張 通，高 鵬,2，李國良,2，李劍春,2，杜歷偉，張家新

(1.山西大同大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山西大同 037009；2.陽高縣步步羔種植養(yǎng)殖綜合專業(yè)合作社，山西陽高 038111；3.左云縣恒旺農(nóng)牧專業(yè)合作社，山西左云 037100；4.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018)

幼畜體外胚胎移植（juvenile in vitro embryo transfer，JIVET）技術(shù)是利用羔羊?qū)ι臣に卮碳っ舾羞M(jìn)行超數(shù)誘導(dǎo)卵泡發(fā)育結(jié)合活體采卵、體外受精、受精卵體外培養(yǎng)以及胚胎移植為一體的體外胚胎生產(chǎn)（in vitro embryo production，IVEP）技術(shù)體系[1?2]。與體內(nèi)胚胎相比，體外成熟（in vitro maturation，IVM）和體外受精（in vitro fertilization，IVF）胚胎的發(fā)育速度及其質(zhì)量仍然較低。羊體外生產(chǎn)胚胎發(fā)育能力低可能部分原因是由于卵母細(xì)胞/胚胎的體外培養(yǎng)條件欠佳[3]。許多研究表明，活性氧（reactive oxygen spe?cies，ROS）對細(xì)胞功能的負(fù)面影響，如對蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸成分的破壞以及線粒體功能的損害。添加外源抗氧化劑可減少細(xì)胞內(nèi)ROS并提高胚胎的發(fā)育潛能[4?5]。

褪黑激素（N?乙?；?5?甲氧基色胺）是一種松果體分泌產(chǎn)物，是一種自由基清除劑。在不同物種的體外胚胎生產(chǎn)（IVEP）中，它已被證明增強(qiáng)了體外成熟（IVM）后的卵母細(xì)胞的發(fā)育能力和成熟質(zhì)量[6?7]。在小鼠模型中，外源褪黑激素可以顯著改善多囊卵巢綜合癥（PCOS）卵母細(xì)胞的核成熟，且提高了卵母細(xì)胞的發(fā)育能力[8]。在綿羊中，添加褪黑激素可提高冷凍解凍后囊胚發(fā)育到孵化囊胚階段的速度[9]。在牛卵母細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，褪黑激素受體存在于卵丘卵細(xì)胞復(fù)合體（cumulus oocyte complexes，COCs）中，并且表明褪黑激素在促進(jìn)牛卵母細(xì)胞成熟中的潛在作用[10]。相反，據(jù)報(bào)道在體外受精期間添加褪黑激素對牛胚胎的發(fā)育沒有有益作用[11]。先前的研究表明，透明質(zhì)酸合酶2（hyaluronan synthase 2，HAS2）、穿透素?3（pentraxin 3，PTX3）和前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2（prostaglandin?endoperoxide synthase 2，PTGS2）在促進(jìn)卵丘細(xì)胞增殖和成熟擴(kuò)展方面發(fā)揮了重要作用[12]。

目前，尚不清楚褪黑素是否對羔羊卵母細(xì)胞成熟和胚胎發(fā)育有積極影響。本項(xiàng)研究的目的是確定在IVM培養(yǎng)過程中添加褪黑激素是否能改善羔羊IVF胚胎的發(fā)育和質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 試劑與藥品

TCM?199培養(yǎng)液（購自于Gibco公司），無Ca2+、Mg2+磷酸鹽緩沖液（DPBS）（購自于Thermo公司），促卵泡生成素（FSH）、促黃體生成素（LH）、雌二醇（E2）（購自于Bioniche公司），胎牛血清（FBS）、透明質(zhì)酸酶（Hya）、牛血清白蛋白（BSA）、聚乙烯醇（PVA）、褪黑激素（購自于Sigma公司），馬絨毛膜促性腺激素（eCG）（購自于寧波三生公司），青霉鏈霉合劑、肝素鈉（國產(chǎn)）。

1.2 方法

1.2.1 超排方案

選擇4～6周齡羔羊，要求健康無疾病，初生質(zhì)量在3.5 kg以上，超排時(shí)質(zhì)量在15 kg以上。采用間隔12 h等量注射4 × 40 mg FSH，最后一次FSH注射的同時(shí)注射400 IU馬絨毛膜促性腺激素（eCG），然后禁食禁水12 h后等待手術(shù)。

1.2.2 采集卵母細(xì)胞

將激素處理好的羔羊先稱質(zhì)量，后綁定于手術(shù)架上，將腹部刮毛，用外科手術(shù)的方法，將卵巢牽引出，用止血鉗夾卵巢動(dòng)脈止血，使用配有8號針頭的10 mL無菌注射器，抽取3～5 mL抽卵液，從卵巢表面抽取直徑為2～6 mm的卵泡，一側(cè)卵巢上的卵泡抽完后，用加有青鏈霉素的鹽水沖洗卵巢，送入腹腔，再取出另一側(cè)卵巢，以相同方式回收卵母細(xì)胞。在體視顯微鏡下挑選卵丘細(xì)胞比較完整、胞質(zhì)均勻的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體用于體外成熟（IVM）。

1.2.3 體外成熟

將洗滌后的COCs進(jìn)行隨機(jī)分組，將分組后的COCs放入含不同濃度（0、10、25和50 μg/L）褪黑素的成熟液中進(jìn)行體外成熟，培養(yǎng)環(huán)境為38.5 ℃，5%CO2：95%空氣、飽和濕度。基礎(chǔ)成熟液成分為：TCM?199+10%FBS+10 mg/L FSH+10 mg/L LH +1 mg/L E2+1%PS。

1.2.4 體外受精和體外培養(yǎng)

將綿羊細(xì)管凍精放置在39 ℃水浴燒杯中解凍約1 min，將凍精在1.5 mL的離心管中混合均勻，取400μL輕輕加入含有600μL受精液中（受精液成為：SOF+2%發(fā)情綿羊血清+6 IU/mL肝素鈉）的2個(gè)離心管底部，置于培養(yǎng)箱中上游孵育35 min。然后將上游液中的精液轉(zhuǎn)移到1.5 mL的離心管中，在1 500 r/min的條件下室溫離心5 min，棄掉上清液，再次加入1 mL受精液離心洗滌，再次棄掉上清液，留約200μL精液沉淀，輕輕吹打均勻，將精液密度調(diào)整為約1×106個(gè)/mL。使用0.1%透明質(zhì)酸酶將成熟后卵母細(xì)胞外周部分的卵丘顆粒細(xì)胞吹打去除，并轉(zhuǎn)移到受精液培養(yǎng)皿中。將混合均勻的精液加入受精液內(nèi)與卵母細(xì)胞共孵育。

精子和卵子共同孵育24 h后，將假定的受精卵轉(zhuǎn)移到體外胚胎發(fā)育液中，用移液器反復(fù)吹打受精卵，去除黏附的精子和外周顆粒細(xì)胞。將受精卵用發(fā)育液洗滌后，按照40枚/孔的密度轉(zhuǎn)移到Nunc四孔培養(yǎng)板內(nèi)。培養(yǎng)條件為：5%CO2、5%O2、90%N2、38.6 ℃飽和濕度的密封氣袋內(nèi)。受精后48 h統(tǒng)計(jì)卵裂率，在168 h統(tǒng)計(jì)囊胚率。

1.2.5 TUNEL分析

將囊胚用質(zhì)量體積分類4%的PFA在室溫下固定1 h。固定的囊胚在室溫下體積分?jǐn)?shù)0.5%的Tri?ton?X 100的PBS液中透化30 min。透化后的囊胚在含有10 g/L BSA的PBS中在4 ℃孵育過夜。隨后將囊胚在TUNEL混合物（脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶和熒光素?dUTP，按1∶9比例）中在37 ℃暗室中孵育1 h。TU?NEL染色后的囊胚用5 mg/L PI在室溫下復(fù)染10 min。將標(biāo)記的囊胚裝載在載玻片上，并使用Zeiss Imager A2熒光顯微鏡檢測囊胚核凋亡（TUNEL：Ex 499 nm，Em 520 nm。PI：Ex 537 nm，Em 619 nm）成像。將含有DNA碎片化細(xì)胞核的細(xì)胞數(shù)除以囊胚細(xì)胞總數(shù)來計(jì)算囊胚中DNA碎片化的比例。

1.2.6 ROS檢測

收集不同處理組的卵母細(xì)胞，每組35枚，使用渦旋儀渦旋以去除卵丘細(xì)胞，轉(zhuǎn)入含有500 μL 10 mmol/L ROS水平檢測工作液（DCFH?DA)的液滴中，置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育30 min，將孵育后的卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移到35 mm的共焦皿中，并在Olym?pus FluoView FV10i共聚焦激光掃描顯微鏡系統(tǒng)（Olympus，Tokyo，Japan）下觀察檢測FITC（Ex 495 nm;Em 519 nm）。每組試驗(yàn)重復(fù)3次，使用Image J軟件進(jìn)行圖像分析。

1.2.7 總RNA提取和cDNA合成

通過渦旋儀機(jī)械地從綿羊COCs中去除并獲得卵丘細(xì)胞。使用Trizol試劑從每個(gè)樣品中提取總RNA。通過測量260和280 nm處的吸光度和2%瓊脂糖凝膠電泳來評估驗(yàn)證分離的RNA的質(zhì)量和完整性來。優(yōu)質(zhì)的RNA樣品立即用于cDNA合成反應(yīng)。按照制造商說明書的程序，使用PrimeScript?RT re?agent Kit with gDNA Eraser進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription PCR，RT?PCR）。

1.2.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

為了定量PTX3、HAS2和PTGS2 mRNA的表達(dá)豐度，由上海Generay Biotech Co.，Ltd設(shè)計(jì)并合成了特異性引物序列，使用β?actin作為內(nèi)參基因。引物序列和PCR產(chǎn)物大小見表2。使用SYBR? Premix Ex TaqTM進(jìn)行RT?qPCR。擴(kuò)增程序如下：94 ℃5 s，60 ℃30 s，72 ℃15 s，40個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min。陰性對照不含有模板cDNA。通過2???Ct方法計(jì)算基因相對表達(dá)。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SAS 9.0軟件中的One?Way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并用t檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性測驗(yàn)，P＜0.05差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 褪黑素對羔羊體外受精卵發(fā)育和質(zhì)量的影響

如表1所示，在成熟培養(yǎng)液中添加25 μg/L褪黑素胚胎的囊胚形成率（19.8% ± 1.9%）顯著高于不含褪黑素的對照組（10.1% ± 4.1%）（P＜0.05）。成熟液中添加50 μg/L褪黑素產(chǎn)生的囊胚DNA核碎片化（2.2% ± 1.1%）比例顯著低于對照組（10.9%± 2.9%）（P＜0.05）。然而，卵裂率在各組之間均無顯著性差異（P>0.05）。

表1 褪黑激素對羔羊體外受精卵發(fā)育和質(zhì)量的影響

2.2 褪黑素對羔羊卵母細(xì)胞活性氧產(chǎn)生的影響

為了研究褪黑素對羔羊卵母細(xì)胞ROS產(chǎn)生的影響，在卵母細(xì)胞成熟后，采用DCFH?DA對細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生進(jìn)行檢測。如圖1所示，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在成熟液中添加10、25和50 μg/L的褪黑素，卵母細(xì)胞內(nèi)ROS的水平均顯著低于未添加的對照組（P＜0.05）。結(jié)果表明褪黑激素在羔羊卵母細(xì)胞體外成熟階段起到了抗氧化的作用。

圖1 褪黑激素對卵母細(xì)胞ROS產(chǎn)生的影響

2.3 褪黑素對卵丘擴(kuò)展相關(guān)基因表達(dá)的影響

如圖2所示，與對照組相比，添加10、25和50μg/L褪黑激素顯著增加卵丘擴(kuò)展基因HAS2 mRNA的表達(dá)量（P＜0.05），然而在添加各組之間沒有顯著差異（P>0.05）。成熟培養(yǎng)基中添加25μg/L和50μg/L褪黑激素，卵丘擴(kuò)展基因PTX3 mRNA的表達(dá)量顯著高于低濃度（10μg/L）實(shí)驗(yàn)組和對照組（P＜0.05）。然而卵丘擴(kuò)展基因PTGS2 mRNA的表達(dá)量在各處理組和對照組之間沒有顯著差異（P>0.05）。

表2 引物序列

圖2 褪黑素對卵丘擴(kuò)展相關(guān)基因HAS2、PTX3和PTGS2 mRNA表達(dá)的影響

3 討論

幼畜體外胚胎囊胚產(chǎn)出效率低下，很大程度上歸因于卵母細(xì)胞本身發(fā)育能力差，卵母細(xì)胞本身的質(zhì)量極大地影響了受精成功率以及后續(xù)胚胎的發(fā)育能力。研究表明，在卵母細(xì)胞/胚胎體外培養(yǎng)過程中添加褪黑激素作為抗氧化劑可以改善胚胎的發(fā)育[13?14]。但迄今關(guān)于外源褪黑素對羔羊卵母細(xì)胞成熟及卵丘擴(kuò)展相關(guān)基因表達(dá)的作用尚未見報(bào)道。

本研究旨在探討在羔羊卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液中添加外源褪黑素對羔羊體外受精胚胎發(fā)育質(zhì)量、ROS代謝以及卵丘擴(kuò)展相關(guān)基因表達(dá)的影響。

褪黑素是一種有效的內(nèi)源性自由基清除劑，參與機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)，具有保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷的作用[15]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)，在卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)基中添加褪黑激素可以提高胚胎的囊胚形成。特別地，添加25μg/L的褪黑素顯著提高了羔羊卵母細(xì)胞受精后胚胎的囊胚率，并且可減少囊胚中DNA核碎片化的比例。這些結(jié)果與Tian等人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[16]。Tian等人研究發(fā)現(xiàn)適當(dāng)濃度的褪黑激素可促進(jìn)牛卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂以及牛胚胎的發(fā)育和質(zhì)量。值得注意的是，添加50μg/L褪黑激素囊胚中核DNA片段化的比例最低。然而，在IVM期間添加褪黑激素并沒有提高卵裂，但確實(shí)提高了囊胚的形成率，并具有積極的作用?？傊?，本研究表明適宜濃度的褪黑素提高了羔羊卵母細(xì)胞的成熟質(zhì)量和后續(xù)胚胎的發(fā)育能力。

細(xì)胞活性氧是正常生理新陳代謝的副產(chǎn)物，受抗氧化劑的調(diào)節(jié)[17]。為了進(jìn)一步，研究褪黑素對卵母細(xì)胞ROS代謝的影響，我們比較了不同處理組成熟后卵母細(xì)胞的ROS產(chǎn)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IVM期間添加褪黑素處理組卵母細(xì)胞的ROS水平顯著低于對照組（未處理）的卵母細(xì)胞。因此，證實(shí)褪黑素對卵母細(xì)胞發(fā)育能力的積極影響與其清除ROS的能力有關(guān)。

卵丘細(xì)胞擴(kuò)展是評估卵母細(xì)胞成熟度的關(guān)鍵參數(shù)之一，卵丘擴(kuò)展相關(guān)基因（HAS2、PTX3和PTGS2）促進(jìn)卵丘細(xì)胞的增殖和擴(kuò)展過程[18]。其中HAS2主要參與卵丘細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)透明質(zhì)酸酶的合成，PTX3在卵丘細(xì)胞外基質(zhì)的組織中起關(guān)鍵作用，PTGS2參與相關(guān)激素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[19]。有報(bào)道表明，添加外源抗氧化劑促進(jìn)卵母細(xì)胞的發(fā)育能力，并提高胚胎的產(chǎn)出和質(zhì)量[20]。在本研究中，與對照組相比，添加外源褪黑激素顯著上調(diào)卵丘擴(kuò)展基因HAS2 mRNA的表達(dá)豐度，成熟培養(yǎng)基中添加25 μg/L和50 μg/L褪黑激素，卵丘擴(kuò)展基因PTX3 mRNA的表達(dá)量也顯著升高，并且表現(xiàn)出與濃度的關(guān)系，說明褪黑素在促進(jìn)卵丘細(xì)胞的增殖和擴(kuò)展發(fā)揮了重要作用。

綜上所述，在IVM期間添加適宜濃度的褪黑激素可顯著提高羔羊體外受精胚胎的囊胚率和囊胚質(zhì)量，上調(diào)卵丘擴(kuò)展相關(guān)基因HAS2和PTX3的表達(dá)。因此，在成熟培養(yǎng)液中添加褪黑激素對胚胎的發(fā)育能力具有有益的影響，而且可以提高羔羊受精胚胎的發(fā)育潛能，這可能是由于褪黑素具有自由基清除能力和抗凋亡活性的原因。但關(guān)于褪黑素如何參與調(diào)控卵丘細(xì)胞功能促進(jìn)卵母細(xì)胞的成熟和后續(xù)胚胎發(fā)育能力還需進(jìn)一步研究。

致謝：感謝為本實(shí)驗(yàn)的完成提供幫助的陽高縣步步羔種植養(yǎng)殖綜合專業(yè)合作社和左云縣恒旺農(nóng)牧專業(yè)合作社。