帥歡 唐繼軍 凌利平

糖尿病腎病是糖尿病中常見的一種微血管并發(fā)癥，且常伴隨炎癥狀態(tài)。嚴重時可直接導(dǎo)致腎功能不全，是導(dǎo)致患者殘疾和死亡的重要因素之一[1]。因此早期的預(yù)防和治療是減少和避免糖尿病腎病發(fā)生的關(guān)鍵。有研究表明，腦信號蛋白3A的表達能夠作為診斷糖尿病腎病的發(fā)生及蛋白尿嚴重程度的重要指標[2]。腦信號蛋白3A是能夠通過調(diào)節(jié)神經(jīng)生長導(dǎo)向軸突生長方向，隨著更多的研究證明，其還能夠參與細胞的遷移、腫瘤生長和免疫反應(yīng)等多種生物學(xué)功能[3]。但目前筆者所見臨床上對腦信號蛋白3A于糖尿病腎病影響機制研究較少，因此在本文研究中為尋找治療糖尿病腎病的方向，建立糖尿病腎病模型大鼠，通過抑制腦信號蛋白3A的表達，觀察下調(diào)腦信號蛋白3A對糖尿病腎病大鼠的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究動物：選取SPF級40只SD健康大鼠(北京維通利華實驗動物有限公司，合格證號：SCXK20060009)，由基爾頓生物科技(上海)有限公司提供，鼠齡(3.5±0.2)個月，體重(219.7±8.5)g。大鼠均養(yǎng)殖在干凈籠子里，室溫(22.1±1.8)℃，相對濕度35%～40%，每天光照12 h，喂飲純凈水，飼養(yǎng)時間1周。本實驗均獲得醫(yī)院倫理委員會批準。

1.1.2 主要試劑：大鼠抗小鼠TGF-β1抗體(上海一基實業(yè)有限公司)；小鼠抗大鼠α-SMA抗體(沈陽萬類生物科技有限公司)；兔抗大鼠骨形成蛋的(BMP7)抗體、E-Cadherin抗體(武漢菲恩生物科技有限公司)；兔抗小鼠Smad6抗體(上海恒斐生物科技有限公司)；24 h尿微蛋白 ELISA試劑盒(南京卡米洛生物工程有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 分組、建模及給藥:隨機選取40只大鼠中10只作為正常組，剩余大鼠參照陳衛(wèi)東等[4]研究實驗中糖尿病腎病模型大鼠建立方法建立模型，30只大鼠均通過高糖高脂飼料喂養(yǎng)4周后，進行腹腔注射，一次性注射55 mg/kg的鏈脲佐菌素，正常組給予普通飼料喂養(yǎng)，腹腔注射枸椽酸鹽緩沖液，72 h后使用血糖儀測定血糖，血糖≥16.7 mmol/L，則表示糖尿病模型建造成功，24 h尿量大于造模前50%且24 h尿蛋白排泄率>30 mg/24 h，表示糖尿病腎病模型制備成功。將建模成功的30只糖尿病腎病模型大鼠隨機分為模型組、上調(diào)組、下調(diào)組，每組10只。

1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染:取大鼠過上調(diào)組、下調(diào)組大鼠腎臟組織細胞，在培養(yǎng)瓶中進行融合，融合率在75%時，行胰酶消化，之后使用細胞計數(shù)法對消化后的細胞密度進行測量，然后將細胞植于六孔板中，大約種植4×105個細胞，加入新鮮培養(yǎng)基，進行培養(yǎng)，并在5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中孵育，當(dāng)融合率在40%～80%時，取1.5 μl DNA溶于100 μl雙抗培養(yǎng)基中，進行混合，混合后進行離心處理，并在EP管中加入12 μl的PolyFect Reagent，上下顛倒5次，混勻處理，之后進行靜置5～10 min，對轉(zhuǎn)染復(fù)合物起到促進作用，并吸去六孔板加入，在含有轉(zhuǎn)染復(fù)合體的EP管中加入含有血清和雙抗的600 μl完全培養(yǎng)基，顛倒2次，進行搖晃，促進復(fù)合物的均勻分布，然后之后進行培養(yǎng)24 h后換液處理，倒置，使用熒光顯微鏡下對熒光亮度進行觀察，然后進行收集，提取RNA，將轉(zhuǎn)染效率最高的質(zhì)粒組、空載組稀釋液接種于10 mm2培養(yǎng)皿中，使用40 μl 嘌呤霉素至每孔常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)3天后棄去培養(yǎng)液,選取PCR驗證篩選的細胞消化處理并稀釋，稀釋后置于24孔板中，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的腦信號蛋白3A上調(diào)組(上調(diào)組)、腦信號蛋白3A下調(diào)組(下調(diào)組)。

1.2.3 切片及染色：取大鼠腎臟組織，在4%多聚甲醛進行固定、脫水透明，浸蠟包埋，脫蠟、HE染色，之后脫水、透明，待封片晾干后在顯微鏡下觀察大鼠腎臟組織病理學(xué)表現(xiàn)。

1.2.4 BUN、Scr、UA、血糖、糖化血紅蛋白、24 h尿微蛋白、血脂水平檢測：采用Olympus AU640全自動生化測定儀對尿素氮(BUN)、血清肌酐(Scr)、尿酸(UA)、血糖、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)水平進行檢測；采用TOSOH公司生產(chǎn)的G7糖化血紅蛋白分析儀對糖化血紅蛋白進行檢測；采用放射免疫法對24 h尿微蛋白水平進行檢測。

1.2.5 GSH-Px、GSH、CAT水平檢測:采用DNTB比色法對超氧化物歧化酶(GSH-Px)活性進行檢測；采用Beutler改良法對谷胱甘肽(GSH)含量進行檢測；采用容量法對過氧化氫酶(CAT)活性進行檢測。

1.2.6 腎小球結(jié)構(gòu)指標檢測:采用ImageJ1.40圖像分析軟件對腎小球基底膜厚度、足突寬度進行測量。

1.2.7 TGF-β1/Smad6/BMP7通路蛋白檢測：使用蛋白免疫印跡(Western blot)對TGF-β1/Smad6/BMP7中TGF-β1、BMP7、α-SMA、Smad6、E-Cadherin通路蛋白進行檢測，提取大鼠肺組織中的樣品總蛋白，將其與上樣緩沖液按比例混合，煮沸5 min后，進行電泳，并將蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜，使用5%的脫脂奶粉封閉1～2 h，然后加入一抗溶液TBST(TGF-β1、BMP7、α-SMA、Smad6、E-Cadherin按照1∶1 000稀釋)，在4℃條件下進行震蕩過夜，再次洗滌，放入二抗溶液TBST(TGF-β1、BMP7、α-SMA、Smad6、E-Cadherin按照1∶5 000稀釋)，室內(nèi)震蕩120 min后，洗滌，顯色成像，使用軟件分析蛋白條帶灰度值。內(nèi)參蛋白是GAPDH。

2 結(jié)果

2.1 腎臟組織病理學(xué)觀察 正常組大鼠腎小管間質(zhì)結(jié)構(gòu)正常；模型組腎小球肥大，重度系膜細胞增生，腎間質(zhì)炎性細胞浸潤；上調(diào)組腎小球嚴重肥大，伴隨重度增生和大量炎性細胞浸潤；下調(diào)組大鼠少量膠原纖維化，間質(zhì)輕度纖維化，少量炎性細胞浸潤。見圖1。

正常組 模型組 上調(diào)組 下調(diào)組

2.2 4組大鼠BUN、Scr、UA水平比較 模型組、上調(diào)組、下調(diào)組大鼠BUN、Scr、UA水平高于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；上調(diào)組大鼠BUN、Scr、UA水平高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；下調(diào)組大鼠BUN、Scr、UA水平低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；下調(diào)組大鼠BUN、Scr、UA水平低于上調(diào)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 4組大鼠BUN、Scr、UA水平比較

2.3 4組大鼠血糖、糖化血紅蛋白、24 h尿微蛋白比較 模型組、上調(diào)組、下調(diào)組大鼠血糖、糖化血紅蛋白、24 h尿微蛋白高于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；上調(diào)組、大鼠血糖、糖化血紅蛋白、24 h尿微蛋白高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；下調(diào)組大鼠血糖、糖化血紅蛋白、24 h尿微蛋白低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；下調(diào)組大鼠血糖、糖化血紅蛋白、24 h尿微蛋白低于上調(diào)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 4組大鼠血糖、糖化血紅蛋白、24 h尿微蛋白比較

2.4 4組大鼠血脂水平比較 模型組、上調(diào)組、下調(diào)組大鼠TG、TC、LDL-C、HDL-C水平高于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；上調(diào)組、大鼠TG、TC、LDL-C、HDL-C水平高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；下調(diào)組大鼠TG、TC、LDL-C、HDL-C水平低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；下調(diào)組大鼠TG、TC、LDL-C、HDL-C水平低于上調(diào)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 4組大鼠血脂水平比較

2.5 4組大鼠氧化抗氧化酶水平比較 模型組、上調(diào)組、下調(diào)組大鼠GSH-Px、GSH、CAT水平低于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；上調(diào)組大鼠GSH-Px、GSH、CAT水平低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；下調(diào)組大鼠GSH-Px、GSH、CAT水平高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；下調(diào)組大鼠GSH-Px、GSH、CAT水平高于上調(diào)組(P<0.05)。見表4。

表4 4組大鼠氧化抗氧化酶水平比較

2.6 4組大鼠腎小球結(jié)構(gòu)指標比較 模型組、上調(diào)組、下調(diào)組大鼠腎小球基底膜厚度、足突寬度高于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；上調(diào)組大鼠腎小球基底膜厚度、足突寬度高于模型組(P<0.05)；下調(diào)組大鼠腎小球基底膜厚度、足突寬度低于模型組(P<0.05)；下調(diào)組大鼠腎小球基底膜厚度、足突寬度低于上調(diào)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表5。

表5 4組大鼠腎小球結(jié)構(gòu)指標比較

2.7 4組大鼠腎組織TGF-β1/Smad6/BMP7信號通路蛋白表達量比較 模型組、上調(diào)組、下調(diào)組大鼠腎組織中TGF-β1、α-SMA蛋白表達量高于正常組，且Smad6、BMP7、E-Cadherin蛋白表達量低于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；上調(diào)組大鼠腎組織中TGF-β1、α-SMA蛋白表達量高于模型組，且Smad6、BMP7、E-Cadherin蛋白表達量低于模型組，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；下調(diào)組大鼠腎組織中TGF-β1、α-SMA蛋白表達量低于模型組，且Smad6、BMP7、E-Cadherin蛋白表達量高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；下調(diào)組大鼠腎組織中TGF-β1、α-SMA蛋白表達量低于上調(diào)組，且Smad6、BMP7、E-Cadherin蛋白表達量高于上調(diào)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表6，圖2。

表6 4組大鼠腎組織TGF-β1/Smad6/BMP7信號通路蛋白表達量比較

圖2 腎組織中TGF-β1/Smad6/BMP7通路蛋白Western blot圖

3 討論

糖尿病腎病是指糖尿病微血管病變最終導(dǎo)致腎小球硬化一種疾病，又稱為糖尿病腎小球綜合征。高血糖是引起腎臟微血管病變的主要原因之一，而高血壓和高血脂是導(dǎo)致疾病加重的重要因素[5,6]。張馨元等[7]研究表明，足細胞的表觀遺傳修飾、氧化應(yīng)激、糖代謝異常、血流動力學(xué)改變、炎性細胞因子、胰島素抵抗等損傷機制及相關(guān)蛋白的影響作用，對糖尿病腎病的調(diào)控機制及疾病進展具有重要意義。

腦信號蛋白3A是由多個不同功能的亞群組成，其所有成員均有一個高度保守的氨基酸序列，由500多個氨基酸組成，被稱為Sema結(jié)構(gòu)域[8]。其結(jié)構(gòu)域是腦信號蛋白發(fā)揮作用的重要結(jié)構(gòu)。有研究表明，腦信號蛋白3A是抑制神經(jīng)軸突延伸發(fā)展的重要結(jié)構(gòu)，且包含這多種氨基酸序列[9]。糖尿病是糖尿病腎病重要的并發(fā)癥之一，目前，其發(fā)病率僅次于腎小球炎，呈逐年上升趨勢。本研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)組大鼠BUN、Scr、UA水平低于上調(diào)組，此結(jié)果說明，抑制腦信號蛋白3A的表達，能夠降低對腎組織中BUN、Scr、UA水平，且減少對腎組織的損傷。有研究表明，腦信號蛋白3A在足突細胞及集合管內(nèi)皮細胞中均呈現(xiàn)出高表達[10]。腦信號蛋白3A的過度表達可直接導(dǎo)致腎小球內(nèi)皮細胞損傷，并對腎小球基膜也會造成一定的損害。腦信號蛋白3A在正常機體內(nèi)并不表達，在尿鏈佐菌素至糖尿病腎病大鼠模型中，隨著時間的增加其表達顯著升高。孫藝欣[11]等研究表明，Sema 3A與早期腎損傷的發(fā)生密切相關(guān)，可作為CIAKI的早期生物標志物。因此在本文中通過抑制腦信號蛋白3A表達，觀察對糖尿病腎病大鼠的影響，結(jié)果顯示，抑制腦信號蛋白3A能夠降低對腎組織的損傷，效果顯著。

糖尿病的發(fā)生會對腎臟產(chǎn)生嚴重的損傷，時腎小球體積增大，系膜細胞發(fā)生增生、肥大等情況，部分腎小管組織出現(xiàn)空泡變性，出現(xiàn)細胞凋亡情況。糖尿病腎病的發(fā)生會對血糖、血脂水平造成嚴重的影響。有研究表明，血糖波動幅度過大會加劇DN患者機體炎癥狀態(tài)，損害患者肝腎功能[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)組大鼠血糖、糖化血紅蛋白、24 h尿微蛋白、血脂水平均低于上調(diào)組，此結(jié)果說明，抑制腦信號蛋白3A，能夠降低血糖、糖化血紅蛋白、24 h尿微蛋白、血脂表達水平，降低腎組織損傷程度。與張莉等[13]研究結(jié)果一致。糖尿病腎病蛋白尿的發(fā)生是一個復(fù)雜的病理過程，其關(guān)系到腎小球的過濾狀態(tài)、足細胞凋亡、腎小管損傷等。在本文研究中發(fā)現(xiàn)，下調(diào)組大鼠氧化抗氧化酶水平高于上調(diào)組，且腎小球基底膜厚度、足突寬度低于上調(diào)組，由此可得，抑制腦信號蛋白3A能夠提高氧化抗氧化酶水平，且減少對腎小管結(jié)構(gòu)指標的損傷。廖正[14]的研究表明，Sema3A過表達可誘導(dǎo)腎足細胞足突消失或發(fā)育延遲，抑制輸尿管芽分支和腎小球血管正常形成，導(dǎo)致腎小球發(fā)育不良和蛋白尿。與本文研究結(jié)果保持一致。

腎小管上皮細胞間質(zhì)化，在一定條件下其過程是可逆的。TGF-β1/Smad6/BMP7信號通路能夠參與細胞間質(zhì)化的過程，TGF-β1具有促進細胞外基質(zhì)的合成和沉積，進而誘導(dǎo)細胞的凋亡，參與炎癥的發(fā)生，能夠在多個方面加快糖尿病腎病的病程進展[15]。Smads蛋白家族是TGF-β1受體激酶的底物，也是其通路中重要的信號傳導(dǎo)分子[16]。BMP7能夠通過抑制腎小管上皮細胞膠原和α-SMA的表達，逆轉(zhuǎn)細胞間質(zhì)。Smad6和BMP7在糖尿病腎病腎纖維化的進展中發(fā)揮著重要做用，是保護腎臟組織的重要因子[17]。α-SMA是一種肌纖細胞蛋白，其主要寄存與正常腎血管的平滑及細胞中，若其他其細胞中表達，則說明上皮間質(zhì)發(fā)生病變[18,19]。e-cadherin是屬于跨膜蛋白，也是鈣粘附蛋白E，是一種鈣依賴性的跨膜蛋白，且能夠參與細胞與細胞之間的黏附，其主要分布于人和動物的上皮細胞，能夠維持細胞的極性和完整性[20]。因此本研究中對TGF-β1/Smad6/BMP7通路蛋白表達量進行檢測，結(jié)果顯示，下調(diào)組大鼠腎組織中TGF-β1、BMP7、α-SMA蛋白表達量低于上調(diào)組，且Smad6、E-Cadherin蛋白表達量高于下調(diào)組，此結(jié)果說明，抑制腦信號蛋白3A可有效改善大鼠腎組織TGF-β1、BMP7、α-SMA、Smad6、E-Cadherin蛋白表達量，減少腎損傷。

綜上所述，抑制腦信號蛋白3A能夠減少腎小球內(nèi)皮細胞和足突細胞的損傷，降低對腎小球基膜的損害，其作用機制可能與調(diào)控TGF-β1/Smad6/BMP7信號通路有關(guān)。