馮浩杰，陳屹沖，張占紅，王晶晶，安斌斌，樊海寧

（青海大學(xué)附屬醫(yī)院肝膽胰外科，青海 西寧 810000）

0 引言

肝癌是目前世界上最常見的癌癥之一，尤其是在東亞。肝細(xì)胞癌(HCC, hepatocellular carcinoma)占肝癌的大多數(shù)，是全球第四大癌癥相關(guān)死亡原因[1]。由于大多數(shù)患者被診斷為晚期，5 年總存活率僅為10%[2]。目前的治療方案，包括使用索拉非尼和瑞格拉非尼，對晚期肝癌的益處微乎其微。盡管使用抗PD-1 抗體的免疫療法對許多癌癥顯示出顯著的生存益處。然而，在肝癌的免疫治療的中受到了許多的限制[3]。因此，有必要尋找新的治療方法來有效治療肝癌。

表觀遺傳修飾對于真核生物的生理發(fā)育和穩(wěn)定的基因表達(dá)是至關(guān)重要的，并且在從基因表達(dá)到疾病發(fā)病機(jī)制的各種生物學(xué)過程中都是必需的[4]。組蛋白去甲基化酶1A(KDM1A)，又名LSD1 和AOF2，是2004 年首次發(fā)現(xiàn)的黃素依賴性脫甲基酶[5]。LSD1 可以去除組蛋白-3 第四位和第九位(H3K4me2/1和H3K9me2/1)上的二甲基和單甲基，從而分別導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄抑制或激活[6]。它不僅在胚胎發(fā)育和分化的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，而且，該蛋白調(diào)節(jié)許多生理過程，包括決定干細(xì)胞和祖細(xì)胞的形狀和特性，并在干細(xì)胞和祖細(xì)胞分化為特化細(xì)胞（造血細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞、精子細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等）方面發(fā)揮作用[7]。KDM1A 還與多種病理疾病的發(fā)展有關(guān)，如癌癥、神經(jīng)元紊亂和病毒感染[8]。然而，在肝癌中，KDM1A 的表達(dá)和預(yù)后情況以及其DNA 甲基化狀態(tài)依舊是一片空白。

本研究通過TCGA 數(shù)據(jù)庫下載了肝癌數(shù)據(jù)集，我們首先對比了正常組織和肝癌組織中KDM1A 的表達(dá)差異，另外，我們還研究了肝癌患者KDM1A 高低表達(dá)對以后的影響，最后我們還分析了KDM1A 所有甲基化位點(diǎn)的甲基化水平。具體研究內(nèi)容如下。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)采集

下載TCGA (www.cancer.gov)中基于Illumina HiSeq 2000的RNA-Seq V2 的HCC 數(shù)據(jù)集。同時，與RNA-Seq 相匹配的患者臨床數(shù)據(jù)也被下載。在數(shù)據(jù)集中，正常肝組織51 份，HCC 組織372 份，并且所有的基因表達(dá)值通過log2 轉(zhuǎn)化。在HCC 患者中，365 名患者有完整的生存數(shù)據(jù)記錄。因此，365例患者被納入本研究的生存分析。另外，在該數(shù)據(jù)集中，有48 份正常組織和381 份HCC 組織有完整的甲基化數(shù)據(jù)，所有的甲基化數(shù)據(jù)均以β 值分析。所有的甲基化位點(diǎn)分布圖下載于SMART 網(wǎng)站（http://www.bioinfo-zs.com /smartapp/）。

1.2 統(tǒng)計分析

使用非配對的t檢驗分析正常組織和肝癌組織中KDM1A的表達(dá)差異；采用Pearson 相關(guān)分析比較基因表達(dá)情況與基因甲基化之間的線性關(guān)系；利用R 軟件MaxStat 方法將HCC 患者分為KDM1A 高、低表達(dá)組，用Kaplan-Meier 分析估計兩組的生存曲線，并用對數(shù)秩檢驗(Mantel-Cox)進(jìn)行比較。所有統(tǒng)計圖表均由GraphPad Prism(8.3.0 版)完成。所有P值均為雙側(cè)。P值小于0.05 被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 相比較正常肝組織，KDM1A 在HCC 組織中高表達(dá)

為了研究KDM1A 在HCC 中的作用，我們分析了TCGA數(shù)據(jù)庫中HCC 數(shù)據(jù)集。如圖1，與正常肝組織相比，KDM1A在HCC 組織中明顯上調(diào)。Sangchul Kim 等人通過免疫組織化學(xué)分析研究發(fā)現(xiàn)，303 例肝細(xì)胞癌中有232 例(77%)KDM1A蛋白表達(dá)陽性[9]。另外，有研究證明HCC 組織中KDM1A 與正常組織相比明顯升高，這與我們的研究是一致的[10]。

圖1 KDM1A 的基因表達(dá)和總體生存率

2.2 HCC 患者中，KDM1A 低表達(dá)提示預(yù)后良好

為了進(jìn)一步闡明KDM1A 在HCC 中的作用，我們利用R軟件MaxStat 方法將HCC 患者分為KDM1A 高、低表達(dá)組，采用Kaplan-Meier 生存分析方法評估高表達(dá)KDM1A 和低表達(dá)KDM1A 的HCC 患者的生存率。如圖1B 所示，在HCC 患者中，KDM1A 高表達(dá)組的生存率明顯低于KDM1A 低表達(dá)組，即KDM1A 高表達(dá)提示HCC 患者預(yù)后不良。

2.3 與正常肝組織相比，KDM1A 在HCC 組織中主要發(fā)生了去甲基化

甲基化與去甲基化作為表觀遺傳學(xué)中不可或缺的一部分，在基因表達(dá)過程中發(fā)揮著重要作用。為了研究KMD1A在正常肝組織和HCC 中的差異，我們首先從SMART 中下載了所有KMD1A 的甲基化位點(diǎn)分布圖（圖2）。其次，我們將這14 個與KMD1A 有關(guān)的甲基化位點(diǎn)進(jìn)行了差異分析，發(fā)現(xiàn)在HCC 中cg26662347、cg22683154、cg03967533、cg25977026、cg14015920 明顯下調(diào)，但是在cg23271558、cg10499166 中卻是上調(diào)的（圖3）。因此，我們認(rèn)為KDM1A 在HCC 組織中主要發(fā)生了去甲基化。

圖2 KDM1A 甲基化位點(diǎn)的分布和甲基化的程度。

2.4 KDM1A 基因表達(dá)與多個甲基化位點(diǎn)明顯相關(guān)

為了探究KDM1A 高表達(dá)是否與甲基化相關(guān)，我們將KDM1A 基因表達(dá)與其相關(guān)的所有甲基化位點(diǎn)進(jìn)行了相關(guān)性分析。如圖3（無統(tǒng)計學(xué)意義的位點(diǎn)未給出），我們發(fā) 現(xiàn)cg06958034、cg25977026、cg03967533、cg23271558、cg22683154 與KDM1A 基因表達(dá)明顯相關(guān)，而其余的位點(diǎn)與其無相關(guān)性。因此，我們認(rèn)為，KDM1A 高表達(dá)的原因很可能是因為該基因的甲基化水平改變所致。

3 討論

近年來，隨著高通量技術(shù)的出現(xiàn)，可以在單個實驗中同時研究數(shù)千個基因，這可能成為研究有用的遺傳和表觀遺傳生物標(biāo)記物的激動人心的工具，用于癌癥檢測和預(yù)后[11]。這項革命性的技術(shù)使精準(zhǔn)醫(yī)療成為可能，因此，在高通量技術(shù)的支持下，本研究使用TCGA 公共數(shù)據(jù)庫下載了HCC 數(shù)據(jù)集，分析了KDM1A 在正常肝組織和HCC 組織中的表達(dá)差異，并且研究了KDM1A 對HCC 患者預(yù)后的影響。最后，我們還利用數(shù)據(jù)集中的甲基化數(shù)據(jù)，初步探討了KDM1A 表達(dá)差異的機(jī)制。

眾所周知，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中，原癌基因的激活發(fā)揮著不可磨滅的作用。在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中就有許多這樣的基因：從肝細(xì)胞癌的研究中發(fā)現(xiàn)，CHD1L 不僅通過FISH 被擴(kuò)增，而且它的mRNA 和蛋白在被檢測的樣本中也過表達(dá)[12]；在Yap/Taz 的作用下，原癌基因MYC 與β-catenin協(xié)同促進(jìn)HCC 的發(fā)生，并且MYC 呈高表達(dá)[13]。諸如此類的例子還有很多，在本研究中，我們對比了正常肝組織和HCC組織中KDM1A 的表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)在HCC 中KDM1A 明顯過表達(dá)。因此，類似于CHD1L 和MYC 等原癌基因，KDM1A 在HCC 中可能是作為一種癌基因來發(fā)揮促癌作用。為了進(jìn)一步證明上述結(jié)果，我們研究了KDM1A 對HCC 患者預(yù)后的影響。我們首先將患者分為KDM1A 高表達(dá)和低表達(dá)組，隨后的總體生存率結(jié)果顯示高表達(dá)組的生存期明顯低于低表達(dá)組。因此，我們初步認(rèn)為，KDM1A 在HCC 中是一種原癌基因。

DNA 甲基化是一種基本的表觀遺傳學(xué)標(biāo)志，與發(fā)育過程中的轉(zhuǎn)錄抑制、穩(wěn)態(tài)保存和疾病有關(guān)[14]。DNA 的異常去甲基化與許多嚴(yán)重疾?。ㄈ绨┌Y）有關(guān)，表明DNA 甲基化動態(tài)在細(xì)胞分化過程中受到嚴(yán)格調(diào)控，以決定細(xì)胞類型特異性基因的表達(dá)[15]。目前，越來越多的證據(jù)表明甲基化和去甲基化與基因表達(dá)密切相關(guān)。根據(jù)相關(guān)報道，Wnt5a 基因失活的關(guān)鍵原因之一是由于上皮性卵巢癌中Wnt5a 區(qū)啟動子的甲基化異常[16]。此外，DNA 甲基化和組蛋白去乙酰化共同使癌癥相關(guān)基因沉默，但DNA 去乙?；诩せ畎┌Y相關(guān)基因方面優(yōu)于組蛋白乙酰化[17]。因此，DNA 甲基化和去甲基化作為一種重要的表觀遺傳修飾，會影響基因轉(zhuǎn)錄。

圖3 KDM1A 基因表達(dá)與其相應(yīng)位點(diǎn)甲基化β 值的相關(guān)性分析。

為了探究KDM1A 在HCC 中高表達(dá)的原因，我們從TCGA同一個HCC 數(shù)據(jù)集中分析了正常肝組織和HCC 組織中14 個KDM1A 的甲基化位點(diǎn)，其中5 個位點(diǎn)明顯發(fā)生了去甲基化，2 個位點(diǎn)發(fā)生了甲基化，剩下的7 個位點(diǎn)無明顯變化。因此，在HCC中KDM1A 主要發(fā)生了去甲基化。為了進(jìn)一步研究KDM1A 基因表達(dá)和甲基化的關(guān)系，我們進(jìn)行了相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5 個甲基化位點(diǎn)與KDM1A 明顯相關(guān)。因此，我們認(rèn)為KDM1A 在HCC 中高表達(dá)可能是因為KDM1A 基因去甲基化造成的。

綜上所述，在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)KDM1A 在HCC 中明顯上調(diào)，并且提示著預(yù)后不良。同時我們還發(fā)現(xiàn)，KDM1A 基因主要發(fā)生了去甲基化，而且該甲基化水平與基因表達(dá)情況之間有明顯的相關(guān)性。因此，我們認(rèn)為在HCC 中，KDM1A 高表達(dá)可能是由于KDM1A 去甲基化造成的，并且干預(yù)KDM1A可能是治療HCC 的重要靶點(diǎn)之一。