聶穎青，熊寶萍，劉海林，劉穎菊

（1重慶醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，重慶市生物化學(xué)與分子藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400016；2重慶兩江新區(qū)第一人民醫(yī)院藥劑科，重慶 401121）

炎癥反應(yīng)參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展，其特征大多伴隨炎癥因子的釋放。在機(jī)體炎癥反應(yīng)發(fā)生的同時(shí)，抗炎機(jī)制會(huì)同時(shí)啟動(dòng)以避免過(guò)度和持久的炎癥反應(yīng)造成機(jī)體的損傷［1-2］。其抗炎機(jī)制包括促進(jìn)致炎細(xì)胞凋亡、釋放抗炎細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素10（in?terleukin-10，IL-10）等。近年來(lái)有研究報(bào)道焦亡區(qū)別于細(xì)胞凋亡，可在不發(fā)生核碎裂的情況下誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，使細(xì)胞腫脹，釋放IL-1β 和IL-18等大量炎癥因子［3-4］。這意味著細(xì)胞焦亡參與炎癥的發(fā)生，但其與細(xì)胞凋亡的關(guān)系還未闡明。

對(duì)甲苯磺酰維達(dá)列?。╬ara-toluenesulfonyl vilda?gliptin，PV）是金剛烷磺酰胺類化合物，分子式為C24H31N3O4S（分子量457.5），結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。本課題組已有研究結(jié)果顯示，金剛烷磺酰胺類化合物可抑制脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激誘導(dǎo)的RAW264.7 巨噬細(xì)胞的增殖，并減少由后者產(chǎn)生的炎癥因子［腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和IL-1β］的表達(dá)，具有顯著的抗炎作用［5-6］，但是，其抗炎作用機(jī)制至今未闡明，是否與影響焦亡和凋亡有關(guān)，以及其涉及的相關(guān)通路有待研究。脂多糖作為革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的一個(gè)組成部分不僅能引起巨噬細(xì)胞的炎性增殖，也可通過(guò)TLR4通路刺激caspase-1 活化，或直接刺激caspase-11 活化引起焦亡的發(fā)生。因此，本項(xiàng)工作選用LPS 刺激RAW264.7 巨噬細(xì)胞增殖，構(gòu)建體外焦亡炎癥模型，研究對(duì)甲苯磺酰維達(dá)列汀對(duì)焦亡和凋亡及炎癥因子產(chǎn)生的影響［7］。通過(guò)檢測(cè)炎癥因子的濃度、焦亡和凋亡及相關(guān)蛋白和mRNA 表達(dá)，明確對(duì)甲苯磺酰維達(dá)列汀是否參與影響焦亡與凋亡從而產(chǎn)生抗炎作用。

Figure 1.Chemical structure of para-toluenesulfonyl vildagliptin.圖1 對(duì)甲苯磺酰維達(dá)列汀的化學(xué)結(jié)構(gòu)

材料和方法

1 材料

小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 由重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院生化與分子藥理實(shí)驗(yàn)室提供。對(duì)甲苯磺酰維達(dá)列?。ê俊?5.1%，由重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥化教研室提供）；脂多糖購(gòu)自Sigma；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購(gòu)自重慶賽米克生物科技有限公司；DMEM 高糖培養(yǎng)液購(gòu)自Gibco；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒和超敏顯影液購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；噻唑藍(lán)（MTT）、二甲亞砜（DMSO）、小鼠IL-1β、TNF-α 和IL-6 酶聯(lián)免疫吸附（enzyme linked immunosorbent as?say，ELISA）試劑盒和BCA 蛋白定量試劑盒均購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；抗caspase-1抗體、caspase-3 抗體、α-Tublin 抗體和HRP 標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；SYBR 購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限責(zé)任公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和引物均購(gòu)自TaKaRa。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及對(duì)甲苯磺酰維達(dá)列汀及LPS 的配制 RAW264.7 巨噬細(xì)胞用含10%的FBS、90%的DMEM 高糖培養(yǎng)液于37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。對(duì)甲苯磺酰維達(dá)列汀（以下用PV 表示），用DMSO 配成可穩(wěn)定保存的母液濃度為0.2 mol/L 的均勻混懸液，并用含有10%的FBS完全培養(yǎng)液稀釋成不同終濃度的PV溶液用于實(shí)驗(yàn)，并且保證DMSO稀釋倍數(shù)大于2 000，排除對(duì)細(xì)胞本身的影響。LPS 用PBS 配成可穩(wěn)定保存的濃度為1 g/L 的均勻溶液，并用含有10%的FBS完全培養(yǎng)液稀釋成經(jīng)濟(jì)有效的1 mg/L 的終濃度用于實(shí)驗(yàn)［8］。并選用LPS 刺激RAW264.7 巨噬細(xì)胞焦亡炎性增殖模型作為本次的試驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

2.2 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞活力 將細(xì)胞按照每孔1×104個(gè)接種于96 孔培養(yǎng)板中，并分為對(duì)照（control）組、對(duì)甲苯磺酰維達(dá)列汀陰性對(duì)照組（PVNC 組）、LPS 組、LPS+DMSO 組和不同濃度PV+LPS 組，每組設(shè)置6 個(gè)復(fù)孔。藥物處理組分別加入不同濃度PV 預(yù)處理24 h，然后除PVNC 組外其余每組再加入等體積的1 mg/L 的LPS 繼續(xù)培養(yǎng)4 h。每孔加入20 μL MTT 溶液（5 g/L），避光孵育4 h 后，棄去上清液，每孔加入150 μL的DMSO，避光振搖15 min，酶標(biāo)儀上于波長(zhǎng)490 nm處測(cè)各孔吸光度（A）值。重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)3次。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的凋亡 將RAW264.7細(xì)胞按照每孔1×106個(gè)接種于6 孔板中，并分為對(duì)照組、LPS 組、LPS+DMSO 組和LPS+PV 組，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。PV+LPS 組加入0.3 μmol/L PV（藥物濃度根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇）預(yù)處理24 h后，每組再加入1 mg/L 的LPS 繼續(xù)培養(yǎng)4 h，后按照Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒的操作步驟收集細(xì)胞，并在30 min內(nèi)流式上機(jī)。重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)3次。

2.4 ELISA 檢測(cè)TNF-α、IL-1β 和IL-6 含量 將RAW264.7 細(xì)胞按照每孔1×106個(gè)接種6 孔板中，同2.3的方法分組做相同處理后，收集培養(yǎng)細(xì)胞的上清液，按照ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，以IL-6 為例，加入標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品50 μL，酶標(biāo)試劑50 μL，37 ℃溫育120 min 后洗板5 次，加底物顯色劑A、B 各50 μL，避光15 min，加終止液50 μL，振蕩10 min，15 min內(nèi)在波長(zhǎng)450 nm處測(cè)A值。重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)3次。

2.5 Western blot檢測(cè)細(xì)胞中caspase-3和caspase-1蛋白的表達(dá) 將RAW264.7 細(xì)胞按照每孔1×106個(gè)接種于6 孔板中，同2.3 的方法分組做相同處理后，收集細(xì)胞提取蛋白并用BCA 蛋白定量檢測(cè)蛋白濃度。用SDS-PAGE 分離蛋白，轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，5%的BCA 封閉液在室溫下封閉2 h，分別孵育caspase-3（1∶1 000）抗體，caspase-1（1∶2 000）抗體，α-Tublin（1∶1 0000）抗體，4 ℃過(guò)夜。TBST洗膜3次，每次10 min，在室溫下孵育相對(duì)應(yīng)的Ⅱ抗50 min，TBST 洗膜3 次，每次10 min，ECL進(jìn)行曝光。使用ImageJ軟件分析條帶灰度值。重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)3次。

2.6 RT-qPCR 檢測(cè)細(xì)胞中NLRP3、caspase-1、GSD?MD、IL-1β、IL-18、caspase-11、caspase-3 和Bax 的mRNA 的表達(dá) 將RAW264.7 細(xì)胞按照每孔1×106個(gè)接種于6 孔板中，同2.3 的方法分組做相同處理后，收集細(xì)胞，用Trizol 提取出總RNA。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)，以RNA 為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cD?NA。加入表1中引物，進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s；40 個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參照基因，采用2-ΔΔCt方法，計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量。重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)3次。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1.The sequences of the primers for RT-qPCR

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示；多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）；組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)；以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用GraphPad Prism 7.0軟件作圖。

結(jié)果

1 PV抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞活力

與對(duì)照組相比，RAW264.7 細(xì)胞受LPS 刺激后，LPS 組和LPS+DMSO 組細(xì)胞活力均顯著升高（P＜0.01），證明炎癥模型造模成功。LPS 組與LPS+DMSO 組之間無(wú)顯著差異（P＞0.05），證明DMSO 對(duì)藥物及細(xì)胞無(wú)顯著影響。與對(duì)照組相比，PV（10 μmol/L）+DMSO 組細(xì)胞活力無(wú)顯著差異（P＞0.05），證明藥物對(duì)細(xì)胞無(wú)顯著毒性。與LPS+DMSO 組相比，給予PV（3、1、0.3、0.1 和0.03 μmol/L）預(yù)處理后，巨噬細(xì)胞增殖均受到顯著抑制，且呈劑量依賴性地降低（P＜0.01），見(jiàn)圖2。后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用有效中間濃度0.3 μmol/L作為給藥濃度。

Figure 2.Effect of para-toluenesulfonyl vildagliptin（PV）on the proliferation of RAW264.7 macrophages induced by LPS.Mean±SD.n=3.##P＜0.01 vs control group；**P＜0.01 vs LPS+DMSO group.圖2 對(duì)甲苯磺酰維達(dá)列汀對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞增殖的影響

2 PV促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞凋亡

與對(duì)照組［（8.3±0.4）%］相比，LPS+DMSO 組細(xì)胞凋亡率［（11.1±0.3）%］提高，提示LPS刺激后巨噬細(xì)胞增殖活化同時(shí)凋亡細(xì)胞也增多（P＜0.05）；對(duì)甲苯磺酰維達(dá)列汀預(yù)處理后，0.3 μmol/L 藥物組［（27.3±1.9）%］與LPS+DMSO 組相比促凋亡效應(yīng)顯著增強(qiáng)（P＜0.01），見(jiàn)圖3。

3 PV抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞炎癥因子的產(chǎn)生

LPS+DMSO 組中TNF-α、IL-6 和IL-1β 與對(duì)照組中TNF-α、IL-6 和IL-1β 表達(dá)量分別比較均顯著升高（P＜0.01）；0.3 μmol/L PV組以上各炎癥因子表達(dá)量與LPS+DMSO 組相比均顯著降低（P＜0.01），見(jiàn)圖4。

4 PV 對(duì)LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 巨噬細(xì)胞caspase-3和caspase-1蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，LPS+DMSO 組caspase-1 蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，證明炎癥模型造模成功；0.3 μmol/L PV 可顯著抑制LPS 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞caspase-1 蛋白表達(dá)（P＜0.01），并且可顯著上調(diào)caspase-3 和cleaved caspase-3 的表達(dá)（P＜0.01），見(jiàn)圖5。這表明PV 可促進(jìn)巨噬細(xì)胞凋亡并抑制由LPS誘導(dǎo)的焦亡。

5 PV 對(duì)LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 巨噬細(xì)胞NLRP3、caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18、caspase-11、cas?pase-3和Bax的mRNA表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，LPS+DMSO組中焦亡相關(guān)mRNA（NLRP3、caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18 和caspase-11）表達(dá)均顯著升高（P＜0.05）；0.3 μmol/L PV 組與LPS+DMSO 組比較，以上指標(biāo)均顯著下調(diào)（P＜0.05），且凋亡相關(guān)mRNA（caspase-3 和Bax）的表達(dá)與LPS+DMSO 組比較均顯著上調(diào)（P＜0.01），見(jiàn)圖6。

討論

炎癥反應(yīng)的發(fā)生涉及多條信號(hào)通路交互作用，近年來(lái)焦亡被發(fā)現(xiàn)在其中扮演著重要角色。細(xì)胞焦亡也是一種程序性細(xì)胞死亡，它不同于凋亡和壞死，是一種炎癥性細(xì)胞死亡。細(xì)胞焦亡途徑分為經(jīng)典焦亡途徑和非經(jīng)典焦亡途徑。經(jīng)典焦亡途徑的激活是當(dāng)機(jī)體受到外來(lái)微生物感染或無(wú)菌性的損傷刺激后，可激活細(xì)胞的模式識(shí)別受體，進(jìn)而與信號(hào)接收器凋亡相關(guān)微粒蛋白（apoptosis-associated speck-like protein，ASC）和pro-caspase-1 等形成炎癥小體復(fù)合物，由此激活焦亡標(biāo)志蛋白caspase-1?；罨腸as?pase-1 使焦亡執(zhí)行者Gasdermins（如GSDMD）被裂解為Gasdermins-N（GSDMD-N）端，與自抑制的Gasder?mins-C 端，同時(shí)剪切pro-IL-1β 和pro-IL-18 生成細(xì)胞因子IL-1β 和IL-18，其中GSDMD-N 端插入細(xì)胞膜中，在細(xì)胞膜定位成孔，導(dǎo)致胞內(nèi)容物，包括炎癥因子IL-1β 和IL-18外漏到胞外，細(xì)胞腫脹，質(zhì)膜破碎最后細(xì)胞溶解，釋放大量炎癥因子，產(chǎn)生細(xì)胞焦亡［9-12］；非經(jīng)典途徑則依賴于caspase-4/caspase-5/caspase-11激活。一些細(xì)胞外的細(xì)菌刺激物，如革蘭陰性菌特征物內(nèi)毒素（lipopolysaccharide，LPS），通過(guò)外膜囊泡（outer membrane vesicles，OMVs）內(nèi)吞作用而到達(dá)胞質(zhì)內(nèi)，激活caspase-4/caspase-5/caspase-11（小鼠cas?pase-11 的人類對(duì)應(yīng)物caspase-4/caspase-5），caspase-11也可剪切GSDMD 為GSDMD-N端和GSDMD-C端，從而導(dǎo)致細(xì)胞焦亡的發(fā)生，caspase-11 同時(shí)可激活caspase-1，使IL-1β 和IL-18 生成釋放到細(xì)胞外［13-14］。細(xì)胞焦亡是機(jī)體應(yīng)對(duì)外來(lái)微生物感染先天免疫的重要組成部分，在炎癥反應(yīng)放大和繼發(fā)損傷中起著重要作用。因此深入探究焦亡與炎癥的關(guān)系及其尋找藥物作用的靶點(diǎn)具有研究?jī)r(jià)值。

Figure 3.Effect of para-toluenesulfonyl vildagliptin（PV）on apoptosis rate of RAW264.7 macrophages induced by LPS.Mean±SD.n=3.#P＜0.05 vs control group；**P＜0.01 vs LPS+DMSO group.圖3 對(duì)甲苯磺酰維達(dá)列汀對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞凋亡率的影響

誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞凋亡是糖皮質(zhì)激素類藥物的重要抗炎機(jī)制。細(xì)胞凋亡是由半胱氨酸蛋白酶誘導(dǎo)的程序性死亡。激活的半胱氨酸蛋白酶啟動(dòng)凋亡后，細(xì)胞會(huì)發(fā)生DNA 片段化、核濃縮、凋亡小體形成、凋亡小體被臨近細(xì)胞和巨噬細(xì)胞吞噬清除等現(xiàn)象。凋亡過(guò)程中細(xì)胞質(zhì)膜完整，無(wú)內(nèi)容物釋放，不直接引起炎癥反應(yīng)，不影響其他細(xì)胞正常功能。在半胱氨酸蛋白酶被激活后，水解級(jí)聯(lián)反應(yīng)放大凋亡途徑中cas?pase-2、caspase-8、caspase-9和caspase-10是起始凋亡蛋白酶，caspase-3、caspase-6 和caspase-7 為效應(yīng)凋亡蛋白酶［15-16］。

Figure 4.Effect of concentration of TNF-α，IL-6 and IL-1β in supernatant of RAW264.7 macrophages induced by LPS after treated with para-toluenesulfonyl vildagliptin（PV）.A：TNF-α；B：IL-6；C：IL-1β.Mean±SD. n=3.#P＜0.05，##P＜0.01 vs con?trol group；**P＜0.01 vs LPS+DMSO group.圖4 對(duì)甲苯磺酰維達(dá)列汀對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α、IL-6和IL-1β濃度的影響

Figure 5.Protein expression of caspase-1，caspase-3 and cleaved caspase-3 of RAW264.7 macrophages induced by LPS after treated with para-toluenesulfonyl vildagliptin（PV）.A：caspase-1 protein；B：caspase-3 protein；C：cleaved caspase-3 protein.Mean±SD. n=3.#P＜0.05，##P＜0.01 vs control group；**P＜0.01 vs LPS+DMSO group.圖5 對(duì)甲苯磺酰維達(dá)列汀對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞表達(dá)caspase-1、caspase-3和cleaved caspase-3蛋白的影響

Figure 6.Effect of expression of NLRP3，caspase-11，IL-1β，IL-18，caspase-11，GSDMD，caspase-3 and Bax in RAW264.7 mac?rophages induced by LPS after treated with para-toluenesulfonyl vildagliptin（PV）.A：NLRP3 mRNA；B：caspase-1 mRNA；C：GSDMD mRNA；D：IL-1β mRNA；E：IL-18 mRNA；F：caspase-11 mRNA；G：caspase-3 mRNA；H：Bax mRNA.Mean±SD. n=3.#P＜0.05，##P＜0.01 vs control group；**P＜0.01 vs LPS+DMSO group.圖6 對(duì)甲苯磺酰維達(dá)列汀對(duì)LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 巨噬細(xì)胞表達(dá)NLRP3、caspase-1、IL-1β、IL-18、caspase-11、GSDMD、cas?pase-3和Bax mRNA的影響

因此為了解PV 對(duì)焦亡和凋亡的影響，本實(shí)驗(yàn)首先建立了LPS 刺激巨噬細(xì)胞的炎癥模型。LPS 可被位于質(zhì)膜上的模式識(shí)別受體TLR4識(shí)別，從而轉(zhuǎn)錄激活NF-κB，使NLRP3（Nod-like receptors）轉(zhuǎn)錄增加，進(jìn)而與ASC 和pro-caspase-1 形成NLRP3 炎癥小體復(fù)合物，從而啟動(dòng)焦亡。LPS 也通過(guò)非經(jīng)典途徑啟動(dòng)焦亡。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LPS刺激可引起RAW264.7巨噬細(xì)胞炎性增殖（圖2）及炎性因子（IL-1β、IL-6 和TNFα）的釋放（圖4），并引起caspase-1 的表達(dá)增加（圖5），同時(shí)焦亡通路中NLRP3、caspase-1、GSDMD、cas?pase-11、IL-1β 和IL-18 等mRNA 的表達(dá)均顯著增高（圖6A、B、C、D、E、F），證實(shí)LPS 作用于巨噬細(xì)胞，可通過(guò)經(jīng)典和非經(jīng)典途徑引起巨噬細(xì)胞焦亡和炎癥因子釋放，此結(jié)果與已有的報(bào)道是一致的［17］。也說(shuō)明細(xì)胞炎癥模型建立成功。同時(shí)檢測(cè)LPS 刺激后凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)顯示LPS 刺激后RAW264.7 巨噬細(xì)胞表達(dá)凋亡相關(guān)蛋白caspase-3 和Bax 的mRNA 表達(dá)顯著降低（圖5B、C、G、H），說(shuō)明LPS刺激主要引起巨噬細(xì)胞焦亡，而不是凋亡。進(jìn)一步，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了PV 對(duì)焦亡和凋亡的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PV 可抑制LPS 刺激引起的RAW264.7 巨噬細(xì)胞的炎性增殖及炎癥因子（IL-1β、IL-6 和TNF-α）的釋放，下調(diào)LPS 刺激的caspase-1 的表達(dá)以及焦亡通路中NLRP3、cas?pase-1、GSDMD、caspase-11、IL-1β 和IL-18 等mRNA的表達(dá)，說(shuō)明PV 對(duì)焦亡激活的經(jīng)典通路和非經(jīng)典通路均有抑制作用，可抑制焦亡的發(fā)生及炎癥因子的釋放。前期研究中顯示的金剛烷磺酰胺類化合物對(duì)TLR4-NF-κB 通路具有抑制作用［6-7］支持此結(jié)果。這可能是PV 產(chǎn)生抗炎作用的機(jī)制之一。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)藥物對(duì)凋亡的影響，結(jié)果則顯示PV 可促進(jìn)LPS 誘導(dǎo)后巨噬細(xì)胞的凋亡（圖3），結(jié)合其上調(diào)凋亡執(zhí)行蛋白caspase-3 的表達(dá)（圖5）、以及caspase-3 和BaxmRNA 的表達(dá)（圖6G、H），說(shuō)明PVB 可促進(jìn)LPS刺激后巨噬細(xì)胞凋亡。綜合以上結(jié)果可認(rèn)為PV 抑制LPS 刺激后巨噬細(xì)胞焦亡，促進(jìn)其凋亡，從而產(chǎn)生抗炎作用。

研究顯示有關(guān)焦亡和凋亡的關(guān)系較為復(fù)雜，至今尚不清楚。有研究報(bào)道，凋亡通路啟動(dòng)后caspase-3 的激活，促進(jìn)細(xì)胞焦亡的發(fā)生［18］。而Caspase-1 可激活caspase-7使嗜肺軍團(tuán)菌感染的巨噬細(xì)胞出現(xiàn)早期凋亡［19］，NLRP3 炎癥小體對(duì)細(xì)胞凋亡和焦亡都有激活作用［20］?；熕幬锟赏ㄟ^(guò)caspase-3-GSDME 通路誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞焦亡的發(fā)生［21］。Caspase-3 可剪切DFNA5 為具有成孔活性的DFNA5-N 引起細(xì)胞焦亡；高表達(dá)DFNA5 的細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞焦亡，而低表達(dá)DF?NA5 的細(xì)胞則出現(xiàn)細(xì)胞凋亡［22］。在敲除了GSDMD的單核細(xì)胞中，LPS與尼日利亞菌素誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡［23］。研究還發(fā)現(xiàn)GSDME-N 促進(jìn)caspase-3激活，放大內(nèi)部細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路，并啟動(dòng)自放大的正前饋回路；GSDMD-N 也顯示促進(jìn)caspase-3 激活［24］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果則顯示LPS 刺激后巨噬細(xì)胞出現(xiàn)焦亡，而PV 則能抑制LPS 刺激后巨噬細(xì)胞的焦亡，促進(jìn)其凋亡，并使炎癥因子釋放減少。因此可認(rèn)為細(xì)胞焦亡和凋亡是相互調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化的，GSDMD/E 在相互轉(zhuǎn)化中起著重要作用。當(dāng)炎癥發(fā)生時(shí)，炎癥細(xì)胞的焦亡促進(jìn)和放大炎癥反應(yīng)，而促進(jìn)炎癥細(xì)胞凋亡作為抗炎機(jī)制也被啟動(dòng)，使焦亡被抑制，從而維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。由此推測(cè)PV 可通過(guò)抑制LPS 刺激后巨噬細(xì)胞焦亡，從而使GSDMD 表達(dá)減少，促進(jìn)細(xì)胞走向凋亡，使炎癥因子產(chǎn)生和釋放減少。但PV 通過(guò)什么環(huán)節(jié)產(chǎn)生以上作用、是通過(guò)影響焦亡誘導(dǎo)凋亡還是直接誘導(dǎo)凋亡，其主要的作用靶點(diǎn)是什么尚需要進(jìn)一步的研究。

綜上所述，PV 作為不同于傳統(tǒng)抗炎藥結(jié)構(gòu)的一種金剛烷磺酰胺類藥物，可抑制巨噬細(xì)胞的炎癥增殖及炎癥因子的釋放，具有抗炎作用?？寡鬃饔脵C(jī)制可能與抑制細(xì)胞焦亡和促進(jìn)炎癥細(xì)胞凋亡的發(fā)生有關(guān)。

（致謝：本研究所涉及的實(shí)驗(yàn)在重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院生物化學(xué)與分子藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成，特此致謝?。?/p>