吳黎黎， 王君蘭

(遼寧省盤錦市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科一區(qū)， 遼寧 盤錦 124010)

缺血性腦卒中是由各類原因所致腦組織供血障礙，引起局部腦組織缺氧、缺血病變壞死，所致神經(jīng)功能受損表現(xiàn)，約占全部腦血管疾病的60%～90%[1]。包括短暫性腦缺血發(fā)作及急性腦卒中，后者相對常見，發(fā)病率高達(dá)110/10萬，致殘率超過13%。目前對急性腦卒中治療主要圍繞恢復(fù)腦血流灌注及保護(hù)腦組織功能展開，手段包括溶栓及介入治療等，但該病進(jìn)展快，絕大多數(shù)存活患者仍遺留不同程度后遺癥，喪失部分或全部勞動能力，給社會及家庭帶來沉重經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。而盡早對缺血性腦卒中做病因診斷，及時確定針對性治療方案，對挽救患者生命，降低致殘率，改善其預(yù)后有重要的價值。腦鈉肽(brain natriuretic peptide，BNP)屬特異性心腦血管生物學(xué)標(biāo)志物，主要由心臟分泌，有利尿、排納、降壓、擴血管、抑制交感神經(jīng)興奮、降壓等作用[2]。國外已有報道[3]證實，心室BNP水平可預(yù)測急性腦卒中發(fā)生風(fēng)險。但對血漿BNP與缺血性腦卒中短期預(yù)后的關(guān)系尚未完全明確。微小RNA(microRNA，miRNA)系由核苷酸組成的小型非編碼RNA，幾乎參與所有已知生物學(xué)調(diào)控過程，與細(xì)胞分化、凋亡、胚胎發(fā)育密切相關(guān)。最新研究[4]發(fā)現(xiàn)，miR-29b介導(dǎo)大鼠神經(jīng)損傷，參與腦缺血/再灌注損傷病理過程。推測miR-29b可能參與缺血性腦卒中發(fā)病。本研究旨在探究BNP、miR-29b在缺血性腦卒中發(fā)病中的作用及其患者神經(jīng)功能受損、短期預(yù)后的關(guān)系，以期為缺血性腦卒中防治及預(yù)后改善提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1研究對象：回顧性采集2017年2月至2019年5月我院收治發(fā)病24h內(nèi)入院的急性缺血性腦卒中患者108例作為病例組。入選標(biāo)準(zhǔn)：年齡>18歲；缺血性腦卒中診斷滿足美國心臟協(xié)會/美國卒中協(xié)會發(fā)布的缺血性腦卒中診斷標(biāo)準(zhǔn)：急性起??；局灶性神經(jīng)功能缺損；影像學(xué)證實或癥狀及體征持續(xù)超過24h；排除非血管性病因[5]；均為首發(fā)病例，發(fā)病24h內(nèi)入院；隨訪資料完善。排除標(biāo)準(zhǔn)：既往有短暫性腦缺血發(fā)作、顱腦外傷、卒中史；合并心力衰竭、心肌梗死及其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病史；合并全身惡性腫瘤；入院時存在心絞痛；心電圖提示心律失?；蛐募∪毖?；年齡>80歲；近3個月內(nèi)有外科手術(shù)史；急慢性感染；全身血液系統(tǒng)疾病；合并其他血管閉塞性疾病；心肝腎肺功能不全；臨床資料不全。采集同期來醫(yī)院體檢的與病例組性別、年齡相匹配的40例正常健康人作為對照組。均經(jīng)體格檢查證實身體健康，無心腦血管疾病。兩組性別、年齡、吸煙飲酒情況對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，具有可比性(P>0.05)，見表1。

表1 兩組一般資料對比

1.2方法：入院24h內(nèi)采集病例組空腹外周靜脈血標(biāo)本5mL，對照組于體檢當(dāng)日采集外周靜脈血5mL，3000r/min離心15min，分離血漿，循環(huán)增強熒光免疫定量法測定血漿BNP濃度，試劑盒購自星童醫(yī)療技術(shù)(蘇州)有限公司。采用實時熒光定量聚合酶聯(lián)反應(yīng)法(RealTime-quantitative-polymerase chain reaetion，qRT-PCR)法測定miR-29b水平，miR-29b引物由南京建成生物工程有限公司設(shè)計及合成，引物序列：上游：5'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAACACTG-3'，下游：5'-ACTGCTACGACCATTTGAAATCA-3'，內(nèi)參U6引物序列：上游：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。按照Trizol抽提試劑盒(Invirogen公司)提取總RNA，紫外分光光度計(U-2001型，日本日立公司)確定其純度及濃度滿意后，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，上美國ABI公司7300型熒光定量PCR反應(yīng)系統(tǒng)進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系：SYBR qPCR Master Mix 10 μL+上下游引物各0.5 μL+cDNA 1μL+ddH2O補足至20 μL，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸5 s，擴增40個循環(huán)，結(jié)束后分析熔點曲線，升溫幅度0.5℃/次，5 s/次。以U6為內(nèi)參，采用2-△△CT公式計算miR-29b相對表達(dá)量。

1.3神經(jīng)功能評估：病例組所有患者入院24h內(nèi)均采用美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表(the National Institutes of Health Stroke Scale，NIHSS)[6]進(jìn)行神經(jīng)功能評估，量表包括意識水平、凝視、視野、面癱、上下肢運動、共濟(jì)失調(diào)、感覺、語言、忽視、構(gòu)音障礙等方面，評分0～42分。輕度神經(jīng)功能障礙：1～4分；中度：5～15分；中重度：16～20分；重度：>20分。

1.4短期預(yù)后評估：出院90d后門診復(fù)查時采用改良Rankin量表(modified rankin scale score，mRS)[7]評定短期預(yù)后，由3名高資歷醫(yī)師進(jìn)行盲法評估，最終評分取3為醫(yī)師均值作為最終結(jié)果。0分：完全無癥狀；1分：輕度癥狀，但無明顯功能障礙，可完成日常生活及工作；2分：輕度殘疾，無法完全病前所有活動，但無需照料可完成日?；顒?；3分：中度殘疾，日常生活需部分幫助，但可獨立行走；4分：中重度殘疾，無法獨立行走，日常生活需幫助；5分：重度殘疾，臥床，日常生活完全依賴他人。并根據(jù)mRS評分分為預(yù)后良好組(≤2分，n=69)與預(yù)后不良組(>2分，n=39)，并采集所有患者基線資料、合并疾病、實驗室指標(biāo)、神經(jīng)缺損功能評分、梗死面積(依據(jù)梗死范圍及直徑分為大面積與非大面積梗死，大面積梗死梗死灶范圍超過1個腦葉，直徑>4cm，非大面積梗死灶直徑≤4cm)等情況，單因素及多因素分析篩選預(yù)后影響因素。

2 結(jié) 果

2.1病例組與對照組血BNP、miR-29b水平比較：病例組血BNP水平高于對照組，miR-29b表達(dá)量低于對照組(P<0.05)，見表2。

表2 病例組與對照組血BNP miR-29b水平比較

2.2不同短期預(yù)后患者血BNP、miR-29b及NIHSS評分比較：預(yù)后良好組BNP濃度及NIHSS評分低于預(yù)后不良組(P<0.05)，miR-29b相對表達(dá)量高于預(yù)后不良組(P<0.05)，見表3。

表3 不同短期預(yù)后患者血BNP miR-29b及NIHSS評分比較

2.3缺血性腦卒中短期預(yù)后影響因素單因素分析：預(yù)后良好組與預(yù)后不良組性別、吸煙、飲酒、身體質(zhì)量指數(shù)(Body mass index，BMI)、合并高脂血癥、合并冠心病、合并糖尿病等資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，預(yù)后不良組年齡≥60歲所占比例、合并高血壓所占比例、大面積梗死所占比例、神經(jīng)功能缺損程度為中重度及以上比例均高于預(yù)后良好組(P<0.05)，見表4。

表4 缺血性腦卒中短期預(yù)后影響因素單因素分析n(%)

2.4缺血性腦卒中短期預(yù)后影響因素多因素分析：以缺血性腦卒中短期預(yù)后作為因變量(預(yù)后良好=0，預(yù)后不良=1)，并納入單因素分析中有統(tǒng)計學(xué)意義的數(shù)據(jù)作為自變量進(jìn)行賦值，年齡：<60歲=0，≥60歲=1；合并高血壓：否=0，是=1；梗死面積：非大面積=0，大面積=1；NIHSS評分：輕度=0，中度=1，中重度=2，重度=3；BNP=實際值；miR-29 b=實際值，進(jìn)入多因素Logistic回歸方程，結(jié)果顯示：年齡、合并高血壓、梗死面積、NIHSS評分、BNP及miR-29b均為缺血性腦卒中患者短期預(yù)后影響因素(P<0.05)，見表5。

表5 缺血性腦卒中短期預(yù)后影響因素多因素分析

2.5缺血性腦卒中NIHSS評分、mRS評分與BNP、miR-29b相關(guān)性分析：相關(guān)性分析顯示：缺血性腦卒中患者BNP與NIHSS評分、mRS評分呈正相關(guān)(r=0.467、0.523，P均<0.05)，miR-29b與NIHSS評分、mRS評分呈負(fù)相關(guān)(r=-0.375、-0.413，P均<0.05)。

3 討 論

BNP最早由豬腦分離，系含多個氨基酸殘基多肽類激素，人BNP基因主要分布于心臟、腦、消化系統(tǒng)及泌尿系統(tǒng)內(nèi)。其中心臟BNP濃度最高，主要在心室內(nèi)合成及分泌，心室機械牽拉或心臟負(fù)荷過載時，心臟內(nèi)壁壓力上升，心肌釋放BNP，在調(diào)節(jié)心血管內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性、降低體循環(huán)血管阻力方面有重要作用。已證實BNP具有多種生物學(xué)活性，屬機體自身調(diào)節(jié)的重要保護(hù)機制，正常生理條件下，BNP濃度極低，但在物理牽拉刺激、缺血缺氧等代謝刺激下BNP濃度異常上調(diào)[8]。近年來，BNP在心血管疾病中的作用引起研究者的關(guān)注。最新研究[9]發(fā)現(xiàn)，血漿BNP與腦血管疾病發(fā)生呈密切關(guān)聯(lián)。本研究發(fā)現(xiàn)，急性缺血性腦卒中患者血BNP明顯高于正常健康人，這與以上報道結(jié)論相符，且支撐Bassan等[10]研究結(jié)論，推測BNP濃度異常上調(diào)或可能提示急性缺血性腦卒中發(fā)病，分析其機制可能為：①急性腦卒中時機體處于缺氧、缺血狀態(tài)，造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂，引起繼發(fā)性水腫，直接刺激BNP代償性分泌，以發(fā)揮擴血管、利鉀、利尿作用，舒張血管平滑肌，降低外周血管阻力，改善缺氧、缺血性損傷；②急性腦卒中引發(fā)下丘腦缺血性損傷可進(jìn)一步刺激BNP濃度上調(diào)；③急性腦卒中、尤其合并高血壓急性腦卒中患者外周容量負(fù)荷增加，心室、心房壁及主動脈壓力器負(fù)荷過載均可刺激BNP大量釋放；④腦組織受損后，腦局部代償性釋放BNP擴張小動脈、側(cè)支循環(huán)，增加腦血流量，故引起B(yǎng)NP濃度異常上升。但目前對BNP與急性腦卒中預(yù)后的關(guān)系尚未明確。本研究按短期預(yù)后分組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)預(yù)后良好組BNP濃度較預(yù)后不良組低，同時單因素、多因素分析均證實BNP為急性缺血性腦卒中預(yù)后影響因素，且與患者神經(jīng)功能、mRS評分呈正相關(guān)，提示BNP濃度異常改變可能與急性缺血性腦卒中近期預(yù)后緊密相關(guān)，推測BNP或可反映缺血性腦卒中病情嚴(yán)重程度，并間接預(yù)測其近期轉(zhuǎn)歸。

miR-29b則為近年來發(fā)現(xiàn)與腦組織神經(jīng)細(xì)胞增殖、分化密切相關(guān)的miRNA。劉靜[11]建立局灶性腦缺血大鼠模型發(fā)現(xiàn)miR-29b水平明顯下調(diào)，認(rèn)為miR-29b異常下調(diào)與腦組織缺血損傷有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，急性缺血性腦卒中患者外周血miR-29b較正常健康人低，且與神經(jīng)功能缺損程度及患者短期預(yù)后緊密相關(guān)，與上述研究存在相似點，分析可能的機制為：內(nèi)源性/線粒體途徑系與miR-29b密切相關(guān)的細(xì)胞凋亡途徑，主要呈現(xiàn)依賴caspase的細(xì)胞凋亡模式，受Bcl-2基因調(diào)控；腦缺血損傷時，神經(jīng)細(xì)胞接受信號后傳遞至Bcl-2相關(guān)信號通路，導(dǎo)致促凋亡蛋白構(gòu)象改變，與其他抗凋亡因子共同發(fā)揮抗凋亡作用，增加線粒體膜通透性，引起caspase級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡；而miR-29b可抑制抗凋亡蛋白表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而發(fā)揮腦保護(hù)作用。miR-29b表達(dá)異常降低，考慮主要與腦組織代償性修復(fù)有關(guān)，推測其降低幅度越高，腦組織損傷越嚴(yán)重，神經(jīng)缺損程度越高，提示更差的近期預(yù)后。但本研究結(jié)論與鄒燕等[12]提出的缺血性腦卒中外周血miR-29b上調(diào)的結(jié)論存在區(qū)別，分析產(chǎn)生此類差異的原因可能與采血時間點差異、腦缺血模型不同、檢測方式差別及樣本數(shù)量差異有關(guān)，對缺血性腦卒中血循環(huán)miR-29b變化特點尚待進(jìn)一步擴充樣本量、排除干擾因素、展開多中心隨機雙盲研究證實。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，高齡、合并高血壓、神經(jīng)缺損程度較高、梗死面積較大的急性缺血性腦卒中患者有更差的近期預(yù)后，這與前期葉小軍等[13]研究結(jié)論相符，考慮高齡病例各器官功能及免疫功能逐漸退化，患病后機體代償修復(fù)能力差，故呈現(xiàn)更差的臨床預(yù)后。而合并高血壓急性缺血性腦卒中患者血流動力學(xué)改變更突出，尤其腦缺血區(qū)域血管收縮反應(yīng)更嚴(yán)重，導(dǎo)致腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)激活，生物活性肽類物質(zhì)釋放增多，進(jìn)一步加重腦卒中后缺血區(qū)神經(jīng)細(xì)胞損傷，導(dǎo)致神經(jīng)功能缺損，引起不良預(yù)后。而大面積梗死及神經(jīng)缺損程度較高患者急性期神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)應(yīng)激性改變更明顯，導(dǎo)致炎癥因子分泌增多，加重心室負(fù)荷，導(dǎo)致預(yù)后不良。

綜上，急性缺血性腦卒中患者血漿腦鈉肽高于正常人，miR-29b水平低于正常人，且與與患者神經(jīng)功能缺損程度及短期預(yù)后密切相關(guān)，均為影響短期預(yù)后的相關(guān)因素。