彭恩蘭， 冀建峰， 熊 勰， 柯傳慶

(中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第908醫(yī)院， 江西 南昌 330002)

急性粒單核細(xì)胞白血病(acute myelomonocytic leukemia，AMML)屬于造血系統(tǒng)的克隆性惡性疾病，約占急性髓細(xì)胞性白血病(髓系造血干/祖細(xì)胞惡性疾病)的6.2%，可見于任何年齡，但多見于老年人[1]。目前臨床治療AMML的主要手段是支持治療及化療，雖然可在一定程度上緩解患者癥狀，但部分老年患者常常合并髓外浸潤(rùn)、染色體核型異常比例高等情況，加之化療耐受性較弱，預(yù)后不佳[2]。近年，雖有研究[3]發(fā)現(xiàn)泛素羧基末端水解酶蛋白(BRCA1 associated protein 1，BAP1)可能與白血病的發(fā)病有一定聯(lián)系，這也在一定程度上提高急性髓細(xì)胞白血病診治水平，但目前尚未發(fā)現(xiàn)與AMML發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后相關(guān)的分子標(biāo)志物。故尋求可早期預(yù)測(cè)AMML患者預(yù)后的指標(biāo)成為研究熱點(diǎn)，對(duì)指導(dǎo)臨床治療AMML具有重要意義。腎母細(xì)胞瘤過度表達(dá)基因(nephroblastoma over-expressed gene，NOV)是一種胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白，在調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化及血管形成等過程中發(fā)揮重要作用。研究[4]顯示，NOV表達(dá)參與多種腫瘤的發(fā)生及發(fā)展過程，且在腫瘤中的表達(dá)多種多樣，作用機(jī)制也不同，甚至完全相反，且在慢性髓系白血病中具有負(fù)向調(diào)節(jié)作用。故而推測(cè)NOV表達(dá)與AMML患者的預(yù)后可能存在一定聯(lián)系，但目前與之相關(guān)的研究較少。本研究主要觀察NOV在AMML患者骨髓中的表達(dá)，探討NOV基因的表達(dá)與AMML患者預(yù)后的關(guān)系，以期為該類疾病預(yù)后的早期預(yù)測(cè)、治療提供思路。具示如下。

1 資料與方法

1.1一般資料:選取2015年1月至2018年12月本院收治的41例AMML患者為研究對(duì)象，所有患者均接受支持療法、化療等綜合療法干預(yù)，并隨訪17個(gè)月。其中男24例，女17例；年齡52～73歲，平均年齡(62.65±3.38)歲；體質(zhì)量指數(shù)(Body Mass Index，BMI)17.5～26.36kg/m2，平均(23.40±1.21)kg/m2；合并基礎(chǔ)疾?。焊哐獕?3例、糖尿病9例；白細(xì)胞3.2～65.8×109L-1，平均(25.66±5.21)×109L-1；中性粒細(xì)胞比例32～46%，平均(39.68±2.11)%。本研究通過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，且患者及家屬對(duì)本次研究知情，并簽署知情同意書。

1.2入選標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有患者均符合《WHO(2008)造血與淋巴組織腫瘤分類》[5]中AMML的診斷標(biāo)準(zhǔn)，且經(jīng)臨床表現(xiàn)(患者存在齒齦增生、腫脹、出血、壞死、出血等；且存在蛋白尿、皮膚白血病病損，腸壁潰瘍、浸潤(rùn)等)、血象(血紅蛋白、紅細(xì)胞呈中度或者重度減少，血小板明顯減少，白細(xì)胞異常增高)、骨髓象(骨髓增生極度活躍或者明顯活躍，紅系細(xì)胞受抑制，巨核細(xì)胞及血小板明顯減少)等檢查確診；②患者均有不同程度的齒齦增生、腫脹、出血、腎衰竭、鼻黏膜浸潤(rùn)、腸壁浸潤(rùn)等表現(xiàn)；③依從性較好，可配合完成本次研究；④無(wú)精神疾病，且認(rèn)知功能均正常者。

1.2.2排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并心、肝、腎等重要臟器病變的患者；②合并惡性腫瘤的患者；③伴全身感染性疾病的患者；④合并凝血功能障礙或其他免疫系統(tǒng)疾病的患者；⑤具有穿刺部位放療史的患者。

1.3方 法

1.3.1化療方法：參照《血液病診療指南》[6]中標(biāo)準(zhǔn)對(duì)所有患者進(jìn)行常規(guī)干預(yù)法及化療方案，常規(guī)干預(yù)法具體內(nèi)容如下：根據(jù)患者情況加強(qiáng)護(hù)理，存在出血傾向的患者需臥床休息，維持水電解質(zhì)平衡；根據(jù)患者貧血程度及血小板減少情況，及時(shí)輸注血小板及紅細(xì)胞，并給予常規(guī)營(yíng)養(yǎng)支持及抗感染治療等。化療方案：給予患者持續(xù)2個(gè)周期的誘導(dǎo)化療：經(jīng)標(biāo)劑量化療方案，主要為皮下注射阿糖胞苷(Hospira Australia Pty Ltd，批準(zhǔn)文號(hào)：H20160229，規(guī)格：1mg/0.1g)，12.5mg/次，1次/12h；靜脈滴注高三尖杉酯堿(四川寶鑒堂藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20141203、20161210、20181103)，3mg/d，連續(xù)給藥7d為1周期。

1.3.2預(yù)后判斷及分組法：化療結(jié)束，參照《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)(第3版)》[7]評(píng)價(jià)患者預(yù)后，其中完全緩解：原粒細(xì)胞Ⅰ型及Ⅱ型+原始及幼稚單核細(xì)胞≤5%；部分緩解：5%<原粒細(xì)胞Ⅰ型及Ⅱ型+原始及幼稚單核細(xì)胞≤20%；未緩解：原粒細(xì)胞Ⅰ型及Ⅱ型+原始及幼稚單核細(xì)胞>20%。將完全緩解、部分緩解患者納為預(yù)后良好組；將未緩解患者納為預(yù)后不良組。

1.3.3熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)法：取所有患者化療前、化療1個(gè)周期、化療結(jié)束時(shí)骨髓組織標(biāo)本，采用熒光定量PCR法測(cè)定NOV基因的信使RNA(mRNA)表達(dá)，步驟如下：將標(biāo)本組織加入Trizol試劑(Sigma，美國(guó))裂解細(xì)胞，加入0.2mL氯仿后，離心取無(wú)色水相上層，加入等體積的異丙醇，獲取樣本組織中總RNA，清洗干燥；利用紫外光吸收法測(cè)定總RNA濃度，并取2μL總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR反應(yīng)條件：第一步，循環(huán)94℃預(yù)變性5min，第二步，94℃變性30s、68℃逐漸下降至55℃退火30s(每個(gè)循環(huán)依次降低1℃)、72℃延伸30s，共12個(gè)循環(huán)；第三步，94℃變性30s、55℃退火30s、72℃延伸30s，共30個(gè)循環(huán)；最后，72℃延伸10min。結(jié)束后行瓊脂糖凝膠電泳，應(yīng)用JS2380自動(dòng)圖像凝膠分析儀(上海培清公司)，分析每條帶的光密度值，目的基因于內(nèi)參照(GAPDH基因)比值為NOV基因mRNA的表達(dá)量。

1.3.4隨訪：全部患者均獲得隨訪，隨訪方式為門診、電話，隨訪時(shí)間為17個(gè)月，鞏固期間每個(gè)月復(fù)查1次骨髓，隨訪期間定期復(fù)查患者血常規(guī)及血涂片等。

2 結(jié) 果

2.141例AMML患者化療前、化療1個(gè)周期、化療結(jié)束時(shí)NOV基因表達(dá)情況：41例AMML患者化療前、化療1個(gè)周期、化療結(jié)束后的NOV基因mRNA表達(dá)量平均分別為(95.31±15.13)、(84.65±12.03)、(64.43±10.14)；化療1個(gè)周期、化療結(jié)束后，患者NOV基因mRNA的表達(dá)量較化療前明顯降低，且化療結(jié)束時(shí)表達(dá)量最低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=113.862，P<0.001)。(柱形圖見圖1)

圖1 41例AMML患者化療前、化療1個(gè)周期、化療結(jié)束時(shí)NOV基因表達(dá)的柱形圖

2.2預(yù)后及分組情況：41例AMML患者中，30例患者預(yù)后良好，占比73.17%(30/41)；11例患者預(yù)后不良，占比26.83%(11/41)。預(yù)后不良組患者性別、年齡、BMI、合并基礎(chǔ)疾病、白細(xì)胞及中性粒細(xì)胞比例基線資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 不同預(yù)后組患者基線資料比較

2.3不同預(yù)后組AMML患者骨髓NOV基因表達(dá)情況：化療1個(gè)周期、化療結(jié)束后兩組患者骨髓NOV基因表達(dá)均較化療前降低，且預(yù)后不良組患者各時(shí)點(diǎn)骨髓NOV基因表達(dá)均高于預(yù)后良好組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 不同預(yù)后組AMML患者骨髓NOV基因表達(dá)情況

2.4不同時(shí)間點(diǎn)NOV基因表達(dá)對(duì)AMML患者預(yù)后影響的Logistics回歸分析結(jié)果：將AMML患者預(yù)后作為因變量(1=預(yù)后不良，0=預(yù)后良好)，將不同時(shí)間點(diǎn)骨髓NOV基因表達(dá)作為協(xié)變量(均為連續(xù)變量)，進(jìn)行Logistics回歸分析，在校正性別、年齡等資料之間的影響后，結(jié)果顯示，化療前、化療1個(gè)周期、化療結(jié)束時(shí)NOV基因表達(dá)均是AMML患者預(yù)后不良的影響因素(OR>1，P<0.05)。其中化療前NOV表達(dá)對(duì)AMML患者預(yù)后不良的影響最為明顯。相關(guān)參數(shù)見表3。

表3 不同時(shí)間點(diǎn)NOV基因表達(dá)對(duì)AMML患者預(yù)后影響的Logistics回歸分析結(jié)果

2.5化療前NOV基因表達(dá)預(yù)測(cè)AMML患者預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)的價(jià)值分析：將化療前NOV基因表達(dá)作為檢驗(yàn)變量，將AMML患者預(yù)后情況作為狀態(tài)變量；繪制ROC曲線結(jié)果顯示(見圖2)，化療前NOV基因mRNA的表達(dá)量預(yù)測(cè)AMML患者預(yù)后的AUC為0.879(95%CI：0.770～0.987，P<0.001)，有一定預(yù)測(cè)價(jià)值，且當(dāng)最佳閾值取93.900時(shí)，可獲得較理想的診斷靈敏度與特異度，分別為：90.90%、70.10%，約登指數(shù)為0.610。

圖2 NOV基因表達(dá)預(yù)測(cè)AMML患者預(yù)后的價(jià)值ROC曲線圖

3 討 論

AMML病因尚未明確，目前治療該病的主要手段是化療，低?；颊呓?jīng)聯(lián)合化療后可治愈，但仍有部分患者經(jīng)綜合治療后效果不明顯，預(yù)后不佳，危及生命安全。研究[8]顯示，年齡、合并癥、基礎(chǔ)疾病、細(xì)胞遺傳學(xué)及分子生物學(xué)均可能是影響急性白血病預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。但經(jīng)實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，上述因素用于評(píng)估、預(yù)測(cè)AMML患者的預(yù)后還不準(zhǔn)確，仍需探尋其他有效指標(biāo)準(zhǔn)確評(píng)估AMML患者的預(yù)后情況，以指導(dǎo)疾病的早期預(yù)防、診斷及治療。近年相關(guān)的研究[9]發(fā)現(xiàn)不少與白血病發(fā)病及預(yù)后相關(guān)的分子標(biāo)志物，在一定程度上提高急性髓細(xì)胞白血病的診療水平。但尚未發(fā)現(xiàn)與AMML發(fā)生及預(yù)后相關(guān)的特異性分子標(biāo)志物。

NOV基因?qū)儆贑CN家族成員，通過調(diào)節(jié)胰島素樣生長(zhǎng)因子與其受體結(jié)合發(fā)揮作用，其編碼的蛋白質(zhì)可以通過多種信號(hào)通路，參與多種細(xì)胞功能，如在細(xì)胞生長(zhǎng)、分化及黏附等中發(fā)揮一定作用[10]。NOV是一類編碼細(xì)胞外分泌蛋白的基因，其編碼的CCN蛋白可通過其他信號(hào)分子互相作用，參與機(jī)體重要生命活動(dòng)，如促進(jìn)胎兒心血管系統(tǒng)發(fā)育，在成人體內(nèi)還可影響血管形成及炎癥反應(yīng)等[11]。目前關(guān)于NOV基因表達(dá)與急性白血病的關(guān)系研究甚少。2011年，一項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究[12]顯示，NOV基因粒單核細(xì)胞白血病鼠中的表達(dá)明顯升高，其表達(dá)異?？赡軈⑴c小鼠粒單核細(xì)胞白血病的發(fā)生、發(fā)展過程，且與療效具有一定聯(lián)系。由此可推測(cè)，NOV基因表達(dá)在AMML患者中也可能存在異常表達(dá)，且與疾病的預(yù)后具有一定聯(lián)系，但目前關(guān)于此類研究較少。

本研究以AMML患者為研究對(duì)象，分別在化療前、化療1個(gè)周期、化療結(jié)束后對(duì)NOV基因表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，可較為全面反映NOV基因表達(dá)與AMML患者預(yù)后的關(guān)系。本研究結(jié)果顯示，化療1個(gè)周期、化療結(jié)束后，患者NOV基因mRNA的表達(dá)量較化療前明顯降低，且化療結(jié)束時(shí)表達(dá)量最低，提示化療對(duì)AMML患者NOV基因的表達(dá)具有一定影響；本研究還發(fā)現(xiàn)，預(yù)后良好組患者化療前、化療1個(gè)周期、化療結(jié)束后NOV基因mRNA的表達(dá)量均低于預(yù)后不良組，結(jié)果提示，AMML患者NOV基因mRNA的表達(dá)量越高，預(yù)后不良發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)越高，初步證實(shí)NOV基因mRNA的表達(dá)量與AMML患者的預(yù)后可能存在一定聯(lián)系；進(jìn)一步做Logistics回歸分析結(jié)果顯示，化療前、化療1個(gè)周期、化療結(jié)束時(shí)NOV基因mRNA的表達(dá)量均是AMML患者預(yù)后不良的影響因素，其中化療前NOV基因mRNA表達(dá)量對(duì)AMML患者預(yù)后不良的影響最為明顯，提示NOV基因mRNA表達(dá)量與AMML患者預(yù)后不良有一定關(guān)系。分析其可能原因?yàn)?，白血病的發(fā)病涉與原癌基因突變、抑癌基因功能缺失、促凋亡基因失活等分子機(jī)制有關(guān)[13]。而NOV基因在腫瘤的發(fā)生及發(fā)展中起到重要作用，且在不同腫瘤中表達(dá)存在一定差異，如NOV基因在前列腺癌、腎細(xì)胞癌、Ewing肉瘤等中表達(dá)增加，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移。但NOV在乳腺癌、黑色素瘤、尤文肉瘤、胰腺癌等中是抑癌基因，表達(dá)降低，可抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤分化，起到負(fù)調(diào)節(jié)作用。故而推測(cè)NOV基因mRNA的表達(dá)量與AMML患者的預(yù)后可能存在一定聯(lián)系。繪制ROC曲線結(jié)果顯示，化療前NOV基因mRNA的表達(dá)量預(yù)測(cè)AMML患者預(yù)后的AUC為0.879，有一定預(yù)測(cè)價(jià)值，提示化療前NOV基因高表達(dá)可能預(yù)示AMML患者預(yù)后不良發(fā)生高風(fēng)險(xiǎn)，考慮在未來(lái)可將AMML患者化療前NOV基因的表達(dá)作為預(yù)測(cè)患者預(yù)后的分子標(biāo)志物。但導(dǎo)致這一結(jié)果發(fā)生的具體機(jī)制尚未明確，且尚無(wú)較多循證學(xué)依據(jù)可作為理論支持，加之本研究納入樣本量較少，結(jié)果可能存在一定偏差，研究仍有局限，仍需未來(lái)展開大樣本、多中心的研究加以驗(yàn)證。

綜上所述，NOV基因高表達(dá)可能預(yù)示AMML患者預(yù)后不良高風(fēng)險(xiǎn)，化療期間檢測(cè)NOV基因表達(dá)狀況，可指導(dǎo)臨床早期預(yù)測(cè)、治療AMML患者。