易佩佩，趙英琦，丁吉雪，陳文君，陳婉榕，王夢(mèng)璇，呂元明（桂林醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，廣西 桂林541000）

乳腺癌（breast cancer）是女性發(fā)病率最高的腫瘤，同時(shí)也是女性腫瘤相關(guān)死亡的主要原因之一[1]。乳腺癌的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的主要原因，研究發(fā)現(xiàn)高達(dá)70%的淋巴結(jié)陽(yáng)性和高達(dá)30%的淋巴結(jié)陰性乳腺癌會(huì)在治愈后復(fù)發(fā)[2]，而更嚴(yán)重的是腫瘤一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移，中位生存期僅為2 ～3年，這是目前臨床治療面臨的一大難題。

染料木黃酮（genistein，GEN）是異黃酮類化合物，在豆莢類植物中廣泛存在，屬于植物雌激素的一種，具有抗氧化、保護(hù)心血管、預(yù)防骨質(zhì)疏松、抗腫瘤等藥理作用，還可作為輔助化療藥發(fā)揮作用[3-4]。已有研究證明GEN 通過NF-κB和AKT 途徑抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，還與乳腺癌中雌激素受體結(jié)合從而對(duì)相關(guān)炎癥基因產(chǎn)生影響[5]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）在癌癥中被廣泛研究，并被認(rèn)為在侵襲、轉(zhuǎn)移、化療耐藥性和與癌細(xì)胞侵襲性有關(guān)的過程中起著至關(guān)重要的作用[6]，但GEN 在調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞EMT 過程方面的作用仍不清楚。因此本實(shí)驗(yàn)從EMT 過程探究GEN 對(duì)兩種乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響及相關(guān)分子機(jī)制，探討GEN 抗乳腺癌的作用機(jī)制，為乳腺癌的臨床治療提供新思路。

1 細(xì)胞與試藥

MCF-7 細(xì)胞和MDA-MB-231 細(xì)胞（American Type Culture Collection，ATCC）；GEN、CCK-8試劑盒（美國(guó)MCE）；DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清（美國(guó)Gibco）；線粒體膜電位與細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（中國(guó)碧云天）；ECL 超靈敏化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒（上海雅酶）；DMSO（美國(guó)Sigma）；4%多聚甲醛（美國(guó)Solarbio）；β-actin、羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗（北京中杉金橋）；Caspase 3、BAX、Bcl-XL、Bcl2（武 漢Proteintech）；E-鈣調(diào)蛋白（E-Cadherin）、Vimentin、N-鈣黏蛋白（N-Cadherin）（美 國(guó)CST）；Twist、MMP-2、MMP-9、Snail、Slug（英國(guó)ABcam）。

2 方法

2.1 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以每孔200 μL（約含5000 個(gè)細(xì)胞）接種于96 孔板內(nèi)，每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。次日，吸出孔內(nèi)培養(yǎng)基，按組別分別加入100 μL 配好含0[對(duì)照組（control）]、12.5、25、50 μmol·L－1GEN 的培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)置不含細(xì)胞及無(wú)任何處理的空白對(duì)照組。分別培養(yǎng)0、24、48、72 h 后每孔加入10 μL CCK-8 溶液，置于培養(yǎng)箱4 h 后在酶標(biāo)儀450 nm 波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度。

2.2 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞按每孔1000 個(gè)細(xì)胞接種于6 孔板，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱。次日，按設(shè)定藥物濃度加入GEN，放于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 ～15 d。棄掉舊培養(yǎng)基，1×PBS 緩沖液洗滌后4%多聚甲醛溶液固定20 min，1×PBS 緩沖液洗滌3 遍，每孔加入650 μL 結(jié)晶紫染色30 min，置于通風(fēng)處晾干后拍照并對(duì)克隆形成數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2.3 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的乳腺癌細(xì)胞，以每孔1×105個(gè)接種于12 孔板中。細(xì)胞過夜貼壁后分別以含0（對(duì)照組）、12.5、25、50 μmol·L－1GEN 的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。使用線粒體膜電位與細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒染色，隨即在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察拍照。

2.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

6 孔板內(nèi)每孔接種乳腺癌細(xì)胞6×105個(gè)，培養(yǎng)至匯合度達(dá)到95%以上，用黃色槍頭沿孔中線劃一條線，1×PBS 緩沖液清洗2 遍。分別加入含0（對(duì)照組）、12.5、25、50 μmol·L－1GEN 的DMEM 培養(yǎng)基（不含血清）2 mL，繼續(xù)培養(yǎng)。劃痕后0、24、48、72 h 定點(diǎn)顯微鏡拍照記錄，用Image J 軟件處理圖像并計(jì)算相對(duì)細(xì)胞遷移率。

2.5 Transwell 實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞消化離心，用GEN 濃度分別為0（對(duì)照組）、12.5、25、50 μmol·L－1的含2%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。按藥物濃度梯度依次向各小室內(nèi)對(duì)應(yīng)加入含5×104個(gè)細(xì)胞的200 μL 細(xì)胞懸液，24 孔板孔內(nèi)加入500 μL 含20%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h后PBS 緩沖液輕柔洗滌2 次，4%多聚甲醛溶液固定20 min，隨后結(jié)晶紫避光染色20 min，PBS緩沖液洗滌3 次，在倒置顯微鏡下任意選取3 ～5個(gè)視野拍照計(jì)數(shù)，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次。鋪膠小室實(shí)驗(yàn)需提前將Matrigel 基質(zhì)膠鋪于各個(gè)小室上室的聚碳酸酯膜上，其他操作與未鋪膠相同。

2.6 Western blot 蛋白質(zhì)印跡法

3 個(gè)濃度組的GEN 處理乳腺癌細(xì)胞48 h 后。使用RIPA 裂解液裂解并提取蛋白，用BCA 法測(cè)定蛋白濃度：10% SDS-PAGE 進(jìn)行電泳分離并轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，放入對(duì)應(yīng)一抗中4 ℃冰箱孵育過夜。TBST 洗膜，二抗室溫孵育1 ～2 h 后TBST 洗膜4 次，發(fā)光機(jī)內(nèi)發(fā)光，分析條帶灰度值，計(jì)算蛋白質(zhì)相對(duì)含量。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS Statistics 21.0 和GraphPad Prism 8 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。定量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用方差分析。P＜0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 不同濃度GEN 對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖能力的影響

CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著GEN 濃度增加，乳腺癌細(xì)胞增殖能力隨之降低。平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著GEN 濃度增加，乳腺癌細(xì)胞MCF-7 及MDA-MB-231 的克隆形成能力逐步降低，見圖1。

圖1 不同濃度染料木黃酮對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的影響（n ＝3）Fig 1 Effect of different concentrations of GEN on the proliferation of breast cancer cells（n ＝3）

3.2 不同濃度GEN 對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響

細(xì)胞經(jīng)過不同濃度的GEN（12.5、25、50 μmol·L－1）處理48 h 后，置于鏡下觀察結(jié)果。與對(duì)照組相比，隨著藥物濃度的增加，發(fā)出強(qiáng)烈綠色熒光的凋亡細(xì)胞數(shù)量逐漸增加，而紅色熒光的活細(xì)胞也出現(xiàn)減弱或者呈現(xiàn)陰性，見圖2。

3.3 不同濃度GEN 對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3 所示，與對(duì)照組相比，GEN 作用下乳腺癌細(xì)胞的愈合速度減低，特別在25、50 μmol·L－1濃度下愈合能力均有明顯的抑制（P＜0.01）。Transwell 未鋪膠及鋪膠小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別見圖4 和圖5：與對(duì)照組相比，GEN 處理組穿過小室的細(xì)胞數(shù)均有明顯減少，同時(shí)穿過小室的細(xì)胞數(shù)量與藥物濃度成反比（P＜0.01）。

3.4 不同濃度GEN 對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖2 染料木黃酮對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響（×100）Fig 2 Effect of GEN on the apoptosis of breast cancer cells（×100）

圖3 染料木黃酮對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移能力的影響（×40）（n ＝3）Fig 3 Effect of GEN on the migration of breast cancer cells（×40）（n ＝3）

圖4 Transwell（未鋪膠）小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)染料木黃酮對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移能力的影響（×200）（n ＝3）Fig 4 Effect of GEN on the migration of breast cancer cells by Transwell test（without glue）（×200）（n ＝3）

圖5 Transwell（鋪膠）小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)染料木黃酮對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移能力的影響（×200）（n ＝3）Fig 5 Effect of GEN on the migration of breast cancer cells by Transwell test（with glue）（×200）（n ＝3）

不同濃度GEN（12.5、25、50 μmol·L－1）處理乳腺癌細(xì)胞48 h，凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)結(jié)果如圖6所示，隨著GEN 濃度增加，兩種細(xì)胞中Caspase 3、Cleaved-caspase 3、BAX 蛋白表達(dá)水平升高，Bcl2、Bcl-XL 蛋白表達(dá)水平降低，BAX/Bcl2 比例增加。

3.5 不同濃度GEN 對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲遷移相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

不 同 濃度GEN（12.5、25、50 μmol·L－1）處理乳腺癌細(xì)胞48 h 后，對(duì)其侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響。結(jié)果如圖7 所示，隨著GEN 的藥物濃度增加，E-Cadherin 表達(dá)升高，N-Cadherin、Vimentin、Twist、Snail、Slug、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)降低（見圖7）。

4 討論

目前乳腺癌的臨床治療多采用手術(shù)配合放化療的綜合療法，但由于化療藥價(jià)高且副作用強(qiáng)，因此對(duì)不良反應(yīng)少，來(lái)源廣泛、價(jià)格低廉又易于獲取的新型低毒高效藥物的開發(fā)研究仍是抗乳腺癌研究中的重點(diǎn)。流行病學(xué)數(shù)據(jù)研究發(fā)現(xiàn)高異黃酮的攝入可能會(huì)降低乳腺癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[7-8]。GEN 作為一種天然的異黃酮類化合物，在自然界中廣泛存在，已有研究證明其在口腔癌[9]、結(jié)腸癌[10]、甲狀腺癌[11]等腫瘤細(xì)胞中具有一定的抑制作用。本課題組研究發(fā)現(xiàn)GEN 能夠抑制乳腺癌MCF-7 和MDA-MB-231 細(xì)胞的增殖。

圖6 染料木黃酮對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（n ＝3）Fig 6 Effect of GEN on the expression of apoptosis-related proteins in breast cancer cells（n ＝3）

圖7 染料木黃酮對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（n＝3）Fig 7 Effect of GEN on the expression of invasion and metastasisrelated proteins proteins in breast cancer cells（n ＝3）

最新研究發(fā)現(xiàn)GEN 能夠通過Notch1/NF-κB/Slug/E-Cadherin 途徑逆轉(zhuǎn)上皮-間充質(zhì)誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡[10]。乳腺癌死亡的主要原因就是局部復(fù)發(fā)與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，因此乳腺癌的不易治愈與其浸潤(rùn)性和轉(zhuǎn)移性密切相關(guān)，而EMT 是腫瘤侵襲遷移的重要驅(qū)動(dòng)因素[12-13]。乳腺癌的EMT 過程中，作為細(xì)胞上皮表型的E-Cadherin 作用是維持細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，上皮腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲的前提就是E-Cadherin 丟失，因此其丟失是EMT 發(fā)生的生物標(biāo)志物之一。當(dāng)E-Cadherin 表達(dá)出現(xiàn)下調(diào)時(shí)，作為間質(zhì)表型的N-Cadherin 表達(dá)會(huì)上調(diào)來(lái)與之達(dá)到平衡[14]。作為間質(zhì)表型的波形蛋白（Vimentin），隨著遷移能力的增加而表達(dá)上升，也被用來(lái)標(biāo)記EMT 的發(fā)生。我們發(fā)現(xiàn)GEN 能抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲與遷移能力，顯著促進(jìn)上皮型蛋白標(biāo)志物E-Cadherin 的表達(dá)，抑制間質(zhì)型蛋白標(biāo)志Vimentin、N-Cadherin 的表達(dá)。這提示GEN 能抑制腫瘤細(xì)胞EMT 的發(fā)展，從而減弱細(xì)胞的侵襲與遷移能力。

而EMT 的發(fā)生則與許多因子相關(guān)?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMP）可以直接或間接誘導(dǎo)EMT 的發(fā)生。MMP 能夠直接破壞細(xì)胞基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)成分，使惡性腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移[15]。而發(fā)生EMT 的必要條件則是損傷因素造成上皮組織基底膜結(jié)構(gòu)的降解。此外，鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子（Snail、Slug）、bHLH 轉(zhuǎn)錄家族（E12、E47 及Twist）和ZEB 轉(zhuǎn)錄因子（ZEB1 和ZEB2）[16]也可以調(diào)控EMT 的發(fā)生。E-Cadherin 啟動(dòng)子區(qū)域元 件E-box 可與轉(zhuǎn) 錄因 子Snail、Slug 和Twist 相結(jié)合，抑制E-Cadherin 的轉(zhuǎn)錄，從而導(dǎo)致EMT的發(fā)生。Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示乳腺癌細(xì)胞加GEN處理后，MMP-2、MMP-9、N-Cadherin、Vimentin、Twist、Snail 和Slug 的表達(dá)減少。由此可見，GEN 可能通過調(diào)控MMP、鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子、Twis 轉(zhuǎn)錄因子對(duì)EMT 過程發(fā)揮抑制作用。

綜上所述，本文首次提出來(lái)GEN 通過逆轉(zhuǎn)EMT 過程抑制乳腺癌細(xì)胞MCF-7 和MDAMB-231 的遷移和侵襲，誘導(dǎo)凋亡，且MMP、鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子、Twis 轉(zhuǎn)錄因子在此過程中發(fā)揮了重要作用，為進(jìn)一步明確GEN 這類植物雌激素對(duì)惡性腫瘤的影響提供了新的線索。但關(guān)于GEN 調(diào)控 EMT 過程的相關(guān)作用機(jī)制還有待后續(xù)深入研究，以期為乳腺癌的早期診斷與治療提供更多的可能。