藺文燕，田利民，狄寶山，余 靜，牛想娥，張 琦△，劉 靜△

（1甘肅省人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，2甘肅省人民醫(yī)院西院區(qū)，甘肅蘭州 730000）

隨著肥胖和糖尿病發(fā)病率的增加，非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcohol fatty liver disease，NAFLD）成為威脅人類健康最常見的慢性肝病之一，也是21 世紀全球重要的公共健康問題之一［1-2］。研究統(tǒng)計，亞洲普通人群中NAFLD 的患病率為25%［3］，在肥胖人群中為57.5%～74.0%，約15%～50%的肝纖維化和肝硬化與NAFLD 有關(guān)［4］，脂肪肝纖維化患者中約30%于10 年后可發(fā)展為肝硬化，進一步導致肝癌［5-7］。以往的研究多集中在NAFLD 的血清學及藥物方面，而NAFLD 的發(fā)病機制研究較少。因此，體外成功構(gòu)建NAFLD 的動物模型對于研究疾病的發(fā)生、發(fā)展及防治十分重要［5］。

肝竇內(nèi)皮細胞（liver sinusoidal endothelial cells，LSECs）功能紊亂是NAFLD 形成的早期階段［8-10］。分揀蛋白（sortilin）由SORT1基因編碼［11-12］，屬于Vps10P 域受體家族一員，廣泛分布于腦、肝、脂肪和神經(jīng)等組織及相關(guān)細胞，參與多種蛋白的胞內(nèi)外分泌與轉(zhuǎn)運、細胞凋亡和生存及信號轉(zhuǎn)導等［13-14］。全基因組關(guān)聯(lián)分析（genome-wide association study，GWAS）運用無偏倚的工具研究表明，sortilin 與低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）的降低密切相關(guān)［15-16］，但對以甘油三酯（triglyceride，TG）和低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）升高為特征的脂質(zhì)代謝紊亂的NAFLD［17-19］的相關(guān)報道尚少。本研究結(jié)合動物和細胞實驗，探討磷酸化細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（phosphorylated extracel?lular signal-regulated kinase，p-ERK）下調(diào)sortilin 表達與NAFLD肝損傷形成的機制，為NAFLD的防治提供實驗依據(jù)。

材料和方法

1 實驗動物

40 只8 周齡雄性的SPF 級Wistar 大鼠（180～220 g），由甘肅中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供［生產(chǎn)許可證號為SCXK（甘）2019-0002，動物倫理批準號為syll20160031］，實驗室適應性喂養(yǎng)1 周，大鼠自由進水，標準飼料喂養(yǎng)。

2 主要試劑

油紅O（oil red O，ORO）染色試劑盒（細胞專用）、氧化型低密度脂蛋白（oxidized low-density lipo?protein，ox-LDL）和基底膜六胺銀染色試劑盒由北京索萊寶科技有限公司提供；內(nèi)皮細胞生長因子（endo?thelial cell growth factor，ECGF）由不倫瑞克公司提供；膠原酶Ⅱ由Sigma提供；兔抗sortilin抗體、兔抗p-ERK 抗體、兔抗CD31 和β-actin 抗體由Abcam 提供；PD98059由Selleck提供；引物由TaKaRa合成；Annex?inⅤ-FITC凋亡檢測試劑盒由BD提供；ELISA 試劑盒由上海卒瑞生物科技有限公司提供；DAB 顯色試劑盒購于北京中杉金橋有限公司提供。

3 主要儀器

YD-315 切片機、YD-AB 生物組織攤烤片機和YD-6L 生物組織冷凍包埋機（金華市益迪醫(yī)療設備有限公司）；熒光倒置顯微鏡（OLYMPUS）；凝膠圖像分析系統(tǒng)和實時熒光定量PCR 儀（BIO-RAD）；酶標儀（TECAN）；流式細胞儀（Becton Dickinson）。

4 動物實驗方法

4.1 NAFLD 大鼠模型的建立 40 只大鼠適應性喂養(yǎng)1 周后，隨機分為對照（control）組（n=10）、高脂飲食（high-fat diet，HFD）組（n=10）、PD98059 組（n=10）和HFD+PD98059 組（n=10）。本課題組前期研究表明高脂飼料（基礎飼料73.6%，豬油15%，膽固醇1.2%，膽酸鈉0.2%和蛋黃粉10%）喂養(yǎng)可成功建立NAFLD 大鼠模型［20］，因此本研究采用高脂飼料喂養(yǎng)建立NAFLD 大鼠模型。同時，PD98059 組和HFD+PD98059 組給予腹腔注射PD98059（10 mg/kg），con?trol 組及HFD 組給予腹腔注射等量的檸檬酸鈉緩沖液［21］。

4.2 標本處理和指標檢測 干預6 周后，禁食不禁水12 h，次日上午稱重、麻醉、摘眼球取血，并迅速取出肝臟，用預冷的生理鹽水清洗肝臟表面，稱取肝臟濕重，按常規(guī)制備血清和肝組織石蠟切片備用。血清脂質(zhì)指標［總膽固醇（total cholesterol，TC）、TG、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholester?ol，HDL-C）和LDL-C］及肝功能指標［丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）］按照試劑盒說明方法檢測；血清白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）用ELISA 法檢測；肝組織石蠟切片用于HE 染色和免疫組化；六胺銀染色按照試劑盒說明方法檢測。肝臟指數(shù)（%）=肝臟濕重（g）/體重（g）×100%。

5 細胞實驗方法

5.1 原代LSECs 的提取、培養(yǎng)及鑒定 按照參考文獻［22-25］及本課題組前期研究［26］的方法提取大鼠的LSECs。將LSECs 培養(yǎng)于含有內(nèi)皮細胞生長因子（endothelial cell growth factor，ECGF）的低糖型完全培養(yǎng)液中，把細胞放進CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（培養(yǎng)參數(shù)：潮濕的空氣，5% CO2，37℃），根據(jù)細胞形態(tài)、融合度及培養(yǎng)液顏色換液傳代。細胞隨機分為對照（con?trol）組、ox-LDL（100 mg/L）組、PD98059（10 μmol/L）組和ox-LDL+PD98059（100 mg/L ox-LDL+10 μmol/L PD98059）組進行后續(xù)實驗。Anti-CD31 免疫熒光染色鑒定LSECs。

5.2 細胞免疫熒光實驗 將細胞按1×107/L 的密度接種至含有蓋玻片的6 孔板上，待細胞鋪滿蓋玻片時，將蓋玻片放入100 mm的細胞培養(yǎng)皿中，用預冷的PBS 浸洗3 次，4%的多聚甲醛固定爬片20 min，PBS浸洗3 次，預冷的0.2% Triton X-100 室溫通透10 min，PBS浸洗3次，在爬片上滴加山羊血清，室溫封閉1 h，棄封閉液，每張玻片加入適量的Anti-CD31 抗體（1∶500）并放入濕盒，4℃孵育過夜；次日取出濕盒中的爬片，PBS 清洗3 次，滴加熒光Ⅱ抗（Anti-FITC，1∶300），濕盒孵育2 h，PBS 清洗3 次，暗處滴加DAPI 避光孵育5 min染核，PBS清洗4次，用抗熒光淬滅劑的封片劑封片，然后在熒光顯微鏡下采集圖像。

5.3 ORO 染色和LSECs 凋亡的檢測 ORO 染色和流式細胞術(shù)根據(jù)ORO 染色（細胞專用）試劑盒和An?nexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒的方法進行操作。

5.4 RT-qPCR 和Western blot 實驗 RT-qPCR 檢測時分別根據(jù)總RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、擴增試劑盒說明書進行RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄和擴增，檢測各組細胞RNA 的表達；Western blot 檢測時依次按照提取蛋白、蛋白濃度測定、配制凝膠、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、免疫反應和化學發(fā)光的步驟進行。RT-qPCR 引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1.Sequences of the primers for RT-qPCR

6 統(tǒng)計學處理

實驗結(jié)果用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計學分析，以均數(shù)±標準差（mean±SD）的形式表示。單因素方差分析用于多組間比較。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。每次實驗至少重復進行3次。

結(jié)果

1 高脂喂養(yǎng)對大鼠體重、血脂、肝功能和肝臟指數(shù)的影響

干預6 周后，與control 組相比，HFD 組和HFD+PD98059 組大鼠體重升高（P＜0.05），血清TC、TG、LDL-C、AST 和ALT 水平升高（P＜0.05），HDL-C 水平降低（P＜0.05），肝臟指數(shù)升高（P＜0.05），PD98059組上述各指標無顯著變化（P＞0.05）；與HFD 組相比，PD98059 組和HFD+PD98059 組大鼠體重降低（P＜0.05），血清TC、TG、LDL-C、AST和ALT水平降低（P＜0.05），HDL-C水平升高（P＜0.05），肝臟指數(shù)降低（P＜0.05）；與PD98059 組相比，HFD+PD98059 組大鼠體重升高（P＜0.05），血清TC、TG、LDL-C、AST和ALT水平升高（P＜0.05），HDL-C水平降低（P＜0.05），肝臟指數(shù)升高（P＜0.05），見表2。

表2 大鼠體重、血脂、肝功能和肝臟指數(shù)的比較Table 2.Comparison of body weight，blood lipids，liver function and liver index in rats（Mean±SD. n=10）

2 大鼠血清炎癥因子IL-6和TNF-α表達的變化

與control 組相比，HFD 組和HFD+PD98059 組IL-6 和TNF-α 表達水平升高（P＜0.05），PD98059 組無顯著變化（P＞0.05）；與HFD組相比，PD98059組和HFD+PD98059 組IL-6 和TNF-α 表達水平降低（P＜0.05）；與PD98059 組相比，HFD+PD98059 組IL-6 和TNF-α表達水平升高（P＜0.05），見圖1。

Figure 1.The serum levels of IL-6 and TNF-α in rats.Mean±SD. n=10.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs HFD group；△P＜0.05 vs PD98059 group.圖1 大鼠血清IL-6和TNF-α水平的變化

3 大鼠肝組織病理形態(tài)學的變化

HE 染色表明，control 組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細胞結(jié)構(gòu)清晰，圍繞中央靜脈呈放射狀排列分布，細胞內(nèi)無脂滴形成，細胞核位于細胞中央，細胞質(zhì)均勻，無脂肪變性；HFD 組大鼠肝小葉排列松散、紊亂，肝細胞內(nèi)可見大小不等的氣球樣脂肪空泡，呈現(xiàn)顯著的脂肪變性，胞質(zhì)內(nèi)充滿脂滴，炎癥細胞彌散浸潤在脂肪樣變肝組織中；PD98059 組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，無脂滴、脂肪變性和炎癥細胞浸潤；HFD+PD98059組較高脂組有略少的脂滴形成和炎癥細胞浸潤，脂肪變性減少，細胞內(nèi)可見少許脂滴。免疫組化染色表明，與control 組相比，HFD 組p-ERK 蛋白水平升高，PD98059 組和HFD+PD98059 組p-ERK 蛋白水平降低，而HFD組和HFD+PD98059組sortilin蛋白水平降低，PD98059 組sortilin 蛋白水平無顯著變化；與HFD 組相比，PD98059 組和HFD+PD98059 組p-ERK蛋白水平降低，sortilin 蛋白水平升高；與PD98059 組相比，HFD+PD98059 組p-ERK 蛋白水平無顯著變化，sortilin 蛋白水平降低。六胺銀染色表明，control組肝組織結(jié)構(gòu)完整，肝組織連續(xù)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)與肝索平行；HFD 組肝竇基底膜和竇間隙增厚，可見大片銀顆粒沉積和肝細胞脂肪變性；PD98059 組肝組織結(jié)構(gòu)與control 組無顯著變化；HFD+PD98059 組肝竇基底膜有銀顆粒沉積，肝細胞脂肪變性程度較高脂組減輕。見圖2。

4 LSECs的培養(yǎng)和鑒定

LSECs 從control 組大鼠肝臟分離出來，倒置相差顯微鏡下觀察：細胞邊緣清晰，胞核位于中央，形態(tài)飽滿，似多邊形或梭形，大小均勻呈“鵝卵石”樣生長，細胞間緊密靠攏，見圖3A。Anti-CD31 免疫熒光染色表明，90%的細胞免疫熒光染色陽性，DAPI 染核藍色，表明CD31表達于LSECs上，見圖3B。

5 ORO染色和流式細胞術(shù)結(jié)果

ORO 染色表明，control 組LSECs 內(nèi)有少量的脂滴，表明細胞間脂滴含量低；ox-LDL 組LSECs 內(nèi)可看到大量紅色脂滴；PD98059 組LSECs 內(nèi)有極少量脂滴；ox-LDL+PD98059 組LSECs 脂滴較ox-LDL 組減少。流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，control 組細胞的凋亡率為6.65%；ox-LDL 組細胞的凋亡率為12.14%，較control 組顯著升高（P＜0.05）；PD98059 組細胞的凋亡率為3.41%，ox-LDL+PD98059 組細胞的凋亡率為10.83%，均較ox-LDL 組顯著降低（P＜0.05），見圖4。

6 LSECs中sortilin和p-ERK的表達水平

Figure 2.Pathomorphological changes of rat livers（scale bar=50 μm）.A：control group；B：HFD group；C：PD98059 group；D：HFD+PD98059 group.圖2 大鼠肝組織病理形態(tài)學的變化

Figure 3.Morphological changes（A）and CD31 expression（B）in the LSECs observed under fluorescence microscope（scale bar=20 μm）.圖3 熒光顯微鏡下LSECs的形態(tài)和CD31的表達

Western blot 和RT-qPCR 結(jié)果顯示，與control 組相比，ox-LDL 組p-ERK 蛋白水平顯著升高（P＜0.05），PD98059 組和ox-LDL+PD98059 組p-ERK 蛋白水平顯著降低（P＜0.05），sortilin 蛋白和mRNA 水平亦顯著降低（P＜0.05），而PD98059 組sortilin 蛋白及mRNA 水平無顯著變化（P＞0.05）；與ox-LDL 組相比，PD98059 組和ox-LDL+PD98059 組p-ERK 蛋白水平顯著降低（P＜0.05），而sortilin 蛋白和mRNA 水平顯著升高（P＜0.05）；與PD98059 組相比，ox-LDL+PD98059 組p-ERK 蛋白水平無顯著變化（P＞0.05），sortilin 蛋白及mRNA 水平顯著降低（P＜0.05），見圖5。

討論

NAFLD是以肝臟脂肪變性和脂肪蓄積為特征的脂質(zhì)代謝紊亂性疾病，炎癥反應和細胞凋亡等因素在其中發(fā)揮重要作用［27］。高脂飼料喂養(yǎng)的動物模型是目前常用的NAFLD動物模型，它模擬了NAFLD的發(fā)生發(fā)展和病變特征［5，20］。LDL 是一種運載膽固醇進入外周組織細胞的脂蛋白顆粒，當其被氧化成為ox-LDL 時可引起血管硬化和NAFLD 等相關(guān)疾?。?8］。LDL-C 是反映全身的脂代謝狀態(tài)的標志之一，血管內(nèi)積聚的LDL-C 一旦超過了肝臟存儲的極限能力，將會產(chǎn)生毒性作用，導致肝損傷和功能障礙［28］。AST和ALT 是分布在肝細胞內(nèi)最常用的評估肝功能和肝損傷的指標，其升高程度與肝細胞受損程度一致。如果肝臟發(fā)生損傷，肝細胞中的轉(zhuǎn)氨酶便進入血液，血液中AST 和ALT 水平升高，是肝臟疾病提示信號［29］。本實驗中高脂模型大鼠血清AST 和ALT 水平升高，PD98059干預后，其水平降低。

目前“二次打擊”學說是NAFLD 的機制假說之一，其認為脂質(zhì)在肝細胞的聚集（第1 次打擊）后觸發(fā)一系列細胞毒素反應（第2 次打擊），導致肝損傷是NAFLD 的重要機制［30-31］，因此脂質(zhì)代謝的調(diào)控是預防和逆轉(zhuǎn)NAFLD 發(fā)生、發(fā)展的有效手段，尤其是降低血清LDL-C。本研究表明，PD98059 干預后，能夠顯著降低NAFLD 模型大鼠TC、TG 和LDL-C 水平，同時升高HDL-C 水平，提示PD98059 能夠通過減輕“第1次打擊”預防及逆轉(zhuǎn)NAFLD 的發(fā)生。本研究還發(fā)現(xiàn)，PD98059 干預后，大鼠肝臟組織sortilin 蛋白及mRNA SORT1 的表達上調(diào)，同時IL-6 和TNF-α 的表達顯著下調(diào)，說明此干預抑制炎癥因子釋放的同時能夠顯著上調(diào)肝臟組織sortilin 蛋白及mRNA 的表達，為減輕NAFLD“第2次打擊”提供了客觀依據(jù)。

Figure 4.Oil red O（ORO）staining（scale bar=20 μm）and determination of apoptosis rate in LSECs by flow cytometry.A：control group；B：ox-LDL group；C：PD98059 group；D：ox-LDL+PD98059 group.圖4 油紅O染色和流式細胞術(shù)測定LSECs凋亡率

Figure 5.The expression of sortilin and the protein level of p-ERK detected by Western blot and RT-qPCR.A：the protein levels of sortilin and p-ERK detected by Western blot；B：the mRNA expression of sortilin detected by RT-qPCR.Mean±SD. n=10.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs ox-LDL group；△P＜0.05 vs PD98059 group.圖5 Western blot和RT-qPCR檢測sortilin表達及p-ERK蛋白水平

sortilin 是體內(nèi)調(diào)控脂質(zhì)轉(zhuǎn)錄與合成的關(guān)鍵因子，作為LDL 的細胞表面清除受體，其通過與載脂蛋白ApoB 的結(jié)合調(diào)控LDL 分泌，并將其導向細胞表面分泌或降解［32-34］，從而參與脂質(zhì)顆粒的形成及轉(zhuǎn)運過程［15-16］。ERK 是將信號從表面受體傳至細胞核的關(guān)鍵細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶［35］，可接受上游的級聯(lián)反應信號刺激（如ox-LDL）轉(zhuǎn)化為p-ERK 進入細胞核，活化細胞核內(nèi)的某些轉(zhuǎn)錄因子，進而參與細胞的調(diào)控及增殖等［36-37］。在本實驗中，高脂條件下sortilin表達下調(diào)，p-ERK 表達上調(diào)，PD98059 抑制p-ERK 后，sor?tilin 表達上調(diào)，p-ERK 表達下調(diào)，PD98059 可以逆轉(zhuǎn)sortilin 的表達，且sortilin 的mRNA 表達水平呈同等趨勢改變，提示ERK 信號通路的激活可能是sortilin調(diào)節(jié)NAFLD 形成的途徑之一，PD98059 通過ERK 信號轉(zhuǎn)導抑制高脂血癥小鼠的肝脂肪形成和脂肪變性。因此抑制肝臟內(nèi)p-ERK 的活性（PD98059），上調(diào)sortilin 的表達，可能促進脂質(zhì)代謝，預防NAFLD的形成和炎癥反應。血漿中增加的ox-LDL 被認為是脂積累和LSECs 凋亡的誘導劑［38-39］，本實驗中，高脂條件下，LSECs 的凋亡增加，PD98059 干預后，LSECs 的凋亡降低，提示高脂在引起細胞凋亡過程中有重要作用。

綜上所述，ox-LDL 激活p-ERK 信號通路下調(diào)肝組織sortilin 的表達，PD98059 干預后，sortilin 表達上調(diào)且p-ERK、TNF-α 和IL-6 表達下調(diào)，同時大鼠肝臟損傷、脂質(zhì)蓄積、脂肪變性、炎癥反應和細胞凋亡得到顯著改善，其機制可能與sortilin 增強肝功能和降低脂質(zhì)氧化水平帶來的毒性反應有關(guān)。