKI的預測作用，AKI患者術(shù)后0h尿液Klotho高于非AKI患者。尿液Klotho診斷AKI的曲線下面積為0.86，臨界值是0.86 ng/μmol，敏感度93.9%，特異度75.9%。AKI 2期和3期患者尿液Klotho水平高于1期。AKI 2期和3期患者尿液Klotho持續(xù)升高7d。腎功能未恢復的患者尿液Klotho高于腎功能完全恢復的患者。Klotho蛋白表達于刷狀緣的頂端，AKI中近曲小管上皮細胞刷狀緣被破壞消失，這可能導致AKI早期尿液Klotho急劇升高。隨著AKI的進展，腎小管上皮細胞壞死和脫落，Klotho隨之脫落，導致AKI中尿液Klotho的持續(xù)升高，尿液Klotho增加可能提示腎小管損傷的嚴重程度。因此，尿液Klotho可能成為早期診斷AKI的生物標記物，并且預測心臟術(shù)后短期腎功能。但是該研究結(jié)果與Hu等[7]的研究矛盾。Hu等[7]發(fā)現(xiàn)AKI患者尿液Klotho低于健康對照組。研究結(jié)果的差異可能是尿液標本預處理和采集時間不同。尿液中的Klotho不穩(wěn)定，反復凍融會降低Klotho的濃度[13]。AKI患者尿液Klotho持續(xù)升高7d，采集時間過晚會導致結(jié)果差異。此外，AKI病因不同也可能影響研究結(jié)果，Qian等[11]研究對象是心臟術(shù)后AKI患者，而Hu的研究中AKI病因包括膿毒癥、高血壓、慢性腎臟病、腎毒性藥物相關(guān)的腎損傷等。不同的檢測方法、樣本量較少也會造成結(jié)果差異。

表1 Klotho在AKI中的變化特點和診斷價值

尿液Klotho鑒別腎性AKI和腎前性AKI Kim等[14]認為尿液Klotho水平可能有助于鑒別腎性和腎前性AKI。腎性AKI組的尿液Klotho顯著高于腎前性AKI組。腎前性AKI組的腎組織接近正常，或輕度刷狀緣脫落。腎性AKI組刷狀緣明顯脫落，大量腎小管顯著擴張，細胞核消失，間質(zhì)炎癥滲出。腎性AKI組的組織損傷指數(shù)顯著高于腎前性AKI組。腎前性AKI組的腎臟Klotho表達明顯低于腎性AKI組。

腎保護作用的機制以及潛在治療靶點

Klotho在不同病因?qū)е碌腁KI中均表現(xiàn)腎保護作用，維持腎臟組織形態(tài)和結(jié)構(gòu)，通過抗炎、抗氧化應激、抗凋亡等作用改善腎功能，可能是AKI治療的新靶點(表2)。

表2 Klotho在AKI中腎保護作用的機制以及潛在治療靶點

缺血再灌注損傷腎臟缺血再灌注損傷包括腎臟缺血性損傷和再灌注損傷，氧自由基形成，內(nèi)皮細胞損傷，血管滲透性增加，中性粒細胞、血小板、細胞因子和補體系統(tǒng)活化，造成急性腎損傷(圖1A)，多見于腎移植、心臟手術(shù)、膿毒癥等[15]。氧自由基引發(fā)腎小管上皮細胞的程序性壞死，參與腎缺血再灌注損傷的病理生理過程。在IRI導致AKI的動物模型中，腎小管細胞出現(xiàn)細胞程序性壞死，伴隨氧化應激反應，血清和腎臟Klotho降低，尿液Klotho升高，Klotho治療可以降低細胞程序性壞死的標志物[受體相互作用蛋白激酶3(RIP3)、IL-1β和TUNEL陽性細胞]。Klotho降低8羥基脫氧鳥苷(u-8-OHdG)、腎臟的丙二醛(MDA)和3-硝基酪氨酸，增加超氧化物歧化酶(SOD)和含錳的超氧化物歧化酶(SOD2)。提示Klotho具有抗氧化應激作用，并抑制腎小管細胞的程序性壞死[17]。我國的一項研究中，Klotho 治療組SCr和尿素氮低于對照組，血清一氧化氮(NO)升高，腎組織過氧化物酶含量減少， SOD增多，推測Klotho 腎保護作用與其抗氧化作用相關(guān)，也可能通過增加NO含量擴張腎臟血管及改善腎臟血供[17]，Klotho激活叉頭轉(zhuǎn)錄因子(FOXO)，F(xiàn)OXO激活促進多種抗氧化基因的表達，包括過氧化氫酶、SOD2，發(fā)揮抗氧化作用[18](圖1A)。

圖1 A:IRI導致AKI的機制;B:Klotho在AKI中的腎保護作用[26]IRI:腎缺血再灌注損傷；AKI：急性腎損傷；NO：一氧化氮；FOXO：叉頭轉(zhuǎn)錄因子；SOD2:超氧化物歧化酶2

Hu等[7]建立鼠AKI模型，與野生型組比較，Klotho轉(zhuǎn)基因組的腎組織損傷評分顯著降低，肌酐清除率并不高于對照組，說明Klotho過表達不增加腎小球濾過率。NGAL是已知的腎保護物質(zhì)，給予外源性NGAL可以緩解腎IRI，促進細胞再生和組織修復，上調(diào)內(nèi)源性腎臟NGAL mRNA和蛋白質(zhì)，這可能是Klotho改善腎IRI的潛在機制[19]。

重組α-Klotho減輕氧化應激、增加NO，抑制腎小管細胞程序性壞死，抑制炎癥因子，上調(diào)內(nèi)源性NGAL表達，減少腎小管上皮細胞刷狀緣的脫落，增加內(nèi)源性Klotho表達，改善腎功能[7,20-24]。在IRI的AKI模型中[25]， 連續(xù)4d給予重組α-Klotho后，肌酐清除率和內(nèi)源性血漿α-Klotho升高，α平滑肌肌動蛋白降低，提示α-Klotho可抑制腎臟纖維化。早期、短期使用重組α-Klotho可持續(xù)改善腎功能和結(jié)構(gòu)，防止AKI向CKD進展。

Klotho治療時機影響AKI的預后。在IRI后30 min注射Klotho，腎組織損傷減輕，改善腎小球濾過率，療效優(yōu)于60 min時內(nèi)給藥，早期治療更利于改善預后[7]。

化學藥物相關(guān)AKI 腎毒性藥物促進腎小管上皮細胞壞死和凋亡，激活炎癥反應、氧化應激和自噬，導致腎損傷[27]。在順鉑導致的AKI中， Klotho降低腎臟細胞表達陽離子轉(zhuǎn)運體2(OCT2)，同時降低OCT活性，減少細胞攝取順鉑。Klotho調(diào)節(jié)Bax/Bcl-2和caspase-3信號級聯(lián)反應，產(chǎn)生抗凋亡作用，獨立于抗順鉑攝取作用[20]。Oh等[21]采用碘帕醇建立AKI模型， AKI組的Klotho mRNA和蛋白質(zhì)低于對照組，氧化應激和凋亡指標升高。重組Klotho通過抑制氧化應激和凋亡減輕碘帕醇導致的AKI。

膿毒癥性AKI 膿毒癥通過缺血再灌注損傷、炎癥反應、微循環(huán)功能障礙、線粒體損傷和代謝改變，造成腎損傷[28]。Klotho的缺乏加重了膿毒癥和多器官功能障礙。在Klotho單倍體不足的雜合子鼠及其同窩幼鼠中建立膿毒癥模型，Klotho缺乏組生存率較低，存在腎損傷、肝損傷、氧化應激反應加重，炎癥介質(zhì)和核子因κB(NF-κB)活性增加，交感神經(jīng)活性減弱，心率變異性減低，對硝普鈉的壓力反射功能降低，提示Klotho缺乏加重膿毒癥和多器官功能障礙[29]。陳薪薪等[30]發(fā)現(xiàn)膿毒癥小鼠AKI腎組織中Klotho減少、自噬增強，兩者均具有時間依賴性。重組Klotho能緩解腎損傷，恢復腎臟內(nèi)源性Klotho表達。但是，重組Klotho沒有影響腎組織表達自噬標記物(LC-3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、P62)，說明重組Klotho可能沒有增加自噬，Klotho的腎保護作用可能與其他機制相關(guān)[22]。孫敏等[23]發(fā)現(xiàn)，Klotho治療組腎小球和小管上皮細胞水腫減輕，小管腔內(nèi)透明管型減少，血清肌酐和尿素氮下降，線粒體結(jié)構(gòu)相對完整，線粒體氧化應激因子下降。腎組織Klotho蛋白、Bcl-2表達升高，細胞色素C下降，提示Klotho蛋白可以維持線粒體結(jié)構(gòu)完整，抑制氧化應激反應，保護腎功能。

Liu等[24]發(fā)現(xiàn)Klotho具有抗氧化應激和炎癥調(diào)節(jié)作用。在脂多糖(LPS)建立鼠的膿毒癥AKI模型中，腎臟α-Klotho降低。給予外源性α-Klotho后，血清肌酐和NGAL降低，提示α-Klotho能夠減輕AKI，α-Klotho高劑量組腎臟恢復更明顯。α-Klotho持續(xù)降低氧化應激標記物(丙二醛、活性氧自由基、SOD、谷胱甘肽過氧化物酶和NO)，活化內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的標記物[(葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)和XBP1]，降低IL-1、IL-6和腫瘤壞死因子α，升高IL-10，說明α-Klotho抑制促炎因子，刺激抗炎因子，調(diào)節(jié)機體內(nèi)環(huán)境。

橫紋肌溶解導致AKI 橫紋肌溶解后大量肌紅蛋白進入血液循環(huán)，阻塞腎小管，伴隨炎癥反應和氧化應激，引起腎小管上皮細胞壞死和凋亡，導致腎損傷[31]。在橫紋肌溶解相關(guān)的AKI的模型中，腎小管上皮細胞出現(xiàn)程序性壞死，尿液外泌體(uEVs)含有Klotho，uEVs治療降低血尿素氮和肌酐，降低腎損傷標志物[NGAL、纖溶酶原激活物抑制劑、半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)和SOX9]，降低促炎因子(腫瘤壞死因子-α，IL-1β和IL-6)。uEVs中的miRNA通過uEVs轉(zhuǎn)運到腎組織，抑制啟動子甲基化，參與上調(diào)Klotho，恢復正常的Klotho水平。uEVs參與上調(diào)Klotho，補償內(nèi)源性Klotho，改善腎小管上皮細胞的程序性壞死，促進了腎小管細胞的增殖，降低炎癥標記物。外泌體是天然來源的物質(zhì)，在血液循環(huán)中穩(wěn)定性較高，可以通過工程學的方法轉(zhuǎn)運分子，可能成為理想的治療方法。來自健康人的uEVs可能是囊泡的新來源，具有促進再生的特性，影響Klotho的調(diào)節(jié)[32]。

Klotho基因治療可以改善腎組織損傷和細胞凋亡，降低SCr[33]。采用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)獲得高效表達Klotho 基因的骨髓間充質(zhì)干細胞，過表達Klotho 基因上調(diào)腎臟血管內(nèi)皮生長因子，減輕腎臟損傷，促進腎功能恢復[34]。

展 望

AKI導致Klotho可逆性的降低，低水平的Klotho加重腎損傷。Klotho具有抗炎、抗氧化應激、抗纖維化、抗凋亡等多種生物學功能,促進AKI后腎臟結(jié)構(gòu)和功能的恢復。故Klotho是AKI的早期生物標記物，可以保護腎功能，是潛在的治療靶點。

由于血清和尿液Klotho在AKI后的達峰和持續(xù)時間不同，需要在腎損傷后進行連續(xù)性評估，明確AKI進程中血清和尿液Klotho隨時間變化的規(guī)律，從而確定標本采集時間。需要通過長期隨訪的臨床研究評價血清和尿液Klotho水平對AKI的預測價值。