張?zhí)鹛?，項楚涵，?勇△，馬禮坤，張步春，△

（1徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院心內(nèi)科，江蘇徐州 221000；2中國科學技術大學附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科，安徽合肥 230001）

動脈粥樣硬化是一種慢性炎癥性疾病，巨噬細胞在其發(fā)病的各個階段發(fā)揮十分關鍵的作用。巨噬細胞按照其表型和分泌的細胞因子可分為兩大類，即M1 型巨噬細胞（經(jīng)典活化型，促進動脈粥樣硬化的進展）和M2型巨噬細胞（替代活化型，延緩動脈粥樣硬化的發(fā)展進程）［1］。盡管學術界已經(jīng)認識到巨噬細胞極化狀態(tài)與動脈粥樣硬化的緊密關系，但其調(diào)控機制一直不清楚，其原因是巨噬細胞極化的信號調(diào)控是一個復雜的網(wǎng)絡體系。雖然既往已有研究顯示脂質(zhì)代謝物參與調(diào)控巨噬細胞亞型的功能［2-4］，然而，在這些研究中所使用的細胞系和細胞處理方式不同，所得的實驗結果也不完全一致。因此，有必要運用脂質(zhì)組學技術進一步篩選M1 型巨噬細胞極化過程中特異性脂質(zhì)含量變化。

本研究應用非靶向脂質(zhì)組學技術研究體外環(huán)境下脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）/干擾素γ（inter?feron-γ，IFN-γ）作用于RAW264.7 巨噬細胞后，其分泌的脂質(zhì)代謝物含量的變化。通過差異表達脂質(zhì)分子代謝通路分析，篩選與M1型巨噬細胞極化相關的關鍵信號通路，為動脈粥樣硬化發(fā)病機制提供新的研究思路和理論依據(jù)。

材料和方法

1 主要試劑

DMEM 高糖培養(yǎng)基（HyClone）；胎牛血清（WISENT）；LPS（Sigma）；IFN-γ（Peprotech）；兔抗CD86 抗體（Biolegend）；兔抗誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）抗體和兔抗GAPDH 抗體（Affinity）；乙腈、異丙醇和甲醇（Thermo Fisher）。

2 細胞培養(yǎng)

小鼠巨噬細胞RAW264.7 購自中國科學院上海細胞庫。細胞在含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基、溫度為37 ℃、含5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞融合到70%～80%時用于后續(xù)實驗。使用100 μg/L LPS 和20 μg/L IFN-γ 處理RAW264.7細胞24 h誘導M1型巨噬細胞。

3 方法

3.1 Western blot 法檢測蛋白表達 收集細胞后裂解細胞，BCA 蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度。蛋白樣品電泳分離后半干轉。在室溫下用5%脫脂牛奶封閉NC膜1 h，加入Ⅰ抗在4 ℃冰箱中孵育過夜。第2天加入Ⅱ抗在室溫下孵育1 h。通過增強化學發(fā)光系統(tǒng)顯示條帶。

3.2 流式細胞術 將處理后的RAW264.7 細胞（1×106）收集到EP管中。洗清殘余培養(yǎng)基后加入熒光標記的抗體CD86-FITC（Biolegend）在4℃冰箱中孵育30 min，PBS 洗掉游離抗體。最后用100 μL PBS 溶液重懸后，經(jīng)流式細胞儀檢測。

3.3 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術（liquid chromatogra?phy-tandem mass spectrometry，LC-MS）非靶向脂質(zhì)組學檢測 按每個樣本中加入200 μL 的PBS、40 μL預冷的色譜級甲醇和800 μL MTBE 提取脂質(zhì)，每加入一種試劑時都需渦旋混合，用超聲破碎機超聲20 min，室溫放置0.5 h，14 000×g、10℃離心15 min，取上層有機相，氮氣吹干，如需長期保存，需存放于-80℃冰箱。用Q ExactiveTMplus 質(zhì)譜儀（Thermo Sci?entific）和UHPLC Nexera LC-30A（SHIMADZU）對脂質(zhì)樣品進行分析。流動相A 相為乙腈-水（6∶4，v/v）、0.1% 甲酸、0.1 mmol/L 氨甲酸鹽；B 相為乙腈-異丙醇（1∶9，v/v）與0.1%甲酸和0.1 mmol/L 氨基甲酸鹽。液相色譜洗脫梯度為：0～2 min，30% B；2～25 min，30%～100% B，25～35 min，30% B。在整個分析過程中，自動取樣器保持在10 ℃。ESI 條件為噴霧電壓3.0 kV（正離子模式）和2.5 kV（負離子模式），毛細管溫度為350℃，S-Lens 射頻水平為50%（正離子模式）和60%（負離子模式）。在200～1 800（正離子模式）和250～1 800（負離子模式）的質(zhì)量-電荷比范圍內(nèi)采集全掃描光譜。采用LipidSearch 進行峰識別、峰提取、脂質(zhì)鑒定（二級鑒定）等處理。

4 統(tǒng)計學處理

采用LipidSearch（Thermo Scientific）對原始LCMS 數(shù)據(jù)進行峰識別、峰提取、脂質(zhì)鑒定（二級鑒定）等處理。對LipidSearch 提取得到的數(shù)據(jù)進行數(shù)據(jù)分析，包括單變量統(tǒng)計分析、多元變量統(tǒng)計分析、層次聚類分析和相關性分析等。單變量統(tǒng)計分析采用Student’st-test/非參數(shù)檢驗和變異倍數(shù)分析。多元變量統(tǒng)計分析包括無監(jiān)督主成分分析（PCA）分析、有監(jiān)督最小二乘法判別分析（PLS-DA）和正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1 LPS/IFN-γ誘導M1型巨噬細胞極化的鑒定

分別應用Western blot 和流式細胞術檢測M1 型巨噬細胞表面標記，與對照組相比，LPS/IFN-γ 處理后M1 型巨噬細胞極化標志iNOS 和CD86 表達升高（P＜0.01），見圖1。上述結果表明，LPS/IFN-γ能夠使體外培養(yǎng)的巨噬細胞表型由M0向M1極化。

2 實驗質(zhì)量控制

將分析得到的QC 樣本基峰色譜圖（base peak chromatogram，BPC）進行譜圖重疊比較，可以看出樣本的色譜峰響應強度和保留時間基本重疊，說明實驗重復性好，見圖2。因此用于本實驗儀器的穩(wěn)定性、實驗的重復性、數(shù)據(jù)質(zhì)量的可靠性良好。

3 脂質(zhì)分子的單變量統(tǒng)計分析

單變量統(tǒng)計分析可以直觀地展示比較組中脂質(zhì)分子的整體差異表達倍數(shù)情況，圖3 顯示了對照組細胞和M1 型巨噬細胞脂質(zhì)代謝物差異分析比較火山圖。本項目正、負離子模式共鑒定出的脂質(zhì)分子有1 609 種，涉及35個脂質(zhì)亞類。

4 脂質(zhì)分子的多變量統(tǒng)計分析

Figure 1.Markers of M1 macrophages were detected by Western blot（A）and flow cytometry（B）.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs con?trol group.圖1 Western blot和流式細胞術檢測M1型巨噬細胞的表面標記物

Figure 2.Total ion flow chromatogram of QC samples.A：BPC overlapping spectrum of the sample in positive ion mode；B：BPC overlapping spectrum of the sample in negative ion mode.In the figure，the abscissa is the retention time of each chromato?graphic peak，and the ordinate is the intensity value of the peak.圖2 QC樣本總離子流色譜圖檢查

本項目實驗結果顯示用于觀察組間樣本的總體分布趨勢和組間樣本的差異度PCA 模型R2X 值為0.764，表明模型穩(wěn)定可靠，見圖4A。運用PLS-DA建立脂質(zhì)表達量與樣品類別之間的關系模型對樣品類別的預測得分圖，見圖4B，其R2Y＞0.998、Q2＞0.988，表明M1 型巨噬細胞脂質(zhì)成分與對照細胞比較有顯著差異。OPLS-DA 分析是PLS-DA 的擴展，可以濾除與分類信息無關的信息，將相關的信息主要集中在第一個預測成分。圖4C 可以看出OPLS-DA模型未過度擬合。PLS-DA 和OPLS-DA 模型的置換檢驗圖進一步說明模型穩(wěn)健性良好，能區(qū)分兩組樣本，見圖4D、E。

Figure 3.The different lipids between control group and M1 group showed in volcano plot.Note：the X-coordinate represents the differentially expressed multiple value after log2 conversion，the Y-coordinate represents the P value after Log10 conversion，and the points in rose red are lipid molecules that meet the screening crite?ria of differentially expressed multiple. n=6（FC ＞1.5 or FC＜0.67，P＜0.05）.圖3 對照細胞和M1 型巨噬細胞組差異脂質(zhì)比較分析的火山圖

5 顯著性差異表達脂質(zhì)分子的篩選結果

正、負離子模式下，以變異倍數(shù)分析（fold change analysis，F(xiàn)C）＞1.5 或＜0.67，變量權重值（variable im?portance for the projection，VIP）＞1，P＜0.05 作為篩選標準，比較對照細胞組和M1型巨噬細胞組樣本脂質(zhì)分子的整體差異表達倍數(shù)情況。從總共1 609 個脂質(zhì)中篩選出183 個有統(tǒng)計學意義的差異脂質(zhì)，歸屬為9 個亞類。其亞類分別為：卵磷脂（phosphatidyl?choline，PC）、磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanol?amine，PE）、磷脂酰甘油（phosphatidylglycerol，PG）、磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol，PI）、磷酯酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）、甘油三酯（triglyceride，TG）、甘油二酯（diglyceride，DG）、鞘磷脂（sphingo?myelin，SM）和神經(jīng)酰胺（ceramides，Cer）。與對照組比較，M1 型巨噬細胞組變異倍數(shù)最大且顯著相關的主要脂質(zhì)成分是PI、PC、SM和TG，見表1。

Figure 4.Pattern recognition analysis between control group and M1 macrophage group（n=6）.A：principal component analysis（PCA）score；B：partial least squares discrimination analysis（PLS-DA）score；C：orthogonal partial least squares discrimi?nant analysis（OPLS-DA）score；D：PLS-DA model replacement test diagram；E：OPLS-DA model replacement test diagram.圖4 對照細胞和M1型巨噬細胞組間的模式識別分析

6 顯著性差異脂質(zhì)分子的相關性分析

顯著性差異脂質(zhì)分子（VIP＞1，P＜0.05）之間的密切程度通過相關性分析可以進一步了解生物狀態(tài)變化過程中脂質(zhì)分子、亞類之間的相互關系。文中和弦圖列出了M1 型巨噬細胞極化過程中相關性系數(shù)|r|＞0.5 且P＜0.05 的差異脂質(zhì)分子的相關性分析結果；該圖內(nèi)圈連接線的起點表示差異脂質(zhì)分子，外圈上的弧線表示脂質(zhì)亞類；彩色線條表示亞類內(nèi)部脂質(zhì)分子的相關性，深灰色線條表示亞類與亞類之間的脂質(zhì)分子相關，見圖5。從圖中可以看出屬于同一代謝途徑中的代謝物存在高度相關性，如存在于甘油磷脂通路上的PC、PE、PI 和PS 相關性較強。當代謝通路中的某一物質(zhì)發(fā)生變化時，同一代謝途徑的其他代謝物也會出現(xiàn)相應的改變。

表1 對照細胞和M1型巨噬細胞組差異脂質(zhì)成分分析Table 1.Analysis of different lipid components between the control group and the M1 macrophage group

7 差異脂質(zhì)分子代謝通路分析

為了篩選M1 型巨噬細胞極化過程中差異表達脂質(zhì)分子的代謝通路，本研究基于前期篩選出的183個差異表達脂質(zhì)分子利用MetaboAnalyst 平臺結合KEGG 數(shù)據(jù)庫開展脂質(zhì)分子代謝通路分析，如圖6 所示，本研究中差異表達的脂質(zhì)分子與甘油磷脂代謝通路相關，甘油磷脂代謝通路中有PE、PC 和PS 所在的3個位置被映射。

討論

脂質(zhì)是組成生物體各種細胞膜結構的主要成分，脂質(zhì)也是重要的信號分子，早年證據(jù)表明，脂質(zhì)成分變化與癌癥、脂肪肝和動脈粥樣硬化等疾病成因果關系［5］。近年來脂質(zhì)代謝與炎癥反應之間的密切關系也日益受到關注，二者相互促進，炎癥可導致脂質(zhì)代謝紊亂，而脂質(zhì)代謝失衡也可誘發(fā)炎癥反應［6］。鑒于脂質(zhì)分子結構與動脈粥樣硬化的關系，探索其與疾病相關的生物學功能將有望成為干預動脈粥樣硬化治療的新靶點。

脂質(zhì)組學是一種能夠高效準確獲取生物體脂質(zhì)組成與表達變化的高通量檢測方法。通過脂質(zhì)組學分析，可以高效地研究脂類家族、脂質(zhì)分子在各種生物過程中的改變與功能，進而闡明相關的生物活動過程與機制［7］。目前脂質(zhì)組學主要分為非靶向和靶向分析兩類。其中，非靶向分析模式能夠實現(xiàn)對樣本中的各種類型脂質(zhì)進行無偏向地系統(tǒng)性解析［8］。本項目采用基于UPLC-LTQ-Orbitrap 質(zhì)譜系統(tǒng)的非靶向脂質(zhì)組學分析平臺，并結合LipidSearch 軟件進行數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)M1 型巨噬細胞活化過程中磷脂、鞘脂和甘油脂表達量差異明顯。前期有報道使用靶向質(zhì)譜技術分別檢測小鼠RAW264.7 巨噬細胞和人來源的THP-1 巨噬細胞的分析結果表明，M1 巨噬細胞活化過程中PC、PG、PI、PS 和SM 等含量同對照組相比明顯升高［3］，與本研究甘油磷脂分子差異表達的結果基本一致。

Figure 5.Correlation analysis results of different lipids between control group and M1-type macrophage group.The chord diagram shows the lipid molecular pairs with cor?relation coefficient |r|＞0.5 and P＜0.05，the starting point of the inner ring connection line represents the dif?ferential lipid molecules，and the arc on the outer ring represents the lipid subclasses.The colored lines indi?cate the correlation of lipid molecules within subclass?es，the lines are of the same color as the subclasses，and the dark gray lines indicate the correlation of lipid molecules between subclasses and subclasses.圖5 對照組和M1 型巨噬細胞組間差異脂質(zhì)的相關性分析結果

磷脂是生物膜的主要成分，分為甘油磷脂與鞘磷脂兩大類，分別由甘油和鞘氨醇構成。既往研究報道磷脂具有促進脂肪代謝、防治脂肪肝，降低血清膽固醇、抗動脈粥樣硬化的作用［9］。本研究結果顯示，PC 類差異物中PC（18：0e/18：1）、PC（16：0/24：1）、PC（36：1e）、PC（42：2）和PC（40：2）等含量明顯上調(diào)。而PE 類差異物中PE（18：0p/20：1）、PE（18：1p/20：2）和PE（38：2e）含量明顯上調(diào)；PE（18：1/22：6）含量明顯下調(diào)。PI 類PI（18：0/18：1）含量較正常組上調(diào)，PI（18：0/20：3）和PI（18：1/20：3）含量下調(diào)。上述結果提示炎癥導致的M1 型巨噬細胞極化可以使磷脂代謝發(fā)生紊亂。

Zhang 等［3］采用超臨界流體色譜和離子淌度質(zhì)譜聯(lián)用技術分析了從人外周血提取的單核源巨噬細胞，結果發(fā)現(xiàn)膜磷脂改變導致的血栓素A2 是M1 型巨噬細胞極化的一個特異性標記物［3］。來自歐洲的人群研究顯示血清磷脂含量是預測糖尿病患者發(fā)生心腦血管事件的監(jiān)測指標［10］。人體血清非靶向脂質(zhì)組學分析研究也進一步證實了磷脂代謝紊亂與亞臨床冠心病相關［11］。

Figure 6.Based on the characteristic metabolites and KEGG database select the major metabolic pathways.圖6 基于特征性代謝物和KEGG數(shù)據(jù)庫篩選出的發(fā)生變化的主要代謝通路

甘油酯通常是指由甘油和脂肪酸（含飽和和不飽和脂肪酸）經(jīng)酯化所生成的酯類。甘油酯是血脂的成分之一，扮演貯存與輸送的角色，大部分存在于乳糜微粒及極低密度脂蛋白內(nèi)。甘油酯和膽固醇都是造成動脈粥樣硬化的危險因子［12］.。本研究脂質(zhì)組學分析發(fā)現(xiàn)，M1 型巨噬細胞組升高較明顯的成分是TG（16∶0/14∶0/16∶0）、TG（18∶0/18∶1/18∶1）、TG（18∶0/18∶0/18∶1）和TG（18∶0/18∶0/20∶2），這與文獻報道脂質(zhì)代謝重編程被認為是巨噬細胞表型轉換的物質(zhì)基礎相一致［13］。

鞘脂水解產(chǎn)物為神經(jīng)酰胺和磷酸膽堿，鞘脂及其代謝產(chǎn)物不僅是構成細胞膜的重要結構分子，而且參與調(diào)節(jié)細胞的生長、分化、衰老和細胞程序性死亡等許多重要的信號轉導［14］。Abuawad 等［4］基于液相色譜質(zhì)譜方法測定了GM-CSF、LPS/IFN-γ 誘導下的THP-1 巨噬細胞極化的代謝譜，通過與代謝數(shù)據(jù)庫的比較，明確了巨噬細胞不同的極化方向具有不同的代謝特征，其中M1型巨噬細胞極化時鞘脂和嘧啶代謝具有顯著的改變。SM 作為鞘脂類一種成分，其信號轉導途徑可能在致血管內(nèi)皮細胞凋亡、引起泡沫細胞形成和平滑肌細胞增殖等動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用［15］。本研究結果也顯示，對照細胞SM 含量較M1型巨噬細胞降低，提示M1型巨噬細胞活化與鞘磷脂代謝有關。

本研究基于LC-MS 技術結合多元變量數(shù)據(jù)分析方法在M1 型巨噬細胞極化過程中共鑒定出183 個具有統(tǒng)計學意義的差異脂質(zhì)分子，其中顯著相關的主要脂質(zhì)成分是PI、PC、SM 和TG。代謝通路分析顯示差異脂質(zhì)分子與與甘油磷脂代謝通路相關。