鄧加艾，李霜，趙溪巖，勾洵通信作者)

（1.海南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，海南 ?？?571199；2.四川師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都 610101）

0 引言

阿茲海默癥（Alzheimer's disease, AD）是一種最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，起病隱秘，病程緩慢，罹患癡呆癥患者中50%～70%為此類病癥[1]。阿茲海默癥的病因及發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，至今尚未明確，其特征性病理改變?yōu)樵谀X組織內(nèi)β淀粉樣蛋白沉積形成和tau 蛋白過度磷酸化形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)等[2,3]?；颊叱１憩F(xiàn)為認(rèn)知功能障礙，嚴(yán)重影響患者學(xué)習(xí)記憶能力[4]。

研究學(xué)習(xí)記憶行為學(xué)方法有多種，其中空間學(xué)習(xí)記憶研究方法常見的有Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)（Morris water maze,MWM），非空間學(xué)習(xí)記憶研究方法常見的有新物體識別實(shí)驗(yàn)（Object Recognition Test, ORT）。Morris 水 迷 宮 實(shí) 驗(yàn) 由Morris 1981 年發(fā)明[5]，為一種迫使實(shí)驗(yàn)動物（如小鼠）在圓形池子里游泳，重復(fù)尋找水中特定平臺的實(shí)驗(yàn)方法，常見于對空間位置和空間定位的測試。一般分有持續(xù)訓(xùn)練、定位航行和空間探索三個階段，并對實(shí)驗(yàn)動物的運(yùn)動軌跡進(jìn)行追蹤與拍攝，采用相關(guān)軟件對運(yùn)動數(shù)據(jù)進(jìn)行分析與統(tǒng)計(jì)[6]。新物體識別實(shí)驗(yàn)是利用動物先天具有對新物體探索傾向的能力而建立的學(xué)習(xí)記憶測試方法[7]。在特定形狀（可為圓形、矩形、Y 型等）的場地內(nèi)放置對稱的兩個完全相同的物體，一段時間內(nèi)觀察實(shí)驗(yàn)動物（如小鼠）探索物體時長與次數(shù)，幾天后將其中一個物體替換成新事物，觀察實(shí)驗(yàn)動物探索新事物與舊物體的次數(shù)與時長，對實(shí)驗(yàn)動物的運(yùn)動軌跡進(jìn)行追蹤與拍攝，記錄數(shù)據(jù)[8]。

現(xiàn)有研究[9-12]多為探討不同藥物對阿茲海默癥患者的治療效果，而其對不同類型學(xué)習(xí)記憶影響的差異尚未可見，本研究通過阿茲海默癥對小鼠空間學(xué)習(xí)記憶與非空間學(xué)習(xí)記憶功能損傷的差異，探討阿茲海默癥對不同類型學(xué)習(xí)記憶功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

雌雄C57BL/6J SPF 小鼠，購于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動物有限公司[生產(chǎn)許可證：SCXK（川）2015-030]，（20±2）g，室溫：（20±2）℃，自由進(jìn)食和進(jìn)水。

1.2 儀器與藥品

Morris 水迷宮系統(tǒng)購于淮北正華生物儀器設(shè)備公司，萬分之一電子天平購于北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，臺式低溫冷凍離心機(jī)購于湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司，β-淀粉樣蛋白 (Aβ)購于Sigma，戊巴比妥鈉與氨水均購于北京索萊寶。

1.3 Aβ25-35 寡聚體的制備

取Aβ 1 mg，4℃靜置30 min，加入六氟異丙醇1 mL 溶解，靜置2 h，超聲；14000 rpm 離心20 min，取上清；液氮凍實(shí)后，冷凍干燥12 h，得到處理好的絮狀A(yù)β；200 L 1%氨水溶解，37℃孵育72 h；同時取4 mL 溶解后的液體用BCA 試劑盒測定蛋白濃度；取出孵育好的Aβ，依照測定濃度用0.01 M PBS稀釋至1 mg/mL。

1.4 分組與動物模型構(gòu)建

取24 只小鼠，雌雄對半，隨機(jī)分為四個組：雌性AD 組，雌性對照組，雄性AD 組，雄性對照組，每組各6 只。小鼠在恒溫、恒濕的SPF 級動物房中適應(yīng)性飼喂1 周，嚴(yán)格控制12 h光照/黑暗，環(huán)境溫度設(shè)定為24°C，適應(yīng)期間小鼠自由進(jìn)食和進(jìn)水。

1 周后將小鼠稱重麻醉后臺面上，用手術(shù)刀沿小鼠頭中逢做一小切口；使用腦定位儀確定小鼠頭部海馬區(qū)位置；用顱鉆鉆孔，左右各1 個，深度2 mm。旋轉(zhuǎn)腦定儀上的卡尺，移動微量注射泵至小鼠雙孔上空，待進(jìn)樣針抵住小鼠頭皮后，進(jìn)針深度為3～4 mm；雄性AD 組與雌性AD 組小鼠以1 μL/min恒速注射1.5 μL Aβ25-35；雄性對照組與雌性對照組則注射同等計(jì)量含有氨水與PBS 相同比例的溶液；留針30 s，緩慢退針，退針后用牙科膠覆蓋小孔；縫合，術(shù)后3 d 連續(xù)腹腔注射青霉素鈉防止感染。一般有持續(xù)訓(xùn)練、定位航行和空間探索三個階段，

1.5 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)

藥物干預(yù)4 周后進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)。水迷宮深80 cm，直徑180 cm，液體為牛奶稀釋液，實(shí)驗(yàn)分為3 個階段。第一階段是為時3 d 的持續(xù)訓(xùn)練階段，小鼠面向池壁，從第一象限放入水中，讓其在90 s 內(nèi)自由尋找第三象限的平臺，每天3 次，不記錄實(shí)驗(yàn)時間；如果小鼠在90 s 內(nèi)無法找到平臺，需用木棍將小鼠以直線距離引導(dǎo)至平臺休息30 s。第二階段是連續(xù)5 d 定位巡航階段，同一位置面向池壁放入小鼠，記錄其找到并登上平臺的時間（逃避潛伏期，Escape Latency），重復(fù)3 次。第三階段是為時1 d 的空間探索實(shí)驗(yàn)，撤去平臺，記錄小鼠在90s 內(nèi)穿越過原平臺位置的次數(shù)。采用Morris 水迷宮圖像自動監(jiān)視處理系統(tǒng)完成數(shù)據(jù)的采集和處理。

1.6 新物體識別測試

本實(shí)驗(yàn)采用40*40*50cm 白色開口木箱。第1 d 木箱中不放置任何物體，將每只小鼠放入場地中央自由活動5 min，以方便小鼠適應(yīng)新環(huán)境。第2～3 d 進(jìn)行訓(xùn)練，將A，B 兩個完全相同的物體以相互對稱的方式放置在木箱的兩端，小鼠從A、B 兩個物體相等的位置以背對的方式放入場地內(nèi)并記錄小鼠探索情況，包括鼻子或嘴巴觸碰物體的次數(shù)和時間，試驗(yàn)時長為5 min，記錄小鼠的探索情況。第4 d 將場地內(nèi)的B 物體換作不一樣的C 物體，放入小鼠，記錄其對C 物體探索情況，觀察5 min。

新物體探究識別指數(shù)(RI)=探索新對象時間/(探索新對象時間+探索熟悉對象時間)×100%。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)均用Graphpad prism 5 處理，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）進(jìn)行分析，組間顯著性差異采用t檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 阿茲海默對小鼠空間學(xué)習(xí)記憶的影響

2.1.1 阿茲海默對小鼠逃避潛伏期的影響

圖1（A）中1～5 d，雄性AD 組逃避潛伏期高于雄性對照組（P＜0.05），且天數(shù)越大，逃避潛伏期所用時間越長；圖1（B）中前3 d，雌性AD 組逃避潛與其對照組小鼠沒有顯著性差異（P＞0.05），在第4～5 d，雌性AD 組逃避潛伏期高于其雌性對照組（P＜0.05）；圖2 可以看出，雄性對照組、雌性對照與雄性AD 組的逃避潛伏期曲線均有不同程度下降，而雌性AD 組曲線趨勢變化相對不明顯。

圖1 阿茲海默對小鼠逃避潛伏期的影響

圖2 不同天數(shù)小鼠逃避潛伏期趨勢圖

2.1.2 阿茲海默對小鼠穿越平臺次數(shù)的影響

圖3 中，雄性對照組穿越平臺次數(shù)高于雄性AD組（P＜0.05），雌性對照組與雌性AD 組無明顯差異（P＞0.05）。

圖3 阿茲海默對小鼠穿越平臺次數(shù)的影響

2.2 阿茲海默對非空間學(xué)習(xí)記憶的影響

2.2.1 阿茲海默對小鼠新物體識別能力的影響

圖4 中可以看出，雄性對照組小鼠RI 值明顯高于雄性AD 組小鼠（P＜0.05），雌性亦然（P＜0.05）。

圖4 阿茲海默對RI 值的影響

3 討論

阿茲海默癥是神經(jīng)性退行性疾病中最主要的病癥之一，是危害中老年人健康的重要病癥[13-14]。在水迷宮實(shí)驗(yàn)中雄性AD 組小鼠逃避潛伏期（圖1A）與穿越平臺次數(shù)（圖3）均明顯高于其對應(yīng)的對照組，說明阿茲海默癥對雄性小鼠的空間記憶功能有損傷。同時表明水迷宮實(shí)驗(yàn)可成為判斷雄性小鼠AD 模型建造是否成功的行為學(xué)檢測方法。

而雌性AD 組與其對照組小鼠在水迷宮實(shí)驗(yàn)中，第4～5 d，逃避潛伏期（圖1B）存在顯著性差異，而穿越平臺次數(shù)（圖3）無明顯差異。其中逃避潛伏期實(shí)驗(yàn)需測試小鼠尋找到平臺并登上平臺的時間。而穿越平臺次數(shù)是將平臺隱藏，測試小鼠90 s 內(nèi)穿越隱藏平臺的次數(shù)，在該實(shí)驗(yàn)中，小鼠無需登上平臺。因此，逃避潛伏期實(shí)驗(yàn)中造成結(jié)果顯著性差異的因素還包括實(shí)驗(yàn)過程中由于小鼠體力等因素導(dǎo)致爬上平臺所花費(fèi)時間差異，而不是單純測試小鼠對平臺位置記憶能力。雌性小鼠AD 組與對照組，在平臺穿越次數(shù)實(shí)驗(yàn)中無顯著性差異，由此說明阿茲海默癥對雌性小鼠的空間記憶功能損傷程度較小或不明顯。同時，水迷宮實(shí)驗(yàn)?zāi)芊癯蔀榕袛啻菩孕∈驛D 模型建造成功的行為學(xué)檢測方法有待進(jìn)一步探究。

在新物體識別測試中，小鼠對新物體觸碰的時間越長說明其對新物體的學(xué)習(xí)能力越強(qiáng)，RI 值也越大[15]。兩組對照組的RI 值均明顯高于其對應(yīng)的AD 組（圖4），說明AD 小鼠對新事物學(xué)習(xí)認(rèn)知能力比對相應(yīng)對照組照組差，揭示阿茲海默癥對雄性和雌性小鼠的非空間學(xué)習(xí)記憶均產(chǎn)生損傷。同時表明新物體識別實(shí)驗(yàn)可成為判斷雄性和雌性小鼠AD 模型建造是否成功的行為學(xué)檢測方法。

綜上實(shí)驗(yàn)，阿茲海默癥對雄性小鼠空間學(xué)習(xí)記憶與非空間學(xué)習(xí)記憶能力都存在影響，而對雌性小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力影響不顯著，對其非空間學(xué)習(xí)記憶能力影響較大。