崔秀玲 劉萍 趙曉琛 于麗麗 趙浩晨 繳寶杰

乳腺癌是全世界范圍內(nèi)的一種常見癌癥，是女性發(fā)病率最高的一種惡性腫瘤[1]。盡管手術旨在消除大多數(shù)腫瘤組織，但癌細胞仍可能擴散至血液和淋巴循環(huán)系統(tǒng)[2]，這可能導致癌癥復發(fā)，尤其是在手術和麻醉劑誘導的免疫抑制下[3]。因此，術后免疫力的提高對患者的生存至關重要。胸神經(jīng)阻滯通過在手術過程中阻斷胸神經(jīng)和肋間神經(jīng)而表現(xiàn)出相對較少的并發(fā)癥[4,5]。與Ⅰ型胸神經(jīng)阻滯相比，Ⅱ型胸神經(jīng)阻滯增加了肋間神經(jīng)外側(cè)支的二次注射[6]。先前研究報道，胸神經(jīng)阻滯可以達到更好的鎮(zhèn)痛效果[7]，減少手術期間阿片類藥物如瑞芬太尼和芬太尼的使用，并通過阻斷周圍神經(jīng)以減少術后的慢性疼痛[8]。手術和麻醉都會對免疫產(chǎn)生不利影響[9,10]。既往研究表明，手術應激與血管生成和轉(zhuǎn)移以及先天免疫和細胞免疫受到抑制相關[3]。NK細胞是天然免疫的重要組成部分，有助于保護機體免受腫瘤細胞的擴散[11,12]。因此，NK細胞的丟失可能潛在地提高了腫瘤轉(zhuǎn)移的風險[13]。胰腺小鼠模型的證據(jù)表明，NK細胞的丟失促進了腫瘤的進展[14]。曲妥珠單抗(trastuzumab)是一種常用的乳腺癌藥物，是一種單克隆抗體，可選擇性靶向作用于Her2。Her2陽性乳腺癌細胞的裂解能力主要取決于NK細胞介導的抗體依賴性細胞毒性(ADCC)，因此NK細胞在這一過程中起著關鍵作用。關于Ⅱ型胸神經(jīng)阻滯，我們旨在研究其是否能夠改善乳腺癌術后NK細胞的增殖和殺傷活性。除NK細胞外，也評估并比較了患者的其他免疫細胞，包括自然殺傷T(NKT)細胞、輔助T細胞和細胞毒性T細胞及相關細胞因子。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究經(jīng)滄州市中心醫(yī)院倫理委員會批準。所有患者均簽署知情同意書。本研究共納入232位被診斷為乳腺癌且經(jīng)美國麻醉醫(yī)師協(xié)會(ASA)身體狀況評分為Ⅰ和Ⅱ級的患者。所有登記的參與者都準備接受保乳手術/改良根治術。排除標準：(1) 18歲以下；(2)既往手術史和腫瘤史；(3)其他類型腫瘤；(4)心臟病、呼吸系統(tǒng)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病或其他疾病史；(5)凝血障礙或?qū)κ中g藥物過敏；(6)最近接受放療或化療(<8周)；(7)最近使用類固醇或阿片類藥物，酒精或其他非法藥物。根據(jù)標準排除后，納入196例患者。根據(jù)計算機生成的一組隨機數(shù)字將這些患者分為2組：單純?nèi)砺樽斫M(G組)和全身麻醉下的Ⅱ型胸神經(jīng)阻滯組(PG組)。住院期間，所有參與者都接受了合適的麻醉和手術。手術組和護理組對分組情況不知情，且所有患者均由同一名麻醉師麻醉。

1.2 麻醉方法 患者均接受利多卡因(河北天成藥業(yè)股份有限公司，1 mg/kg)，異丙酚(四川國瑞藥業(yè))和瑞芬太尼(江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司)的麻醉誘導和維持。調(diào)整瑞芬太尼劑量以使BIS值保持在40～60。采用靶控輸注(TCI)泵(Orchestra；Fresenius-Kabi，德國)，分別使用Schnider等[15,16]的藥代動力學模型來計算丙泊酚和瑞芬太尼的用量。PG組在全麻誘導后根據(jù)已發(fā)表的方法進行超聲引導下Ⅱ型胸神經(jīng)阻滯[17]。首先，在鎖骨外側(cè)三分之一處放置超聲探頭，以確定腋窩靜脈和動脈。然后將探頭移至胸大肌和小肌之間的位置。之后，在超聲引導下，在胸大肌和胸小肌之間斜置一根超聲針。然后，注射羅哌卡因(齊魯制藥有限公司，0.5%，10 ml)。然后將探針從第一根肋骨移到第三根肋骨，到達前鋸肌。推進針直到其尖端到達Pmm和SAM之間的潛在空間，將羅哌卡因(0.5%，20 ml)注入該區(qū)域。術中監(jiān)測心電圖、無創(chuàng)血壓、脈搏血氧飽和度、體溫、雙譜指數(shù)(40～60，BIS vista monitor revision 3.0；Aspect Medical Systems，USA)。當雙譜指數(shù)>60時，給予異丙酚0.5 μg/kg(間隔為1 min或更長時間)靜脈注射。當心率降至<50次/min時，靜脈注射阿托品0.5 mg。手術后，將確認自發(fā)呼吸和意識恢復的患者移至術后重癥監(jiān)護室，進行接下來的24 h監(jiān)測。

1.3 血樣采集 手術24 h后，將患者的血液樣本收集在肝素管中以進行外周血單核細胞(PBMC)分離，并用乙二胺四乙酸管進行細胞因子評估。采用Ficoll-Paque(GE Healthcare，瑞典)密度梯度離心法分離PBMC[18]，并冷凍于含10%二甲基亞砜(Sigma-Aldrich，美國)的熱滅活人AB血清(Sigma-Aldrich，美國)中。

1.3.1 NK細胞分離:根據(jù)制造商提供的流式細胞術方案，從抗CD56結(jié)合微球(英國MiltenyiBiotec)選擇的PBMC免疫中分離CD56+NK細胞。

1.3.2 細胞培養(yǎng)與凋亡檢測:為了在存在或不存在患者血清或NK細胞的情況下進行凋亡檢測，我們使用了人類原發(fā)性乳腺癌細胞HCC，該細胞系在含有10%胎牛血清(FCS，Sigma)的ATCC配制的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在指定的實驗中，使用樣品血清代替FCS。將NK和HCC細胞以1∶10的比例在含有指定血清的細胞培養(yǎng)基中共培養(yǎng)24 h。使用FITC-Annexin和碘化丙啶(Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒，Biofriend，CN)進行雙重染色，評估HCC細胞的凋亡率，并通過流式細胞儀進行分類。

1.3.3 NK細胞毒性:用K562靶向紅白血病細胞(美國模式培養(yǎng)集，美國)培養(yǎng)，檢測NK細胞的細胞毒性。細胞用羧基熒光素琥珀酰亞胺酯(Sigma Aldrich)染色，溫育4 h后收集。加入碘化丙錠(Becton Dickinson，美國)以確定死靶細胞。

2 結(jié)果

2.1 患者人口學資料與圍手術期臨床特點 共有232名患者參加了這項研究。在排除幾種情況后，納入196例患者。將患者隨機分為單純?nèi)榻M(G組，n=98)和全麻下Ⅱ型胸神經(jīng)阻滯組(PG組，n=98)。它們的特性如表1所示。2組患者在年齡、身高、體重、腫瘤分期、手術方式、ASA狀態(tài)等方面無明顯差異。但是，在手術過程中，PG組瑞芬太尼用量明顯低于G組(P=0.001)。G組與PG組其他生命體征(包括動脈壓、心率)無明顯差異。見表1～3。

表1 患者一般資料 n=98

2.2 全身麻醉下Ⅱ型胸神經(jīng)阻滯對NK細胞數(shù)量和功能的影響 為了探究2組的不同免疫應答，我們首先檢測了NK細胞的數(shù)量。G組術前NK細胞約占PBMC的(17.2±3.53)%，全麻后降至(13.36±3.07)%(P=0.023)。PG組NK細胞數(shù)無顯著性差異。比較2組術后NK細胞數(shù)量時，PG組顯示PBMC中NK細胞的占有率明顯高于G組(P=0.036)。對于G組和PG組，NK細胞的凋亡率在手術前后均未受到影響。PG組和G組NK細胞凋亡率也相近。術后2組NK細胞的殺傷活性均顯著降低(P<0.001)。

表2 患者麻醉、手術時間及術中藥物使用情況

表3 患者術中生命體征

然而，術后PG組比G組具有更多的功能性NK細胞(P=0.007)。見表4。

表4 手術期間使用Ⅱ型胸神經(jīng)阻滯對NK細胞的影響

表5 2組患者NKT、T輔助1細胞和細胞毒性T淋巴細胞的PBMC百分比

2.4 HCC細胞的凋亡率 我們研究了受試者的血清是否會影響HCC細胞的凋亡率。我們用正?；颊摺組和PG組患者的血清處理HCC細胞。在沒有NK細胞的情況下，3種處理之間沒有觀察到HCC凋亡率的差異。在存在NK細胞的情況下，G組患者(n=20)的血清與正常血清相比，顯著促進乳腺癌細胞凋亡。G組和PG組術后血清培養(yǎng)的乳腺癌細胞凋亡率明顯低于術前(G組，P<0.001；PG組，P=0.017)。但與PG組術后血清相比，G組術后血清明顯抑制乳腺癌細胞凋亡率(P=0.031)，說明G組術后血清對NK細胞功能的抑制作用可能強于PG組術后血清。在受試者血清補充培養(yǎng)基中與NK細胞共培養(yǎng)后HCC細胞的凋亡率。乳腺癌細胞在補充血清的培養(yǎng)基中單獨培養(yǎng)或與NK細胞一起培養(yǎng)。通過用FITC-Annexin V和碘化丙啶進行雙重染色來確定凋亡，并通過流式細胞術進行檢測。每個實驗重復3次(P<0.05)。見表6，圖1。

表6 2組患者HCC細胞的凋亡率

圖1 2組HCC細胞凋亡率比較

3 討論

我們的研究發(fā)現(xiàn)，與全身麻醉方法相比，Ⅱ型胸神經(jīng)阻滯在術中瑞芬太尼消耗量更少。PecsⅡ主要通過改變?nèi)橄侔┦中g患者血液中細胞比例來影響免疫系統(tǒng)。此外，PecsⅡ還增強了NK細胞的殺傷活性，表明PecsⅡ也對免疫細胞功能有影響。在最近的一項研究中也發(fā)現(xiàn)了類似的觀察結(jié)果[19]，與對照組相比，術前使用羅哌卡因進行Ⅱ型胸神經(jīng)阻滯，手術期間瑞芬太尼的用量顯著減少。

眾所周知，麻醉的選擇至關重要，因為它可能與癌癥的復發(fā)有關[3]。盡管手術切除可以去除大部分癌癥組織，但仍有少量癌細胞保留在體內(nèi)[20]。在這方面，麻醉誘導的免疫抑制和手術引起的應激可以幫助這些癌細胞的擴散和存活。除了對免疫系統(tǒng)的抑制作用外，在實驗和臨床上還發(fā)現(xiàn)手術與血管生成增加和促進轉(zhuǎn)移有關[3]。還發(fā)現(xiàn)阿片類麻醉藥物抑制細胞介導的免疫[21]，并促進腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移[22]。在大鼠模型中，發(fā)現(xiàn)瑞芬太尼可抑制NK細胞活性和淋巴細胞增殖[23]。在臨床研究中也觀察到瑞芬太尼對免疫的類似抑制作用[24,25]。因此，減少使用阿片類藥物如瑞芬太尼可能有益于癌癥患者的預后。

本研究發(fā)現(xiàn)術后外周血單核細胞中的NK細胞百分比及其殺傷活性顯著下降，這與手術和麻醉誘導的免疫抑制有關。令人印象深刻的是，使用Ⅱ型胸神經(jīng)阻滯對NK細胞數(shù)量和功能的抑制作用較小。我們是第一個發(fā)現(xiàn)Ⅱ型胸神經(jīng)阻滯對NK細胞具有支持作用的研究。這對于Ⅱ型胸神經(jīng)阻滯在外科手術中的進一步臨床應用至關重要，因為免疫調(diào)節(jié)可部分決定腫瘤的復發(fā)。術中未觀察到NKT和T淋巴細胞的變化。然而，之前有研究報道，手術可能導致T淋巴細胞和NKT細胞的顯著丟失[24,26,27]?？赡苁怯捎谑中g方式和癌癥類型的不同而導致了有爭議的結(jié)論。一篇文獻研究了丙泊酚對乳腺癌患者T淋巴細胞和NK細胞的影響，發(fā)現(xiàn)術后NK細胞數(shù)量明顯減少[28]。

在NK細胞存在的情況下，PG組術后血清培養(yǎng)的乳腺癌細胞凋亡率明顯高于G組。結(jié)果提示PG組可能含有更多支持NK細胞增殖或殺傷活性的細胞因子。

除了血液中的這些免疫細胞外，研究PecsⅡ阻滯是否對腫瘤微環(huán)境中的免疫細胞有影響也很重要。例如，腫瘤組織和周圍基質(zhì)區(qū)的腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)或PD-1和PD-L1水平是確定Pecs-Ⅱ阻滯如何影響與腫瘤微環(huán)境相關的免疫功能的重要參數(shù)，本研究省略了這些參數(shù)。但是，在我們的進一步研究中，有必要研究PecsⅡ阻斷對腫瘤微環(huán)境中免疫系統(tǒng)的影響。

綜上所述，術后Ⅱ型胸神經(jīng)阻滯可增加外周血單核細胞(PBMC)中NK細胞數(shù)量，增強其殺傷活性，改善乳腺癌患者免疫功能。