王丹 陳紅

甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)中最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在過(guò)去的幾十年中，其發(fā)病率在許多國(guó)家迅速增加[1]。盡管大多數(shù)甲狀腺癌患者的預(yù)后良好，但很大一部分患者在10年內(nèi)出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[2]。因此，闡明甲狀腺癌的發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)制極其重要，這將有助于為甲狀腺癌的治療提供有希望的靶點(diǎn)，對(duì)預(yù)防甲狀腺癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移至關(guān)重要。作為小型非編碼RNA的微小RNA(microRNA，miRNA)，由于其在基因或信號(hào)通路調(diào)控中的重要作用，幾十年來(lái)一直是學(xué)者研究的重點(diǎn)。miRNA的表達(dá)具有明顯的組織特異性，在腫瘤發(fā)生中起重要作用，因此miRNA被認(rèn)為是癌癥良好的生物標(biāo)志物[3]。據(jù)報(bào)道，miR-9在人類多種癌癥中具有多種表達(dá)模式，并且在不同類型的癌癥中發(fā)揮不同的作用[4,5]。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-9在復(fù)發(fā)的甲狀腺癌組織中的表達(dá)顯著低于未復(fù)發(fā)的患者，提示miR-9可作為甲狀腺癌復(fù)發(fā)的預(yù)后生物標(biāo)志物[6]。但miR-9在甲狀腺癌中的作用及其相關(guān)機(jī)制尚未可知。Wnt/β-catenin信號(hào)在癌細(xì)胞中被組成性激活，參與多種惡性腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移[7,8]。研究表明，miR-9通過(guò)調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)途徑來(lái)調(diào)節(jié)來(lái)抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖[9]。然而，目前尚不清楚miR-9是否通過(guò)調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路在甲狀腺癌中發(fā)揮作用。因此，本實(shí)驗(yàn)旨在探究miR-9對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞侵襲和遷移的影響及對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的調(diào)控作用，以期為甲狀腺癌的治療提供新的作用靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系與主要試劑 人正常甲狀腺上皮細(xì)胞系Nthyori3-1和人甲狀腺癌細(xì)胞系TPC-1、MDA-T32及SW579(美國(guó)ATCC)；PRIM-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)；胰蛋白酶、青霉素和鏈霉素(美國(guó)HyClone公司)；miR-9 mimics及mimis control(廣州市銳博生物科技有限公司)；TRIzol試劑、脂質(zhì)體Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑(美國(guó)Invitogen公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連寶生物工程有限公司)；SYBR Green Master Mix檢測(cè)試劑盒(賽默飛世爾科技有限公司)；Transwell小室、Matrigel基質(zhì)膠(美國(guó)BD公司)；細(xì)胞裂解液、BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒、ECL發(fā)光試劑(上海碧云天生物科技研究所)；兔抗人MMP-2、MMP-9、β-catenin和c-Myc一抗及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(美國(guó)CST公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 所有細(xì)胞系培養(yǎng)在含10%胎牛血清、1×103U/ml青霉素和100 mg/L鏈霉素的PRIM-1640培養(yǎng)液中，放置在體積分?jǐn)?shù)為5%CO2、飽和濕度、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，每隔2 d更換1次培養(yǎng)液，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)密度達(dá)90%以上時(shí)，以0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，按照1∶3的比例傳代培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組 對(duì)數(shù)期的甲狀腺癌TPC-1細(xì)胞接種到6孔板中，接種密度為2×105個(gè)細(xì)胞/孔，將6孔板放置在37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，第2天按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑使用說(shuō)明書(shū)將miR-9 mimics及mimics control轉(zhuǎn)染TPC-1細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分為轉(zhuǎn)染(miR-9)組、陰性對(duì)照(NC)組和孔板對(duì)照(Control)組，轉(zhuǎn)染6 h后更換培養(yǎng)液。

1.4 Real-time PCR檢測(cè)miR-9的表達(dá)水平 細(xì)胞中總RNA采用TRIzol試劑進(jìn)行抽提，使用超微量核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)定RNA的純度和濃度，參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將RNA合成第一鏈cDNA。將cDNA作為模板，U6作為內(nèi)參基因，使用SYBR Green Master Mix檢測(cè)試劑盒行Real-time PCR檢測(cè)。反應(yīng)程序設(shè)為：94℃預(yù)變性5 min，隨后94℃變性20 s、60℃退火20 s、72℃延伸10 s，循環(huán)40次。獲取目的基因和內(nèi)參基因的Ct值，采用2-ΔΔCt法分析各細(xì)胞中miR-9相對(duì)表達(dá)水平。miR-9 上游引物5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’，下游引物5’-GCGCTCTTTGGTTATCTAGC-3’。U6上游引物5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’；下游引物5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

1.5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TPC-1細(xì)胞侵襲能力 Matrigel基質(zhì)膠于4℃冰箱融化，加入不含血清的RPMI-1640培養(yǎng)液以1∶8進(jìn)行稀釋，取100 μl稀釋的Matrigel膠滴加到Transwell小室的上室，37℃孵育4 h晾干備用。轉(zhuǎn)染后的TPC-1細(xì)胞以胰酶消化，以不含血清的培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，制成調(diào)整細(xì)胞密度為2×105個(gè)/ml，Transwell小室的上室加入100 μl細(xì)胞懸液，下室中加入600 μl含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，于常規(guī)培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。用濕潤(rùn)的棉簽擦去上室未穿膜的細(xì)胞，隨后多聚甲醛固定15 min，結(jié)晶紫染色20 min，用PBS洗滌3次，晾干，在400倍倒置顯微鏡下觀察并記錄侵襲細(xì)胞數(shù)(隨機(jī)選取5個(gè)視野)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次。

1.6 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TPC-1細(xì)胞遷移能力 轉(zhuǎn)染后的TPC-1細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，加入胰酶消化細(xì)胞，離心收集細(xì)胞，再加入細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液接種到24孔板中，于常規(guī)培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)，待細(xì)胞呈單層匯合時(shí)，用滅菌的移液槍槍頭在貼壁細(xì)胞中作劃痕，用PBS洗滌細(xì)胞，更換新的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞劃痕寬度，計(jì)算細(xì)胞遷移率，細(xì)胞遷移率(%)=(0 h劃痕寬度-48 h劃痕寬度)/0 h 劃痕寬度×100%。

1.7 Western blot檢測(cè)TPC-1細(xì)胞中蛋白表達(dá)水平 收集轉(zhuǎn)染48 h后3組TPC-1細(xì)胞，加入200 μl細(xì)胞裂解液，在冰上裂解30 min抽提總蛋白。用BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒測(cè)定總蛋白濃度，在蛋白樣品中價(jià)額上樣緩沖液，沸水加熱使蛋白變性，取30 μg變性蛋白加入到泳道孔，電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，封閉，洗膜后加入相應(yīng)一抗，MMP-2、MMP-9、β-catenin和c-Myc一抗為1∶800稀釋，冰上過(guò)夜孵育，洗膜后再加入1∶2 000稀釋的二抗，滴加ECL顯色液，置暗室顯影，曝光，使用凝膠成像系統(tǒng)獲取圖像，以GAPDH進(jìn)行標(biāo)定，使用Image J圖像軟件分析分別計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 miR-9在甲狀腺癌細(xì)胞系中下調(diào)表達(dá) Real-time PCR檢測(cè)表明，與人正常甲狀腺上皮細(xì)胞系Nthyori3-1相比，人甲狀腺癌細(xì)胞系(TPC-1、MDA-T32和SW579)中miR-9均下調(diào)表達(dá)(P<0.05)。miR-9在甲狀腺癌TPC-1細(xì)胞中的表達(dá)最低，后續(xù)研究選擇TPC-1細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)實(shí)驗(yàn)。見(jiàn)表1。

表1 Real-time PCR檢測(cè)不同細(xì)胞系中miR-9的表達(dá)水平

2.2 轉(zhuǎn)染miR-9 mimics上調(diào)TPC-1細(xì)胞中miR-9的表達(dá) Real-time PCR檢測(cè)表明，與Control組比，NC組TPC-1細(xì)胞中miR-9表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與NC組比，miR-9組中miR-9表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 轉(zhuǎn)染miR-9 mimis對(duì)TPC-1細(xì)胞中miR-9表達(dá)的影響

2.3 過(guò)表達(dá)miR-9抑制TPC-1細(xì)胞的侵襲能力 Transwell實(shí)驗(yàn)顯示，與Control組比，NC組侵襲細(xì)胞數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與NC組比，miR-9組侵襲細(xì)胞數(shù)明顯減少(P<0.05)。見(jiàn)圖1，表3。

圖1 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)3組TPC-1細(xì)胞侵襲能力(結(jié)晶紫染色×200)

表3 3組侵襲細(xì)胞數(shù)比較

2.4 過(guò)表達(dá)miR-9抑制TPC-1細(xì)胞的遷移能力 劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，與Control組比，NC組TPC-1細(xì)胞遷移率差異不顯著(P>0.05)；與NC組比，miR-9組TPC-1細(xì)胞遷移率明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)圖2，表4。

表4 3組TPC-1細(xì)胞遷移率比較

圖2 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)3組TPC-1細(xì)胞遷移能力(×40)

2.5 過(guò)表達(dá)miR-9抑制MMP-2和MMP-9的表達(dá)及Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活 Western blot檢測(cè)顯示，與Control組比，NC組TPC-1細(xì)胞中MMP-2、MMP-9、β-catenin和c-Myc的表達(dá)水平差異均不顯著(P>0.05)；與NC組比，miR-9組TPC-1細(xì)胞中MMP-2、MMP-9、β-catenin和c-Myc的表達(dá)水平均明顯下調(diào)(P<0.05)。見(jiàn)圖3，表5。

圖3 Western blot檢測(cè)3組TPC-1細(xì)胞中MMP-2、MMP-9、β-catenin和c-Myc蛋白表達(dá)

表5 3組TPC-1細(xì)胞中MMP-2、MMP-9、β-catenin和c-Myc蛋白水平比較

3 討論

據(jù)報(bào)道，miRNA參與多種生物過(guò)程，例如細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡、侵襲、遷移、代謝和細(xì)胞分化[10]。研究表明，miRNA表達(dá)的改變與甲狀腺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移有關(guān)，并且可以作為甲狀腺癌的診斷標(biāo)記或治療劑[11]。例如，miR-146b通過(guò)抑制PTEN并激活信號(hào)通路(PI3K/AKT)促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并減少細(xì)胞凋亡，促進(jìn)甲狀腺癌的進(jìn)展[12]。Zhao等[13]發(fā)現(xiàn)，在甲狀腺癌標(biāo)本中miR-340-5p呈異常過(guò)表達(dá)，miR-340-5p的過(guò)表達(dá)明顯增強(qiáng)了細(xì)胞活力和集落形成。Li等[14]發(fā)現(xiàn)，miR-212可通過(guò)靶向SIRT1抑制甲狀腺癌TPC-1細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，在甲狀腺癌中發(fā)揮抑癌作用。在甲狀腺癌組織和正常組織中發(fā)現(xiàn)了不同的miRNA表達(dá)譜，這種現(xiàn)象表明miRNA在甲狀腺癌發(fā)生中的關(guān)鍵作用[15]。近期研究發(fā)現(xiàn)，miR-9表達(dá)下調(diào)與宮頸癌、肺癌和乳腺癌的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)相關(guān)[16-18]。目前已確定miR-9在甲狀腺癌組織中表達(dá)下調(diào)[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-9在甲狀腺癌細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)，在甲狀腺癌TPC-1細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-9 mimics，Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-9 mimics能夠明顯上調(diào)miR-9的表達(dá)。Transwell和劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，miR-9的過(guò)表達(dá)顯著抑制甲狀腺癌TPC-1細(xì)胞侵襲和遷移。目前多項(xiàng)研究顯示，參與甲狀腺癌細(xì)胞侵襲和遷移的基質(zhì)金屬蛋白酶主要包括MPP-2和MMP-9，MPP-2和MMP-9的表達(dá)水平的高低與細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力的大小呈正相關(guān)[20,21]。本實(shí)驗(yàn)Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)miR-9可明顯下調(diào)MPP-2和MMP-9蛋白表達(dá)，這提示過(guò)表達(dá)miR-9能夠降低TPC-1細(xì)胞侵襲和遷移能力。本實(shí)驗(yàn)以上這些結(jié)果表明，miR-9可能是甲狀腺癌的潛在治療靶標(biāo)。

Wnt/β-catenin信號(hào)通路是經(jīng)典的Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，也是目前研究最多的信號(hào)通路，在機(jī)體的生長(zhǎng)和發(fā)育中扮演重要角色[22]。β-catenin在Wnt/β-catenin信號(hào)通路中處于中心位置，其表達(dá)量及狀態(tài)標(biāo)志著該信號(hào)通路激活與否，當(dāng)β-catenin表達(dá)量升高時(shí)轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核，與相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子形成轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合物，誘導(dǎo)下游分子如c-Myc的表達(dá)。當(dāng)前研究表明，Wnt/β-catenin信號(hào)通路在人類多種惡性腫瘤中異常激活，促進(jìn)腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移[23]。據(jù)報(bào)道，在甲狀腺癌組織和細(xì)胞中中β-catenin的表達(dá)水平均明顯上調(diào)，且在分化型甲狀腺癌中的表達(dá)水平明顯高于未分化的型甲狀腺癌[24]。Wnt/β-catenin途徑在甲狀腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移中起著至關(guān)重要的作用。miRNA的基本功能是通過(guò)調(diào)控信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的。在本項(xiàng)研究中，Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR-9能夠明顯降低Wnt/β-catenin信號(hào)通路關(guān)鍵分子β-catenin及下游分子c-Myc的表達(dá)，這提示過(guò)表達(dá)miR-9能夠抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活。表明過(guò)表達(dá)miR-9后TPC-1細(xì)胞侵襲和遷移能力減弱與Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活抑制有關(guān)。

綜上所述，miR-9在甲狀腺癌細(xì)胞系中下調(diào)表達(dá)，過(guò)表達(dá)miR-9降低甲狀腺癌TPC-1細(xì)胞侵襲和遷移能力，這與抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活有關(guān)。這些結(jié)果表明，miR-9可能是甲狀腺癌治療潛在的治療靶標(biāo)。