王璐 薛仲探 王玉峰 尚媛媛 任衛(wèi)聰 姚叢 高飛 逄宇

貝達喹啉(bedaquiline，Bdq)是近50年來首個具有全新作用機制的抗耐多藥結核病(MDR-TB)的條件獲批藥物[1-2]。其作用機制是靶向抑制結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)5′-三磷酸腺苷酶合成酶，干擾MTB能量合成，從而發(fā)揮抗菌及殺菌作用。Bdq的藥理活性位點由喹啉中心雜環(huán)核和叔醇、叔胺側鏈基團組成，通過與膜結合的F1F0-ATP合酶c亞基結合而發(fā)揮抗結核作用[3]。本研究通過動態(tài)監(jiān)測我國肺結核患者MTB臨床分離株對Bdq的藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)結果，了解耐藥情況，并分析耐藥相關基因，以為后續(xù)耐藥機制研究提供資料。

材料和方法

一、菌株來源

MTB菌株分離自來自NDIP(New Drug Introduction Protection)項目合作醫(yī)院的189例肺結核患者，其中，28例來自成都市公共衛(wèi)生臨床醫(yī)療中心，23例來自沈陽市胸科醫(yī)院，19例來自長沙市中心醫(yī)院，24例來自鄭州市第六人民醫(yī)院，23例來自首都醫(yī)科大學附屬北京胸科醫(yī)院，49例來自武漢市肺科醫(yī)院，23例來自黑龍江省傳染病防治院；130例患者僅提供基線(服用Bdq第1劑前1周內)培養(yǎng)陽性菌株，59例除提供基線菌株外還提供開始含Bdq方案治療后第2、4、8、12、16、20、24周時收集的培養(yǎng)陽性菌株。藥敏試驗陽性對照菌株(ATCC編號：27294)來自北京重大疾病臨床數據和樣本資源庫(結核病庫)。

二、主要試劑與儀器

商品化MTB凍干微孔板藥敏試驗試劑盒，為美國Thermo Fisher公司定制的CMP1BDQ 96孔藥敏試驗微孔板；藥敏試驗所用中性羅氏培養(yǎng)基購于珠海銀科醫(yī)學工程有限公司；藥敏試驗培養(yǎng)基所用7H9液體培養(yǎng)基粉及營養(yǎng)添加劑OADC均購自美國BD公司；菌株基因組DNA提取所用MasterPure Complete DNA and RNA Purification Kit試劑盒購自美國Lucigen公司；DH9-9272細菌培養(yǎng)箱購自上海一恒儀器有限公司。

三、研究方法

1.最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)：Bdq的MIC范圍為0.008～4 μg/ml，目前國際公認和推薦的體外藥敏試驗臨界藥物濃度為0.25 μg/ml[4]。菌株對Bdq的MIC沒有變化是指Bdq治療結束后分離菌株對Bdq的MIC與基線菌株對Bdq的MIC相比沒有改變，或變化僅為一個濃度梯度(即提高1倍)；Bdq在治療過程中敏感性降低定義為MIC值與基線相比升高不低于4倍，但MIC值尚未達到可以判斷“耐藥”的臨界藥物濃度；Bdq耐藥定義為Bdq的MIC升高達到了臨界藥物濃度(0.25 μg/ml)。微孔板法判斷MTB對各抗結核藥品耐藥的臨界MIC值見表1。

表1 微孔板法藥敏試驗檢測結核分枝桿菌對抗結核藥品耐藥的臨界MIC值

2.藥敏試驗：應用含12種預制凍干藥品的CMP1BDQ 96孔藥敏板進行藥敏試驗。從固體培養(yǎng)基上刮取新鮮菌落，將試驗用菌液比濁至0.5 麥氏單位后轉移 100 μl至7H9/OADC肉湯培養(yǎng)基試管，得到 1×105CFU/ml(范圍為 5×104～5×105CFU/ml)的接種液；將菌株接種于藥敏板上，使用封口黏附膜藥敏板，在35 ℃～37 ℃有氧環(huán)境下孵育7～14 d，檢查其生長情況。如果14 d后生長情況不好，重新繼續(xù)孵育藥敏板至21 d。應用微孔板藥敏分析儀 Vizion對藥敏板進行拍照并保存影像資料。藥敏試驗板設置陰性對照孔及陽性對照孔。

3.PCR擴增及測序：根據藥敏試驗結果，篩選對Bdq耐藥的MTB菌株及與耐藥菌株相關聯的來自同一患者的不同時期的菌株，運用試劑盒提取菌株DNA。配制50.0 μl反應體系：25 μl 2×MIX，18 μl ddH2O，正向、反向引物(10 μmol/L，引物序列見表2)各1.0 μl，DNA模板5.0 μl。擴增程序：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s 35個循環(huán)，52 ℃/58 ℃ 30 s 35個循環(huán)，72 ℃ 30 s 35個循環(huán)，4 ℃保存。制備1%質量濃度的瓊脂糖凝膠，取5 μl的PCR產物進行電泳，驗證目的條帶大小。將擴增成功的剩余PCR產物送北京睿博興科生物技術公司進行基因測序。運用BioEdit軟件將測序成功的序列與在美國國家生物信息中心(NCBI)上查得的標準序列進行比對分析。

表2 結核分枝桿菌對貝達喹啉耐藥基因擴增引物序列

四、統(tǒng)計學處理

采用SPSS 22.0軟件，計數資料采用“率(%)”表示，組間差異的比較采用χ2檢驗或Fisher精確概率法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、患者情況

189例患者中79例(41.8%)為廣泛耐藥結核病(XDR-TB)，57例(30.2%)為準廣泛耐藥結核病(Pre-XDR-TB)，15例(7.9%)為耐多藥結核病(MDR-TB)，25例(13.2%)單耐異煙肼或利福平，13例(6.9%)為藥物敏感。57例Pre-XDR-TB患者中，有53例(93.0%)對氟喹諾酮類藥品(氧氟沙星、左氧氟沙星、莫西沙星)耐藥，4例(7.0%)對阿米卡星、卡那霉素或卷曲霉素耐藥。

二、基線MIC分布及Bdq原發(fā)耐藥

1.基線菌株對Bdq的MIC：189例患者的基線MTB臨床分離株對Bdq的MIC分布如圖1所示。可以看出，Bdq對MTB具有較強的抑菌能力。86.2%(163/189)的基線菌株對Bdq的MIC值分布在0.06 μg/ml以下，MIC50和MIC90分別為0.03 μg/ml和0.12 μg/ml。

MIC：最小抑菌濃度

2.原發(fā)耐藥：以0.25 μg/ml作為Bdq臨界耐藥濃度，4例(2.1%，4/189)患者顯示原發(fā)對Bdq耐藥，其中，包括1例單耐異煙肼患者和3例XDR-TB患者。進一步分析4株Bdq原發(fā)耐藥菌株基線時對其他二線抗結核藥品的MIC，發(fā)現其中3株菌株基線時同時對Cfz耐藥，對氟喹諾酮類藥品也普遍耐藥，見表3。

表3 貝達喹啉原發(fā)耐藥菌株基線時對二線抗結核藥品的MIC分布(μg/ml)

三、Bdq治療過程中MIC的變化及獲得性耐藥

將59例具有基線后續(xù)陽性培養(yǎng)菌株患者所提供的系列菌株MIC進行對比分析，發(fā)現51例(86.4%)在治療期間對Bdq的MIC沒有變化[即治療結束時菌株對Bdq的MIC與基線MIC相比沒有改變，或變化僅為一個濃度梯度(即提高1倍)]，8例(13.6%)觀察到對Bdq敏感性降低。對Bdq敏感性降低患者中，5例的MIC升高達到了臨界藥物濃度(0.25 μg/ml)，包括1例在治療24周時痰培養(yǎng)結果顯示并發(fā)非結核分枝桿菌(NTM)感染，1例治療過程中丟失隨訪，其余3例(1.6%，3/189)即為接受規(guī)范治療后產生的獲得性耐藥。3例獲得性耐藥患者中，2例為XDR-TB、1例為Pre-XDR-TB。該3例在治療24周時痰培養(yǎng)結果仍為陽性，判斷為治療失敗。

四、Bdq與Cfz的交叉耐藥情況

189例患者對Bdq的耐藥率為2.1%(4/189)，明顯低于對Cfz的耐藥率(7.4%，14/189)，差異有統(tǒng)計學意義(Fisher精確概率法，P=0.006)。4例Bdq原發(fā)耐藥患者中，3例已經存在Cfz耐藥；14例Cfz耐藥患者中，3例(21.4%)發(fā)生了Bdq耐藥。3例Bdq獲得性耐藥的患者有2例同時存在Cfz耐藥。

五、Bdq耐藥基因突變分析

4例對Bdq原發(fā)耐藥的患者MTB分離株均檢測出Rv0678突變，未檢出atpE、pepQ和Rv1979c突變。3例Bdq獲得性耐藥患者MTB分離株均檢測出Rv0678突變，1株發(fā)生Rv1979c突變，未檢出pepQ和atpE發(fā)生突變的菌株。7株發(fā)生Rv0678突變的菌株中，有1株沒有在已經報道的Bdq耐藥相關位點發(fā)現基因突變。對Bdq敏感性降低的患者分離的3株菌株中有2株檢出Rv0678突變，1株檢出Rv1979c突變，未檢出atpE和pepQ突變菌株，且均發(fā)生在已經報道的Bdq耐藥相關位點(表4)。

表4 貝達喹啉耐藥或敏感性降低患者結核分枝桿菌分離株對貝達喹啉耐藥相關基因突變情況

討 論

Bdq是最近上市的具有特殊作用機制的抗結核新藥，其出現耐藥的情況備受關注。在患者治療過程中系統(tǒng)監(jiān)測Bdq耐藥性十分必要[5-6]。由本研究結果也可以看出，在無Bdq治療史的患者中，定期監(jiān)測Bdq的耐藥性尤為重要；同時，在使用Bdq進行規(guī)范治療的患者中，也需要定期監(jiān)測，以達到監(jiān)測療效的目的。本研究顯示，我國結核病患者對Bdq的耐藥目前處于較低水平，原發(fā)耐藥率為2.1%，與南非(2.3%)、俄羅斯(1.3%)、法國(2%)的報道類似[7-8]；而在治療過程中獲得性耐藥率約為1.6%，與南非、俄羅斯、蒙古等國及薈萃分析報道的獲得性耐藥率(2%～9%)比較，處于較低水平[6-7，9]。

本研究中4例Bdq原發(fā)耐藥患者和3例Bdq獲得性耐藥患者沒有發(fā)現可能影響治療結果的線索。在4例Bdq原發(fā)耐藥患者中，有1例為單耐異煙肼患者；而Bdq獲得性耐藥的3例患者中，2例為XDR-TB、1例為Pre-XDR-TB。因此，相對復雜的耐藥背景可能是發(fā)生Bdq獲得性耐藥的原因之一。盡管本研究發(fā)現的Bdq原發(fā)性耐藥和獲得性耐藥的患者數量有限，但也可以提示，比起原發(fā)耐藥，發(fā)生Bdq獲得性耐藥的患者可能更容易發(fā)生治療失敗。

盡管MTB對Bdq耐藥的產生機制尚并未完全明確，但目前已經了解的與Bdq耐藥相關的基因包括atpE、Rv0678和pepQ[7]。其中，atpE是編碼ATP合成酶的跨膜蛋白，是Bdq獨特的藥物作用靶點；而Rv0678則編碼調控藥物外排泵MmpS5/MmpL5系統(tǒng)的表達，該基因突變后會導致MmpS5/MmpL5外排泵的表達上調，從而降低了胞內的藥物濃度，進而降低Bdq的療效。pepQ通過阻止外排泵系統(tǒng)MmpS5/MmpL5蛋白的降解導致藥物外排的增多和胞內藥物濃度的降低[2，10-11]。關于MTB對Bdq與Cfz的交叉耐藥，有研究發(fā)現，患者既往服用Cfz有可能導致Bdq耐藥，因Bdq與Cfz具有相同的外排泵MmpS5/MmpL5系統(tǒng)，該外排泵的上調會導致耐藥的發(fā)生[12-13]。因此，MTB的Rv0678突變被認為是與Bdq和Cfz交叉耐藥相關[7]。Cfz目前被WHO推薦用于MDR-TB的治療，列為B組次選藥物的首位[14-15]。本研究中，對Bdq原發(fā)耐藥的菌株中絕大部分已經存在Cfz耐藥，提示我國患者對于Bdq的原發(fā)耐藥可能是由于Bdq和Cfz的交叉耐藥引起。此外，除上述3個普遍公認的與MTB對Bdq耐藥相關的基因外，同樣與外排泵表達相關的Rv1979c也被認為與MTB對Cfz耐藥相關；也有報道認為其突變與MTB對Bdq低度耐藥相關[16]。本研究所納入患者分離的Bdq耐藥菌株的Rv1979c突變均發(fā)生在已經報道的耐藥相關位點；而發(fā)生Rv0678突變株中，有1株耐藥菌在已經報道的耐藥相關位點之外發(fā)生突變，提示MTB對Bdq的耐藥可能存在其他機制，需進一步研究。

本研究存在一定的局限性。首先，由于本研究數據是針對臨床患者分離菌株的實驗室研究，未設置對照組，存在一定的患者選擇偏倚。第二，本研究所進行的MIC檢測及其他實驗，均沒有進行重復驗證，可能存在系統(tǒng)誤差。第三，世界衛(wèi)生組織相關指南建議使用BACTEC MGIT 960檢測MTB對Bdq的耐藥，但本研究使用的是微孔板稀釋法，方法學的差異可能造成檢測結果存在偏差。