馬將軍，孫怡

（1.中山大學腫瘤防治中心，華南腫瘤學國家重點實驗室，腫瘤醫(yī)學協同創(chuàng)新中心，分子診斷科，廣東 廣州 510060；2.中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院，廣東省惡性腫瘤表觀遺傳和基因調控重點實驗室 兒科，廣東 廣州 510120 ）

0 引言

結直腸癌 (Colorectal carcinoma，CRC) 是我國最常見的消化系統惡性腫瘤之一，近年來，其發(fā)病率呈逐年增高的趨勢。免疫細胞及相關細胞因子在其發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。近年來，已有研究表明，Th17 細胞及其分泌的細胞因子在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[1]。Th17 細胞是一類不同于Th1 和Th2 的CD4+T 細胞，是由初始的CD4+T 細胞在TGF-β 和IL-6 的誘導下分化而來。Th17 細胞可分泌IL-17、IL-6、IL-21 等多種細胞因子[2]，其中，IL-17 是Th17 細胞主要分泌的細胞因子，IL-17 不僅促進炎癥的發(fā)生，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展也有很大關系，但其確切作用機制尚不完全清楚。為了明確IL-17 在結直腸癌的發(fā)生發(fā)展中的作用及其免疫病理意義，本研究通過檢測不同分期結腸癌患者外周血中Th17細胞水平及相關細胞因子IL-17 表達的變化，探討Th17 細胞及IL-17 與結腸癌發(fā)生、發(fā)展的關系。

1 材料與方法

1.1 研究對象

隨機選取2020 年1 月至2020 年9 月在中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院初次住院的結直腸癌患者60 例，其中男性35 例、女性25 例，年齡29～71 歲，平均54 歲。直腸癌26 例，結腸癌34 例，所有患者均無免疫系統疾病史，手術前均未接受免疫治療、放療、化療及其它抗腫瘤治療，入院前1 個月內無輸血或血制品，術后均獲得病理確診。其中，按Dukes 分期法分為A-B(I-Ⅱ)期40 例，其中高中分化腺癌26 例、低分化腺癌14 例。C-D(Ⅲ-IV)期20 例，高中分化腺癌9 例、低分化腺癌11 例；I-Ⅱ期有淋巴結轉移或遠處器官轉移者6 例，無轉移者35 例。Ⅲ-Ⅳ期有淋巴結轉移或遠處器官轉移者16 例，無轉移者3 例。對照組來源于同期本院健康體檢者30 例，其中男性18 例，女性12 例；年齡27～61 歲，平均47 歲。所有研究對象均無潰瘍性結腸炎、類風濕、甲狀腺功能減退等自身免疫性疾病史、無感染性疾病以及無免疫治療史。所有研究對象均簽署知情同意書。本研究獲得中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 標本采集

抽取受檢者手術前清晨空腹靜脈血3mL 和健康志愿者清晨空腹靜脈血3mL，肝素抗凝。加 Hank'S 液等體積稀釋后，用Ficoll 進行密度梯度離心(22℃ ，800×g，20 min)。將獲得的外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs) 充分洗滌后，用RPMI1640 完全培養(yǎng)液調整PBMCs的密度為2×106/mL。

1.3 主要試劑及儀器

FITC-Anti-Human IL-17 抗 體、APC-Anti-Human CD3抗體、PE-Anti-Human CD4 抗體均購自美國BD 公司；抗人IL-17 ELISA 試劑盒購自美國R&D 公司；固定破膜劑和破膜緩沖液購自美國eBioscience 公司；Trizol 購自life technologies公司；cDNA 反轉錄試劑盒（PrimeScriptTM RT reagent Kit,貨號：RR047A）購自寶生物(大連)有限公司；佛波酯(PMA)、離子霉素(Ionomycin)以及布雷桿氏菌素A(Brefeldin-A，BFA)均為Sigma 公司產品(美國)；RPMI1640、Hank'S 液等均購自美國GIBGO 公司；瓊脂糖（Biowest Agarose）購自北京沃比森科技有限公司；淋巴細胞分離液購自天津灝洋生物制品科技有限責任公司；酶標儀(ELx808)為BIO-TEK 公司產品(美國)；普通PCR 儀(Bio-RAD)，DNA 凝膠分析系統(美國Wealltec)；BD FACS Calibur 流式細胞儀為美國BD 公司生產；FlowJo 7.6軟件購自Tree Star 公司(美國)。

1.4 ELISA 方法檢測IL-17 水平

收集不同條件下的培養(yǎng)上清液，嚴格按照IL-17 檢測試劑盒(R&D)說明書提供的方法進行操作。IL-17 試劑盒檢測靈敏度為15pg/mL。

1.5 總RNA 提取和反轉錄獲得cDNA 吸取1 mL Trizol 試劑加入到細胞層中，室溫孵育5 min，加入0.2 mL 氯仿，混勻，室溫孵育2 min 后，12 000×g 于4℃離心15 min。離心后將上層無色水相層吸出保留，加入0.5mL 異丙醇?；靹颍覝胤跤?0min，12 000×g 于4℃ 離心10min。去除上清，使用75%乙醇清洗沉淀，7500×g 于4℃離心5min，去除上清，空氣干燥10min。加入DEPC 水溶解 RNA，測量RNA 濃度。取1 μg RNA 進行cDNA 反轉錄，方法根據 PrimeScriptTM RT reagent Kit 試劑盒說明書進行。引物由上海生工生物工程有限公司合成，其中，IL-17 的上、下游引物序列分別為：5'-ATG ACT CCT GGG AAG ACC TCA-3' 和5'-TTA GGC CAC ATG GTG GAC AAT CGG-3'； GAPDH 的上、下游引物序列分別為：5'-GCA TGG CCT TCC GTG TCC-3' 和5'-TGA GTG TGG CAG GGA CTC-3'。反應體系：12.5μL Taq PCR Mastermix(天根生化科技有限公司)，上、下游引物各0.5μL （10μM）, 2μl cDNA(5 ng/μl),ddH2O 9.5μL,總體積25μL。PCR 擴增條件如下：95℃預變性5min，然后進入35 個循環(huán)，包括95℃30S，58℃30S，72℃30S，最后72℃延伸5min。將5μL 擴增產物于質量分數為1.5%瓊脂糖凝膠電泳，DNA 凝膠分析系統觀察照相。

1.6 流式細胞術檢測外周血單個核細胞Th17 細胞的含量

細胞充分洗滌后，完全RPMI1640 培養(yǎng)液調整細胞數為2×106/mL， 加 入PMA(20ng/mL)1μL，Ionomycin(1μg/mL)1μL，置 于37 ℃培 養(yǎng) 箱 中 刺 激4h，加 入BFA(10mg/mL)1μL，置于37℃培養(yǎng)箱中刺激8h 后，收集細胞，用PBS 洗滌2 次，去上清后每管100μL 重懸細胞，分別加入不同熒光素標記的抗CD3 和CD4 單克隆抗體，4℃避光反應30min。孵育結束后，PBS 洗2 次，加入固定劑500μL，4℃避光孵育8min，PBS 洗2 次，加入100μL 破膜劑重懸細胞，4℃避光過夜，次日加入PEanti-humanIL-17 抗體，混勻，4℃避光孵育30min，PBS 洗滌棄上清后，用100μL 的PBS 重懸準備上機檢測。應用流式細胞檢測儀(BD FACS Calibur)檢測細胞，FlowJo 7.6 軟件分析結果。

1.7 統計學方法

應用SPSS 17.0 統計軟件對結果進行分析，所有檢測結果均以±s 表示，采用獨立樣本t檢驗進行比較；相關分析為計數資料的相關分析。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組外周血單個核細胞中IL-17 mRNA 的表達

PCR 實驗結果顯示，IL-17 mRNA 在健康對照組中表達最低，在Ⅰ-Ⅱ期組中表達較高，而在Ⅲ-IV 期組表達最高，且三組之間差異均有統計學意義（P＜0.01）。說明IL-17 mRNA 表達水平的變化與腫瘤分期緊密相關。PCR 電泳圖和統計圖分別見圖1、圖2。

圖1 PCR 技術檢測CRC 患者與健康對照組外周血中IL-17 mRNA表達情況

圖2 PCR 技術檢測CRC 患者與健康對照組外周血中IL-17 mRNA表達水平統計圖

2.2 CRC 患者及健康對照組血清中IL-17 含量的測定

ELISA 結果顯示，結直腸癌Ⅰ- Ⅱ期組和Ⅲ-IV 期組血清中IL-17 的濃度分別為(42.46±15.62)ng/L 和(97.55±20.12) ng/L，均明顯高于健康對照組(18.74±7.82)ng/L，三組之間差異均具有統計學意義（P＜0.01），見圖3。

圖3 ELISA 技術檢測CRC 患者與健康對照組血清中IL-17 含量水平統計圖

2.3 不同實驗組外周血中IL-17 表達水平與臨床病理特征之間的關系

通過ELISA 實驗技術檢測的結果顯示，血清中IL-17 含量水平與腫瘤的大小、淋巴結轉移、Dukes 分期及腫瘤分化程度明顯相關(P＜0.01)；與患者性別、年齡、腫瘤部位無關，差異不具有統計學意義（P＞0.05），見表1、圖4。

表1 不同實驗組外周血中IL-17 表達水平與臨床病理特征間的關系

圖4 血清中IL-17 表達水平與臨床多個指標相關性分析

2.4 不同組份PBMCs 中Th17 細胞的表達情況

流式細胞術檢測結果顯示，未經刺激的空白對照組幾乎無Th17 細胞的表達；而經過PMA+Ionomycin 刺激后，Ⅲ-IV期組表達Th17 細胞數量要高于Ⅰ-Ⅱ期組，差異具有統計學意義（P＜0.01），且二者均高于健康對照組，差異具有統計學意義(P＜0.01)，見圖5、圖6。

3 討論

腫瘤能嚴重威脅人類健康，在我國，惡性腫瘤已經成為疾病患者首位致死主要病因。目前，腫瘤早期診斷與治療已經成為許多研究學者的關注重點，而免疫治療在繼手術、放化療之后，逐漸成為一種新興的腫瘤治療方法，其主要作用是激發(fā)和調動機體免疫系統，增強腫瘤微環(huán)境抗腫瘤的免疫力，控制并殺傷腫瘤細胞。作為機體適應性免疫反應中重要的效應細胞，Th17 細胞在免疫調解中發(fā)揮著重要作用，但其在腫瘤中的確切作用機制仍不十分明確。根據細胞因子和生物功能特征的不同，可將CD4+T 細胞分為Th1，Th2 及Th17 等多個亞群，其中，Th17 細胞主要由TGF-β 和IL-6 誘導分化[3]，而成熟的Th17 細胞可在IL-23 存在的環(huán)境下發(fā)生增殖[4]。成熟的Th17 細胞常被視為促炎細胞，可分泌多種炎癥因子，如IL-17，IL-6，IL-21,IL-22 和IL-23 等，這些炎癥因子能有效地介導炎癥細胞到局部浸潤和造成組織損傷。而IL-17 作為Th17 細胞特征性細胞因子，其表達水平的高低主要受控于Th17 細胞數量與功能活性的影響。

圖5 流式細胞術檢測CRC 患者與健康對照組外周血中Th17 細胞含量的變化

圖6 流式細胞術檢測CRC 患者與健康對照組外周血中Th17 細胞含量變化的統計圖

雖然Th17 細胞廣泛存在于腫瘤微環(huán)境中，但是其在腫瘤免疫中所發(fā)揮的功能作用仍存在著分歧。有研究發(fā)現，癌癥患者腫瘤浸潤淋巴細胞中Th17 細胞數量顯著高于非腫瘤組織[5]，也有研究認為，在前列腺癌中Th17 細胞數量隨腫瘤進展而下降[6]。此外，在Th17 細胞發(fā)揮抗癌作用的研究中，其分泌的細胞因子IL-17 所發(fā)揮的作用最讓人困惑。研究表明,在腫瘤微環(huán)境中，IL-17 可能擁有二重角色[7]，一方面其可促進腫瘤相關血管生成，使腫瘤體內微血管數量和密度顯著增加，更有利于腫瘤生長、轉移和浸潤[8]；另一方面，Th17 細胞可促進抗腫瘤免疫應答，抑制腫瘤的生長和轉移[9]。

目前，國內外已有相關文獻報道Th17 細胞在結腸癌患者外周血中的表達情況，提示Th17 細胞可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關[10,11]。

本研究為了揭示Th17 細胞在CRC 患者中所發(fā)揮的免疫學作用，檢測了不同受試者外周血中Th17 細胞的數量及細胞因子IL-17 表達的情況。結果顯示，CRC 患者外周血Th17細胞水平均較正常組升高，且Ⅲ-Ⅳ期組患者Th17 細胞比例顯著高于Ⅰ-Ⅱ期組，差異均具有統計學意義（P＜0.05），提示CRC 患者體內存在Th17 細胞與疾病的進展呈正相關。進一步分析發(fā)現，外周血中細胞因子IL-17 表達水平與CRC 患者腫瘤的大小、淋巴結轉移、Dukes 分期及腫瘤分化程度相關，差異據具有統計學意義（P＜0.05），而Th17 與CRC 性別、年齡無關、腫瘤部位無相關（P＞0.05）。因此，我們認為Th17細胞在結腸癌病情進展中發(fā)揮著重要的作用。

本研究發(fā)現，Th17 細胞和IL-17 具有促進腫瘤發(fā)生、發(fā)展的作用，這與先前文獻報道的一致[12]，其主要原因可能是Th17 細胞和IL-17 參與誘導腫瘤血管生成和提高腫瘤微環(huán)境中細胞因子的表達而產生促腫瘤生長作用。有研究發(fā)現，IL-17 主要是通過誘導血管生成因子，如VEGF、PGE2、角質化細胞衍生趨化因子等，導致腫瘤血管生成，促進腫瘤發(fā)展[13]。另外，IL-17 可誘導IL-6 生成，后者可激活致瘤信號通路（STAT-3），從而上調促存活和促血管生成基因的表達，以此參與腫瘤血管生成[14]。

綜上所述，Th17 細胞和IL-17 改變了人們對腫瘤免疫的認識，隨著研究的進一步深入，Th17 細胞和IL-17 極有可能成為腫瘤治療的有效治療靶點，也可能成為預測結腸癌患者預后、生存期及死亡率的重要分子標記，但其在結腸癌治療過程中所發(fā)揮的免疫調控作用及具體機制還有待進一步的探討研究。