李敏蘭，王瑞生

(1．河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院藥學(xué)部； 2.河南中醫(yī)藥大學(xué), 鄭州 450000)

四物湯是中藥的經(jīng)典方劑之一，由熟地、當(dāng)歸、白芍和川芎四味藥配伍而成，是從《金匱要略》中的芎歸膠艾湯中減去阿膠、艾葉、甘草而成，僅有熟地黃12 g、當(dāng)歸12 g、川芎8 g和白芍10 g組成。最早見(jiàn)于《仙授理傷續(xù)斷秘方》，用于治療外傷淤血作痛; 宋代《太平惠民和劑局方》亦有收錄，用于治療婦人諸疾。本方治營(yíng)血虛滯證，方中熟地甘溫味厚質(zhì)潤(rùn)，入肝、腎經(jīng)，為補(bǔ)血要藥，故為君藥。當(dāng)歸甘辛溫，歸肝、心、脾經(jīng)，為補(bǔ)血良藥，兼具活血作用，且為養(yǎng)血調(diào)經(jīng)要藥，故為臣藥。佐以白芍養(yǎng)血益陰；川芎活血行氣。四藥配伍，共奏補(bǔ)血調(diào)血之功[1]。近年來(lái)，對(duì)四物湯質(zhì)量的研究方面已有文獻(xiàn)[2-5]報(bào)道，但不完善。

四物湯是傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)補(bǔ)血的代表方劑，具有補(bǔ)血調(diào)血功效。方中藥物的有效成分比較明確，便于含量測(cè)定。在傳統(tǒng)經(jīng)方基礎(chǔ)上，以中醫(yī)藥理論為指導(dǎo)，對(duì)傳統(tǒng)湯劑進(jìn)行劑型改革，并最大限度地保持原湯劑的成分，以水為提取溶劑，運(yùn)用現(xiàn)代生產(chǎn)設(shè)備，將四物湯制成顆粒劑，該劑型克服了傳統(tǒng)湯劑煎煮、攜帶、服用、貯存不便等缺點(diǎn)，具有質(zhì)量可控、藥材利用率高等特點(diǎn)[6-7]。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)同時(shí)測(cè)定四物湯顆粒劑、配方顆粒劑和傳統(tǒng)湯劑中5-羥甲基糠醛、阿魏酸、毛蕊花糖苷的含量，分析其成分含量的差異性，結(jié)合四物湯標(biāo)準(zhǔn)湯劑的研究，進(jìn)一步考察四物湯顆粒劑、配方顆粒劑各項(xiàng)指標(biāo)的合理性與可行性，為四物湯的臨床應(yīng)用和工業(yè)化生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

YP10002電子天平(上海衡際科學(xué)儀器有限公司)，SECURA225D-1CN萬(wàn)分之一天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)，電磁爐，H-1600臺(tái)式高速離心機(jī)(上海利鑫堅(jiān)離心機(jī)有限公司)，Waters 2487高效液相。熟地黃(批號(hào)：201811W-S2)、當(dāng)歸(批號(hào)：180413)、白芍(批號(hào)：180508H)、川芎(批號(hào)：180416)，上述藥材均購(gòu)于河南中原正信藥行。按《中國(guó)藥典》2015年版[8]相關(guān)藥材項(xiàng)下要求進(jìn)行檢測(cè)，均符合要求。5-羥甲基糠醛、阿魏酸對(duì)照品(成都普思生物科技股份有限公司，批號(hào)：PS020078、PS000828)、毛蕊花糖苷對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110773-201806)。水為自制超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 四物湯顆粒劑、配方顆粒劑及傳統(tǒng)湯劑制備

2.1.1 四物湯顆粒劑前期 根據(jù)處方來(lái)源，選擇水為溶劑，以5-羥甲基糠醛、芍藥苷、毛蕊花糖苷成分含量及出膏率為指標(biāo)[9]，通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)選提取工藝。按處方配比稱取藥材(熟地黃60 g、當(dāng)歸60 g、白芍50 g與川芎40 g)，減壓濃縮噴霧干燥處理，得顆粒劑(浸膏)得顆粒劑樣品。

2.1.2 配方顆粒劑 分別稱取(熟地黃60 g、當(dāng)歸60 g、白芍50 g與川芎40 g)，根據(jù)配方顆粒制備工藝[9]分別制備熟地黃、當(dāng)歸、川芎、白芍浸膏，將制得的4個(gè)單味藥浸膏混勻，得配方顆粒劑(浸膏)水?dāng)嚢枋谷芙猓鋮s后加水定容至1 L，得配方顆粒樣品。

2.1.3 傳統(tǒng)湯劑 稱取處方(熟地黃60 g、當(dāng)歸60 g、白芍50 g與川芎40 g)藥材，篩網(wǎng)過(guò)濾，合并煎液，加水定容至1 L，得傳統(tǒng)湯劑樣品。

2.2 色譜條件

2.2.1 流動(dòng)相及流動(dòng)相比例的選擇[2]以乙腈-0.1%磷酸水梯度洗脫: 0～20 min，乙腈5%→10%；20～30 min，乙腈10%→13%；30～40 min，乙腈為 13%→20%；40～45 min，乙腈為20%；45～65 min，乙腈為 20%→45%為流動(dòng)相；柱溫35 ℃。

2.2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 對(duì)5-羥甲基糠醛進(jìn)行紫外全波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)其在283 nm下吸收度最高，而阿魏酸和毛蕊花糖苷的吸收峰相對(duì)降低，比較不同波長(zhǎng)280、290、275 nm，綜合結(jié)果顯示，在290 nm波長(zhǎng)下樣品色譜中5-羥甲基糠醛、阿魏酸和毛蕊花糖苷分離最好，且吸收度相對(duì)較高，故選取290 nm為最佳波長(zhǎng)。

2.2.3 優(yōu)選色譜條件色譜柱 ZORBAX SB-C18 (4.6 mm×250.0 mm，5-Micron)；二極管陣列檢測(cè)器；流速1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)290.0 nm[8]；柱溫35.0 ℃。

2.3 對(duì)照品溶液制備 分別稱取5-羥甲基糠醛0.09 mg、阿魏酸0.09 mg、毛蕊花糖苷0.48 mg的標(biāo)準(zhǔn)品，置于5 mL容量瓶中，加色譜甲醇至刻度，搖勻，制得濃度分別為5-羥甲基糠醛0.02 mg·mL-1、阿魏酸0.02 mg·mL-1、毛蕊花糖苷0.10 mg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

2.4 供試品溶液制備 吸取四物湯湯劑、四物湯配方顆粒、四物湯顆粒樣品各4 mL，加入甲醇6 mL，放置2 h，超聲處理20 min，取出，放冷，離心，取上清液置10 mL量瓶中，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)60%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.5 線性關(guān)系考察 取上述混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液適量過(guò)0.45 μm微孔濾膜，分別進(jìn)樣2、5、8、10、12、14、16、20 μL按上述條件進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定其各自峰面積。做出對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，y表示高效液相測(cè)定的峰面積，x表示各有效成分的質(zhì)量。得線性回歸方程分別為y=11 289 841.0 x+41 127.2(r=0.999 9)、y=3 231 605.7x +11 970.0(r=0.999 9)、y=946 844.0x+10 418.0(r=0.999 9),線性范圍分別為0.036～0.357，0.035～0.350，0.192～1.192 μg。

2.6 精密度 取混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)得峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)分別為5-羥甲基糠醛2.69%、阿魏酸1.55%、毛蕊花糖苷1.64%，表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性 取同一樣品每隔一段時(shí)間進(jìn)樣1次,測(cè)得RSD分別為5-羥甲基糠醛2.64 %、阿魏酸1.81%、毛蕊花糖苷2.76%。表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性 取同一批樣品,按供試品溶液的制備方法平行制備5份，分別進(jìn)樣，RSD分別為5-羥甲基糠醛2.92%，阿魏酸2.35%，毛蕊花糖苷2.86%，結(jié)果證明重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 設(shè)計(jì)3組不同濃度樣品進(jìn)行加樣回收實(shí)驗(yàn)，按表1分別精密量取3組合煎樣品液和不同標(biāo)準(zhǔn)品加入5 mL容量瓶中，每組3份，用甲醇定容于至刻度線，分別精密吸取各樣品溶液20 μL,注入液相色譜儀測(cè)定含量，平均回收率從高到低依次為阿魏酸、5-羥甲基糠醛，毛蕊花糖苷，回收率良好。見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

2.10 樣品中5-羥甲基糠醛、阿魏酸和毛蕊花糖苷含量測(cè)定 吸取供試品溶液至進(jìn)樣瓶，設(shè)定進(jìn)樣量為10 μL，進(jìn)樣、測(cè)定。見(jiàn)表2、圖1。

表2 不同劑型中指標(biāo)成分含量測(cè)定(n=3)

圖1 不同劑型中指標(biāo)成分含量測(cè)定

3 討論

隨著中藥免煎顆粒劑藥效學(xué)逐漸被肯定以及在臨床上的大量應(yīng)用，其質(zhì)量控制成為當(dāng)前面臨的主要問(wèn)題。本研究比較了四物湯顆粒劑、配方顆粒劑和傳統(tǒng)湯劑中5-羥甲基糠醛、阿魏酸、毛蕊花糖苷的含量，所用藥材均為同一批次藥材，以排除由于藥材不均一對(duì)結(jié)果的影響?？疾鞎r(shí)按照相對(duì)應(yīng)處方量制成，更接近臨床用藥形式，與傳統(tǒng)湯劑比較也可以消除由于溶劑的改變而造成的差異。在確保原料、工藝及規(guī)格一致的情況下建立的特征圖譜，能有效地控制中藥配方顆粒的質(zhì)量[10-13]。

本研究制得的四物湯顆粒劑、配方顆粒劑及傳統(tǒng)湯劑的平均質(zhì)量濃度之和分別為19.42、16.00、11.95 mg·ml-1，四物湯顆粒劑是傳統(tǒng)湯劑的1.6倍，而配方顆粒劑是傳統(tǒng)湯劑的1.3倍，說(shuō)明不同制備方法對(duì)總體含量影響較大，主要原因是飲片湯劑采用傳統(tǒng)煎煮制備法，受到煎煮時(shí)間、次數(shù)、加水量、對(duì)火候控制等諸多因素影響，導(dǎo)致其有效成分溶出量受其影響波動(dòng)較大，而四物湯顆粒劑在制備時(shí)提取工藝經(jīng)過(guò)優(yōu)選，主要成分轉(zhuǎn)移率高，所以含量略高，且保證了藥品質(zhì)量的穩(wěn)定性[14]。與其他文獻(xiàn)[10]只作兩種劑型比較，本研究將四物湯顆粒劑、配方顆粒劑及傳統(tǒng)湯劑三種劑型放在同一條件下比較，更能突出新劑型改變的優(yōu)勢(shì)，為臨床應(yīng)用提供更多的理論依據(jù)。

四物湯為中藥復(fù)方，其按照中醫(yī)功效協(xié)同作用發(fā)揮療效，個(gè)別化學(xué)成分含量指標(biāo)仍較難顯示其質(zhì)量?jī)?yōu)劣，必須再結(jié)合藥理藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)和臨床應(yīng)用研究才能進(jìn)行全面系統(tǒng)的比較[15-17]。王今鳳等[18]對(duì)中藥配方顆粒的藥效學(xué)進(jìn)行綜述，發(fā)現(xiàn)中藥配方顆粒具有某種有效藥理效應(yīng)，并且在某些藥理作用上代替?zhèn)鹘y(tǒng)飲片是可行的。本研究對(duì)四物湯顆粒劑、配方顆粒劑與傳統(tǒng)湯劑的質(zhì)量是否一致的問(wèn)題進(jìn)行了研究，為這些劑型在臨床上的使用提供了依據(jù)，具有較強(qiáng)的臨床實(shí)際指導(dǎo)意義，同時(shí)也為四物湯顆粒劑、配方顆粒劑的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和改進(jìn)提供了較好的數(shù)據(jù)和參考。