曾子純，戴勁廷，肖小敏*

（1.暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東 廣州510000；2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣州市加速康復(fù)腹部外科重點實驗室，廣東 廣州510000）

0 引言

人類腸道微生物菌群包含著約1014 個微生物，而且腸道內(nèi)微生物編碼的基因數(shù)量是人類自身基因的150 倍[1]，是人體最大最復(fù)雜的微生物菌落，微生物學(xué)家認(rèn)為腸道菌群是人體內(nèi)的一個器官或系統(tǒng)，主要由厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、放線菌門、梭桿菌門、疣微菌門及藍(lán)菌門組成[2]。隨著腸道菌群與健康的深入研究，血液循環(huán)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、免疫、心理等均與腸道菌群有密切的聯(lián)系。

妊娠期間孕婦腸道菌群會根據(jù)機(jī)體代謝、激素水平的變化而發(fā)生適應(yīng)性變化，這個過程同時也受到環(huán)境因素的影響，飲食則為其中一個重要的影響因素。Gohiret[3]等通過高脂飲食喂養(yǎng)妊娠期孕鼠，結(jié)果與正常飲食的孕鼠相比兩者的腸道菌群的結(jié)構(gòu)有差異。Zhang 等[4]使用補充了15%乳果糖的飲食喂養(yǎng)妊娠小鼠2 周后，其腸道菌群中雙歧桿菌和擬桿菌豐度顯著增加。然而，腸道菌群是一個非常龐大且復(fù)雜的群體，各菌屬之間存在相互影響，隨著數(shù)據(jù)處理技術(shù)的不斷發(fā)展，人們能觀察到腸道菌群各菌屬之間相互網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，目前，有關(guān)膳食營養(yǎng)素對腸道菌群菌間相互關(guān)系的影響研究尚少，而菌群的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系研究為營養(yǎng)學(xué)提出了一種新的研究方法，本文利用該方法進(jìn)行初步探討，旨在為指導(dǎo)孕期飲食提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象

招募于暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院分娩系統(tǒng)產(chǎn)檢、并計劃于本院分娩的正常生理妊娠孕婦，納入標(biāo)準(zhǔn)為年齡20～35 歲；首次單胎妊娠；無妊娠合并癥；無胃腸道疾病病史，孕期無抗生素使用史，BMI＜30kg/m2，簽署知情同意書。共收集到簽署知情同意書的孕婦32 例，主動退出2 例，最終納入符合標(biāo)準(zhǔn)孕婦30 例。

1.2 標(biāo)本及數(shù)據(jù)采集

1.2.1 收集孕婦孕晚期膳食營養(yǎng)參數(shù)

納入研究的孕婦在孕32 周時進(jìn)行糞便標(biāo)本采集及完成食物攝入頻率調(diào)查問卷(Food Frequency Questionnaire, FFQ)，估算孕婦孕32 周能量及宏量營養(yǎng)素的攝入量，包括蛋白質(zhì)(Protein, Pro)、脂肪(Fat)、碳水化合物(Carbohydrate, Carb)。

1.2.2 孕晚期糞便采集及樣品準(zhǔn)備

使用一次性收集糞便標(biāo)本專用盒，取出標(biāo)本盒內(nèi)勺子取糞便內(nèi)部實質(zhì)，嚴(yán)格避免混入尿液或其他雜物，留取 3～5 克放

入清潔滅菌專用標(biāo)本盒內(nèi)，保證排便后半小時內(nèi)凍存于實驗室-80℃冰箱。在液氮凍存情況下將標(biāo)本批量送往Novogene諾禾致源生物科技公司進(jìn)行測序檢測。

1.3 孕婦腸道菌群的檢測及分析

按照標(biāo)準(zhǔn)測序方法，經(jīng)過基因組DNA 的提取和PCR 擴(kuò)增，使用帶Barcode 的特異引物，New England Biolabs 公司的Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer，引物對應(yīng)區(qū)域：16S V4 區(qū)引物（515F 和806R）；使用Thermo Scientific 公司GeneJET 膠回收試劑盒回收產(chǎn)物進(jìn)行PCR 產(chǎn)物的混樣和純化；使用Thermofisher 公司的Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns 建庫試劑盒進(jìn)行文庫的構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit 定量和文庫檢測合格后，使用Thermofisher 的Ion S5TMXL 進(jìn)行上機(jī)測序，對所得reads 以97% 的一致性將序列聚類成為OTUs，并用Mothur 方法與SILVA132[7]的SSUrRNA 數(shù)據(jù)庫[5]進(jìn)行物種注釋分析。

1.4 統(tǒng)計分析

采用R 語言軟件中的vegan 軟件包進(jìn)行相關(guān)分析，采用Spearman 秩相關(guān)檢驗，P＜0.05 時為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 孕晚期孕婦膳食營養(yǎng)參數(shù)一般情況

孕婦平均年齡、孕早期體重、孕晚期體重、身高、新生兒出生體重等參數(shù)，在兩組間比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

將30 例孕婦孕32 周經(jīng)膳食攝入的宏量營養(yǎng)素，與2013 版中國居民膳食營養(yǎng)素參考攝入量[6](Dietary Reference Intakes, DRIs) 推薦的妊娠期孕婦各類營養(yǎng)素參考攝入量（Recommended Nutrient Intake, RNI）比較，其中73.3%（22 例）孕婦脂肪攝入量超過RNI 推薦的能量的30%高限，60%（18 例）孕婦碳水化合物攝入量未達(dá)到RNI 推薦的能量的50%低限，93.3%（28 例）孕婦蛋白質(zhì)攝入量達(dá)到RNI 標(biāo)準(zhǔn)，僅2 人未達(dá)標(biāo)。

2.2 孕晚期營養(yǎng)素對孕婦腸道菌群網(wǎng)絡(luò)關(guān)系影響

與其他分析方法相比，網(wǎng)絡(luò)圖能更好地展現(xiàn)出微生物之間的相互關(guān)系以及結(jié)構(gòu)變化[7-9]。將孕32 周孕婦按照其膳食營養(yǎng)素攝入量是否符合RNI 分為達(dá)標(biāo)組、未達(dá)標(biāo)或超過超標(biāo)組，分別對各組孕晚期孕婦腸道菌群進(jìn)行spearman 分析并繪制屬水平物種相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖，以下各組網(wǎng)絡(luò)圖展示了豐度前100 菌屬之間具有顯著相關(guān)關(guān)系（P＜0.5）的菌屬。因網(wǎng)絡(luò)分析各組最低樣本量為6 個，蛋白質(zhì)攝入量達(dá)標(biāo)18 例，僅2 例未達(dá)標(biāo)，因此無法進(jìn)行分析。

網(wǎng)絡(luò)圖下方的表格為描述網(wǎng)絡(luò)圖的相關(guān)指標(biāo)，可以直觀地顯示出網(wǎng)絡(luò)圖的相關(guān)關(guān)系的復(fù)雜程度及菌群結(jié)構(gòu)的聚集的緊密性。孕晚期腸道菌群豐度前六位的菌屬為乳桿菌、鏈球菌、擬桿菌、腸球菌、雙歧桿菌、大腸埃希菌，我們將此6 種菌屬有顯著相關(guān)的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系數(shù)量總和也進(jìn)行了比較。

2.2.1 孕晚期脂肪攝入量對孕婦腸道菌群網(wǎng)絡(luò)關(guān)系影響

將30 例孕婦按照孕晚期脂肪攝入量是否符合RNI 標(biāo)準(zhǔn)分為兩組，符合RNI 的8 例為達(dá)標(biāo)組，超過RNI 的22 例為超標(biāo)組進(jìn)行分析。結(jié)合圖1 及表1 可見，孕晚期脂肪攝入量超標(biāo)的孕婦與攝入量達(dá)標(biāo)的孕婦相比，腸道菌群網(wǎng)絡(luò)圖結(jié)構(gòu)疏松，圖密度及網(wǎng)絡(luò)關(guān)系平均數(shù)較低，表明晚期脂肪攝入量超標(biāo)的孕婦腸道菌群菌屬結(jié)構(gòu)更松散，菌屬間相關(guān)性更少，超標(biāo)組中豐度最高的6 種菌屬相關(guān)關(guān)系數(shù)量也少于達(dá)標(biāo)組。

圖1 孕晚期脂肪攝入量兩組孕婦腸道菌群網(wǎng)絡(luò)圖

表1 網(wǎng)絡(luò)圖指標(biāo)

2.2.2 孕晚期碳水化合物攝入量對孕婦腸道菌群網(wǎng)絡(luò)關(guān)系影響

參考碳水化合物攝入量，將12 例符合RNI 的孕婦分為達(dá)標(biāo)組，18 例未達(dá)到RNI 的孕婦為未達(dá)標(biāo)組進(jìn)行分析。結(jié)合圖2 及表2 可見，孕晚期碳水化合物攝入量未達(dá)標(biāo)的孕婦與攝入量達(dá)標(biāo)的孕婦相比，腸道菌群網(wǎng)絡(luò)圖結(jié)構(gòu)疏松，圖密度及網(wǎng)絡(luò)關(guān)系平均數(shù)較低，表明晚期碳水化合物攝入量未達(dá)標(biāo)的孕婦腸道菌群菌屬結(jié)構(gòu)更松散，菌屬間相關(guān)性更少，未達(dá)標(biāo)組中豐度最高的6 種菌屬相關(guān)關(guān)系數(shù)量也少于達(dá)標(biāo)組。

表2 網(wǎng)絡(luò)圖指標(biāo)

圖2 孕晚期碳水化合物攝入量達(dá)標(biāo)與未達(dá)標(biāo)孕婦腸道菌群網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

中國居民膳食營養(yǎng)素攝入量指南對于蛋白質(zhì)、脂肪、和碳水化合物三大產(chǎn)能營養(yǎng)素的攝入量特別提出了宏量營養(yǎng)素可接受范圍（acceptable macronutrient distribution ranges，AMDR），該范圍可以提供這些必需營養(yǎng)素的需要，并且有利于降低發(fā)生非傳染性慢性病的危險，常用占能量攝入量的百分比表示，其中脂肪的AMDR 為每日能量的20-30%?，F(xiàn)在國人已經(jīng)有意識地控制了脂肪的攝入量，如避免攝入肥肉、控制油炸食品攝入次數(shù)等，但我們的研究發(fā)現(xiàn)，仍有73.3%孕婦脂肪攝入量高于RNI，根據(jù)問卷調(diào)查結(jié)果推測，孕晚期畜肉類攝入較多，且家庭烹調(diào)習(xí)慣較為油膩，可能是孕婦脂肪攝入過多的原因。已有研究發(fā)現(xiàn)，脂肪攝入量會影響腸道菌群，Lin等[10]研究指出高脂飲食的大鼠腸道菌群中厚壁菌門豐度增加，而擬桿菌門豐度降低，并且厚壁菌門與擬桿菌門比例顯著高于對照組，其結(jié)果與人相同。Gohir 通過高脂飲食喂養(yǎng)妊娠期孕鼠，結(jié)果與正常飲食的孕鼠相比兩者的腸道菌群的結(jié)構(gòu)有差異，其結(jié)果與非懷孕者相同[3]。本研究屬水平物種相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖結(jié)果顯示，孕晚期攝入過多的脂肪，會使孕婦腸道菌群網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)趨向松散，菌屬間相關(guān)關(guān)系更少。

現(xiàn)今越來越多的人通過減少甚至不攝入碳水化合物來控制體重，但AMDR 建議每日能量的50%-65% 應(yīng)由碳水化合物提供。碳水化合物的攝入量同樣會影響腸道菌群，Soon[11]等人用添加不同劑量蛋白質(zhì)及碳水化合物的飼料飼養(yǎng)蟋蟀，發(fā)現(xiàn)腸道菌群物種豐富度隨著攝入營養(yǎng)素的增多而降低，飼料中蛋白質(zhì)與碳水化合物的比例是影響腸道細(xì)菌群落的主要因素。有文獻(xiàn)指出副擬桿菌屬(Parabacteroides)及雙歧桿菌(Bifidobacterium) 的豐度與碳水化合物中抗性淀粉(Resistant starch, RS)攝入量呈正相關(guān)，Ruminococcus 與之呈負(fù)相關(guān)[12]。本研究顯示，孕晚期碳水化合物攝入不足會使孕婦腸道菌群網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加松散，菌間相關(guān)關(guān)系更少。

孕晚期膳食營養(yǎng)素的攝入量將會影響腸道菌群的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，膳食營養(yǎng)素的攝入量達(dá)標(biāo)的孕婦腸道菌群結(jié)構(gòu)緊密，菌屬間相互聯(lián)系，相互制約，形成了較為穩(wěn)定的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。宏量營養(yǎng)素攝入不足或超標(biāo)均可能使屬水平菌間關(guān)系網(wǎng)絡(luò)關(guān)系變松散，菌屬之間的相關(guān)關(guān)系數(shù)量減少，各菌屬獨立性增高，本研究猜測此種網(wǎng)絡(luò)關(guān)系的變化可能會影響菌群整體的后續(xù)發(fā)展。但菌屬間的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系是一個復(fù)雜的體系，膳食營養(yǎng)素攝入量導(dǎo)致的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系改變對人體究竟有益還是有害有待進(jìn)一步研究，且本研究納入的研究例數(shù)偏少，有待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本進(jìn)行探討。