王超眾 王萌萌 劉信奎 張連成 于百青 楊敏 孫偉 初紅濤

抑郁癥是精神類疾病的一種,抑郁癥患者主要表現(xiàn)出心境障礙、情緒低落、思維遲緩,病情嚴(yán)重時(shí)還會(huì)合并厭世、自殘等消極行為,患者自身安全也受到威脅［1-6］。文拉法辛是一線抗抑郁藥之一,也是第一個(gè)去甲腎上腺素、5-羥色胺再攝取雙重抑制劑類抗抑郁藥物,可用于治療各型抑郁癥［7-10］。近年,有非法商家向所謂抗抑郁癥類“純中藥”及“保健食品”中非法添加文拉法辛的現(xiàn)象,由于在處方中未標(biāo)明含有文拉法辛藥物成分,因此容易令患者忽視并大量長(zhǎng)期服用,存在較大的安全隱患,有必要建立方法并對(duì)這些樣品進(jìn)行檢驗(yàn)［11］。為整頓市場(chǎng)亂象、打擊不法份子,本文建立測(cè)定非法添加文拉法辛的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法,該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏度高,可為中成藥及保健食品中非法添加文拉法辛檢測(cè)提供技術(shù)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Thermo Vanquish H 型高效液相色譜儀,Xcalibur 3.0.63 工作站(美國(guó)Thermo 公司)；Thermo TSQ Quantum Access 型質(zhì)譜儀,Chromeleon 7.2.10 工作站(美國(guó)Thermo 公司)；Sartorius BP211D 型電子天平(德國(guó)Sartorius 公司)；Rotina 380R 型高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Hettich 公司)；KQ-500VDV 型臺(tái)式三頻數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司,功率為500 W,頻率為45 kHz)。

1.2 試藥 鹽酸文拉法辛對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院,批號(hào)100543-202003,含量100.0%)；實(shí)測(cè)樣品來(lái)自于市場(chǎng)抽檢；乙腈、甲酸和乙酸銨均為色譜純,購(gòu)自美國(guó)Fisher 試劑公司；水為超純水,其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜-質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱：ACES C18(150 mm×2.1 mm 1.7 μm)色譜柱；流動(dòng)相：0.1%甲酸-10 mmol/L 乙酸銨(A),乙腈(B),梯度洗脫(0～2 min 時(shí)90%A,2～2.1 min時(shí)65%A,2.1～4 min 時(shí)65%A,4～4.1 min 時(shí)60%A,4.1～6.5 min 時(shí)60%A,6.5～7 min 時(shí)20%A,7～9 min 時(shí)20%A,9～9.1 min 時(shí)10%A,9.1～15 min 時(shí)10%A)；流 速：0.3 ml/min；進(jìn)樣量：2 μl；柱溫：40℃。

2.1.2 質(zhì)譜條件 電離方式：電噴霧正離子模式(ESI+)；檢測(cè)方式：選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM)；霧化氣：N2；鞘氣流速：30 bar；輔助氣流速：10 bar；源電壓：4000V(+)、3500V(-)；毛細(xì)管溫度：270℃；定性離子對(duì)、定量離子、碰撞能量和離子化模式。見(jiàn)表1。

表1 文拉法辛的主要質(zhì)譜參數(shù)

2.2 溶液配制 對(duì)照品溶液：取鹽酸文拉法辛對(duì)照品適量,精密稱定,用甲醇超聲處理,制成含文拉法辛濃度為100 μg/ml 的對(duì)照品貯備液溶液。精密量取上述溶液,用初始流動(dòng)相稀釋成濃度為500 ng/ml 的對(duì)照品溶液。供試品溶液：精密稱取樣品1 g,置50 ml 量瓶中,加甲醇適量,超聲提取15 min,放冷至室溫,用甲醇定容至刻度(若樣品中含有油脂,則將樣品提取液在-20℃條件下放置24～48 h,時(shí)間可視樣品是否澄清而定),5000 r/min 離心5 min,上清液經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾(0.22 μm),取續(xù)濾液作為供試品溶液。

空白溶液：除不加樣品外,配制過(guò)程與供試品溶液相同。取上述3 種溶液,按照“2.1”項(xiàng)下的色譜-質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析,記錄反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM)色譜圖。見(jiàn)圖1。

圖1 A 對(duì)照品溶液 B 供試品溶液 C 空白溶液的SRM 色譜圖

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察精密量取對(duì)照品貯備溶液適量,用初試流動(dòng)相稀釋成濃度為50、100、200、500、1000、1500、2000 ng/ml 的對(duì)照品系列溶液,按照“2.1”項(xiàng)下的色譜-質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析,記錄SRM 色譜圖,以濃度(X,ng/ml)為橫坐標(biāo),峰面積(Y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,曲線方程為Y=4.336X+0.2561,r=0.9998,結(jié)果見(jiàn)表2,由結(jié)果可知,文拉法辛在50～2000 ng/ml 的濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

表2 文拉法辛回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢測(cè)限、定量限結(jié)果

2.3.2 檢測(cè)限和定量限考察 將“2.3.1”項(xiàng)下的最低濃度溶液用初始流動(dòng)相繼續(xù)稀釋,進(jìn)樣2 μl,記錄SRM色譜圖,以信噪比(S/N)=3 為指標(biāo)確定檢測(cè)限,以信噪比(S/N)=10 為指標(biāo)確定定量限,結(jié)果見(jiàn)表2,可見(jiàn)方法的靈敏度完全能夠滿足非法添加化學(xué)藥物的檢測(cè)要求。

2.3.3 精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液,按照“2.1”項(xiàng)下的色譜-質(zhì)譜條件,連續(xù)進(jìn)樣6 次,記錄SRM 色譜圖,計(jì)算文拉法辛的定量離子對(duì)質(zhì)譜峰面積的RSD,結(jié)果為0.85%,說(shuō)明該方法的精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取陰性樣品,加入適量對(duì)照品儲(chǔ)備液,混勻,按“2.2”項(xiàng)下供試品的制備方法制備并測(cè)定,重復(fù)操作6 次,計(jì)算文拉法辛含量的RSD 值為1.59%,表明該方法重復(fù)性較好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.3.4”項(xiàng)下供試品溶液,分別于0、2、4、6、8、10、12 后進(jìn)樣分析,記錄定量離子對(duì)SRM 色譜圖,計(jì)算文拉法辛峰面積RSD 值,結(jié)果為2.86%,表明供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.6 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取陰性樣品1 g,分別置6 個(gè)50 ml 量瓶中,分別精密加入對(duì)照品儲(chǔ)備溶液0.25 ml,加甲醇適量,超聲提取15 min,放冷至室溫,用甲醇定容至刻度(若樣品中含有油脂,則將樣品提取液在-20℃條件下放置24～48 h,時(shí)間可視樣品是否澄清而定),5000 r/min 離心5 min,上清液經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾(0.22 μm),取續(xù)濾液進(jìn)樣分析,文拉法辛的回收率及RSD 值結(jié)果見(jiàn)表3,由結(jié)果可看出該方法測(cè)量準(zhǔn)確度良好。

表3 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.3.7 樣品測(cè)定 從市場(chǎng)收集聲稱有抗抑郁作用的中成藥及保健食品樣品共10 批,按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,外標(biāo)法計(jì)算非法添加藥品含量,經(jīng)測(cè)定,10 批樣品中均未檢出非法添加文拉法辛化學(xué)成分。

3 討論

3.1 色譜條件優(yōu)化 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀中,流動(dòng)相通常使用乙腈作為有機(jī)相,為了增加離子化效率通常在流動(dòng)相中添加一定濃度的甲酸、甲酸銨或乙酸銨等。本試驗(yàn)考察了乙腈和0.1%甲酸、20 mmol/L甲酸銨-0.1%甲酸、10 mol/L 甲酸銨溶液和 10 mmol/L乙酸銨溶液、0.1%甲酸-10 mmol/L 乙酸銨溶液等。結(jié)果采用乙腈和0.1%甲酸-10 mmol/L 乙酸銨溶液作為正模式流動(dòng)相,文拉法辛靈敏度更高,故采用為本文方法。

3.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化 取濃度為500 ng/ml 的文拉法辛對(duì)照品溶液用于質(zhì)譜條件優(yōu)化。本實(shí)驗(yàn)采用ESI 進(jìn)行離子化,分別用正離子模式和負(fù)離子模式進(jìn)行全掃描,結(jié)果均在 ESI+模式下文拉法辛響應(yīng)更好,故本方法采用正離子模式進(jìn)行檢測(cè)。在ESI+模式下進(jìn)行母離子掃描,掃描范圍為m/z 100～500,得到［M+H］+峰［278.2］+,并適當(dāng)調(diào)節(jié)相應(yīng)的毛細(xì)管電壓,使得母離子一級(jí)掃描時(shí)相應(yīng)最高。確定母離子及其毛細(xì)管電壓,繼續(xù)進(jìn)行子離子掃描,以得到最佳的二級(jí)質(zhì)譜條件,最終將優(yōu)化后得到的定量定性離子對(duì)、碰撞能量作為文拉法辛的SRM 掃描參數(shù)。