樊 濤， 李江鵬

(陜西省西安市人民醫(yī)院/陜西省西安市第四醫(yī)院， 陜西 西安 710004)

卵巢癌是一種常見的婦科腫瘤疾病，具有高發(fā)病、高死亡、低治愈、易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)[1,2]。由于其臨床表現(xiàn)不明顯，分子生物學(xué)特性復(fù)雜，大部分患者被確診病情發(fā)展至晚期，因此尋找卵巢癌有效的分子標(biāo)志物，從分子機(jī)制探討卵巢癌的發(fā)生與發(fā)展對(duì)卵巢癌的早期診斷、基因靶向治療、預(yù)后評(píng)估具有重要意義[3]。MicroRNA (miRNA) 是一類長(zhǎng)度約為20-24個(gè)核苷酸組成的內(nèi)源性非編碼小RNA，可通過(guò)沉默機(jī)體相關(guān)DNA的轉(zhuǎn)錄和mRNA的翻譯，廣泛參與機(jī)體多種功能性調(diào)節(jié)[4]。miR-216b是miR-216家族成員之一，具有一定的生物調(diào)節(jié)功能。研究報(bào)道，miR-216可直接參與抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移，諸如miR-216b可直接作用于FoxM1抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞、調(diào)控PBK(PDZ結(jié)合蛋白)成為腫瘤抑制因子、抑制SDCBP致癌因子的表達(dá)等[5]。目前針對(duì)miR-216b在卵巢癌發(fā)生和發(fā)展中作用研究較少，本實(shí)驗(yàn)研究miR-216b對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響，并探討其具體分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1臨床樣本:選取我院2018年至2019年經(jīng)病理科確診并進(jìn)行卵巢癌手術(shù)患者30例(25～35歲)，30例患者術(shù)中取樣前均未經(jīng)過(guò)化療、放療、無(wú)其他基礎(chǔ)性疾病?；颊呒膊》制诓捎脟?guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(International Federation of Obstetrics and Gynecology,FIGO) 《FIGO2013卵巢癌、輸卵管癌、腹膜癌分期》標(biāo)準(zhǔn)10例Ⅰ期、10例Ⅱ期、10例Ⅲ，無(wú)轉(zhuǎn)移13例，有轉(zhuǎn)移17例。樣品經(jīng)手術(shù)取樣后，置于-80℃液氮保存實(shí)驗(yàn)。該實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)本院倫理委員會(huì)審核通過(guò)，所有患者及家屬均知曉實(shí)驗(yàn)方案和影響并簽署實(shí)驗(yàn)知情同意書。

1.2主要材料與儀器:HO-8910細(xì)胞系購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù)。DMEM培養(yǎng)基、青鏈霉素、胰酶、胎牛血清購(gòu)自大連美倫公司。DCLK1、GAPDH一抗購(gòu)自Abcam公司。qPCR試劑盒、蛋白提取試劑盒、BCA試劑盒購(gòu)自上海碧云天公司。ECL發(fā)光液、辣根過(guò)氧物二抗購(gòu)自Solarbio公司。轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體、核酸提取試劑盒、miR-216b mimcs、miR-216b inhibitor購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。Transwell小室購(gòu)自南京建成研究所。多功能呈象儀器、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。二氧化碳培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、無(wú)菌操作臺(tái)購(gòu)自基恩士公司。

1.3方 法

1.3.1臨床樣本分析:取30例患者癌組織和癌旁組織，按照核酸提取試劑盒說(shuō)明書操作，提取兩種組織RNA定量，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，按照qPCR試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，引物序列：miR-216b R: 5′-GCGAAATCTCTGCAGGCAA-3′、F: 5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′，DCLK1 R: 5'-AGGCAGGTTACCATCACTGG-3'、F: 5'-CATTGTTCTAGCTGCTCCCC-3'，GAPDH R: 5'-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3'、F: 5'-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3'，PCR擴(kuò)增條件：95℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 35 s,共40個(gè)循環(huán)。結(jié)果采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3.2細(xì)胞培養(yǎng):將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，使用10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培育，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至90%，采用0.25%胰酶消化傳代。

1.3.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HO-8910細(xì)胞，按照1×106個(gè)/孔數(shù)量將細(xì)胞接種至6孔板中，37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)24h。按照轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書操作，實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組(正常HO-8910細(xì)胞、添加陽(yáng)離子脂質(zhì)體)、陰性對(duì)照組(正常HO-8910細(xì)胞、添加陽(yáng)離子脂質(zhì)體、miRNA空白序列)、過(guò)表達(dá)組(正常HO-8910細(xì)胞、添加陽(yáng)離子脂質(zhì)體、miRNA mimics)、低表達(dá)組(正常HO-8910細(xì)胞、添加陽(yáng)離子脂質(zhì)體、miRNA inhibitor)。將三種miRNA(100 nmoL/L)分別加入各組細(xì)胞，4h后替換含20%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)36h。 按照qPCR步驟檢測(cè)各組細(xì)胞miR-216b表達(dá)情況。

1.3.4CCK8檢測(cè)細(xì)胞活性:消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期四組實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，鋪板96孔板培養(yǎng)24h.按照CCK8試劑盒說(shuō)明書操作，檢測(cè)四組細(xì)胞1、2、3、4d的細(xì)胞活性。

1.3.5劃痕實(shí)驗(yàn):取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期四組細(xì)胞，消化鋪板至6孔板，37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)至融合80%，采用200μL加樣槍垂直畫線(5mm)，PBS清洗懸浮細(xì)胞，更換新鮮DMEM培養(yǎng)基后，立即拍照記錄，培養(yǎng)24h后，再次拍照記錄，觀察計(jì)算各組細(xì)胞遷移距離。

1.3.6Transwell實(shí)驗(yàn):消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板，計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞懸液濃度(1×105個(gè)/mL)。采用Transwell小室(上室：200μL細(xì)胞懸液、下室：500μL DMEM培養(yǎng)基)培養(yǎng)24h。去除培養(yǎng)液后，除去上室膜上細(xì)胞，下室細(xì)胞使用甲醇固定300，0.1%結(jié)晶紫溶液固定染色，PBS清洗殘余染料后，倒置顯微鏡(100×)記錄拍照計(jì)數(shù)。

1.3.7Weestern blot和qPCR:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期各組細(xì)胞，去除培養(yǎng)基，PBS溶液清洗，采用用RIPA細(xì)胞裂解液冰上裂解15min，4℃、6000r/min、10min，取上清溶液進(jìn)行BCA定量，制備蛋白電泳樣品后，進(jìn)行電泳，多功能成像儀曝光，檢測(cè)四組細(xì)胞DCLK1蛋白的表達(dá)情況。按照核酸試劑盒說(shuō)明書步驟，提取各組細(xì)胞核酸，進(jìn)行qPCR操作，檢測(cè)各組細(xì)胞DCLK1 mRNA的表達(dá)情況。

表1 基因引文序列

2 結(jié) 果

2.1臨床樣本分析:取30例卵巢癌患者癌組織和癌旁組織分析，采用qPCR檢測(cè)兩種組織miR-216b的表達(dá)水平。如圖1所示，正常組織miR-216b的表達(dá)水平明顯高于癌組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖1 qPCR檢測(cè)卵巢癌組織和癌旁組織miR-216b的表達(dá)水平

2.2轉(zhuǎn)染效果檢測(cè):轉(zhuǎn)染完畢后，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期各組細(xì)胞，采用qPCR檢測(cè)各組細(xì)胞miR-216b的表達(dá)。如圖2所示，相對(duì)于對(duì)照組，過(guò)表達(dá)組miR-216b的表達(dá)水平明顯上調(diào)，而低表達(dá)組miR-216b表達(dá)水平明顯下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.3CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖活性:轉(zhuǎn)染完畢后，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期各組細(xì)胞，進(jìn)行CCK8實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)各組細(xì)胞1、2、3、4d細(xì)胞活性。如圖3所示，相對(duì)于對(duì)照組，過(guò)表達(dá)組的細(xì)胞增殖能力明顯下降，而低表達(dá)組的細(xì)胞增殖能力明顯上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖2 qPCR檢測(cè)各組細(xì)胞miR-216b的表達(dá)情況

圖3 CCK8檢測(cè)各組細(xì)胞增殖活性

2.4劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力:轉(zhuǎn)染完畢后，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期各組細(xì)胞，進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)，劃痕24h后，記錄各組細(xì)胞遷移距離。如圖4所示，相對(duì)于對(duì)照組，過(guò)表達(dá)組細(xì)胞遷移距離較小，遷移能力明顯下降，而低表達(dá)組細(xì)胞遷移距離較大，遷移能力明顯上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖4 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞侵襲情況

2.5Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力:轉(zhuǎn)染完畢后，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期各組細(xì)胞，進(jìn)行Transwell實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)24h后，去除上室細(xì)胞，固定下室細(xì)胞拍照計(jì)數(shù)。如圖5所示，相對(duì)于對(duì)照組，過(guò)表達(dá)組細(xì)胞數(shù)目較少，侵襲能力明顯下降，而低表達(dá)組細(xì)胞數(shù)目較多，遷移能力明顯上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖5 Transwell檢測(cè)各組細(xì)胞侵襲情況

2.6檢測(cè)各組細(xì)胞DCLK1蛋白和mRNA的表達(dá):取各組細(xì)胞，按試劑盒說(shuō)明書提取總蛋白和mRNA，進(jìn)行Western blot和qPCR實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)細(xì)胞DCLK1蛋白和mRNA的表達(dá)。如圖6所示，相對(duì)于對(duì)照組，過(guò)表達(dá)組的細(xì)胞DCLK1蛋白和mRNA的表達(dá)明顯上調(diào)，而低表達(dá)組的細(xì)胞DCLK1蛋白和mRNA的表達(dá)明顯下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖6 各組細(xì)胞DCLK1蛋白和mRNA的表達(dá)情況

3 討 論

卵巢癌是女性生殖器官一種常見的惡性腫瘤，由于卵巢身居盆腔，體積小，缺乏典型癥狀，因此卵巢癌發(fā)病率已經(jīng)占據(jù)了婦科腫瘤的首位，對(duì)女性的生命構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅[6]。卵巢癌細(xì)胞對(duì)盆腔組織的轉(zhuǎn)移和侵襲，是造成卵巢癌患者治療困難和疾病復(fù)發(fā)的主要原因[7]。雙皮質(zhì)素樣激酶1( Doublecortinlike kinase 1,DCLK1)是一種由DCX1和DCX兩組成，具有微管聚合功能的絲/蘇氨酸激酶[8]。目前DCLK1已經(jīng)被證實(shí)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的增殖、遷移具有促進(jìn)作用，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，DCLK1可直接參與腫瘤細(xì)胞EMT，刺激機(jī)體腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲。通過(guò)敲低DCLK1，可顯著降低神經(jīng)瘤、胃癌、宮頸癌、胰腺癌等腫瘤細(xì)胞的侵襲性和轉(zhuǎn)移能力，增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性[9]。

MicroRNA-216b屬于miR-216基因簇，位于人類2號(hào)染色體不穩(wěn)定區(qū)，由22個(gè)核苷酸組成，廣泛存在于人體的肝臟、胰腺、生殖器官。研究表明miR-216b在肝癌、胰腺癌、宮頸癌等多種癌癥的病變過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，miR-216b通過(guò)調(diào)控FGFR1增加胰腺癌細(xì)胞放療的敏感性，已經(jīng)通過(guò)HBx-miR-216b-IGF2BP2信號(hào)抑制肝癌HepG2細(xì)胞的增殖[10,11]。本研究以miR-216b為研究對(duì)象，探討了miR-216b靶向DCLK1對(duì)卵巢癌HO-8910細(xì)胞的活性的影響。通過(guò)檢測(cè)30例卵巢癌患者癌組織和癌旁組織中miR-216b的表達(dá)情況，我們發(fā)現(xiàn)卵巢癌組織中miR-216b的表達(dá)低于高于癌旁組織，說(shuō)明miR-216b促進(jìn)了卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展。我們選取了卵巢癌HO-8910細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，構(gòu)建了穩(wěn)定的miR-216b過(guò)表達(dá)和低表達(dá)細(xì)胞株。通過(guò)CCK8、劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同組細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力。結(jié)果表明，相對(duì)于對(duì)照組細(xì)胞，miR-216b過(guò)表達(dá)組細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力顯著降低，miR-216b低表達(dá)組細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力顯著上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明miR-216b在卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展中屬于抑癌基因，發(fā)揮著抑制卵巢癌HO-8910細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用。通過(guò)檢測(cè)各組細(xì)胞DCLK1蛋白和mRNA的表達(dá)情況，我們發(fā)現(xiàn)相對(duì)于對(duì)照組細(xì)胞，miR-216b過(guò)表達(dá)組細(xì)胞DCLK1蛋白和mRNA的表達(dá)顯著降低，miR-216b低表達(dá)組細(xì)胞DCLK1蛋白和mRNA的表達(dá)顯著上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明DCLK1參與了促進(jìn)了卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展。

綜上所述，miR-216b在卵巢癌患者中呈現(xiàn)低表達(dá)，通過(guò)過(guò)表達(dá)miR-216b可顯著抑制卵巢癌HO-8910細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。miR-216b是卵巢癌中的抑癌基因，其具體的抑癌作用可能與靶向DCLK1降低DCLK1的表達(dá)有關(guān)，但其詳細(xì)的調(diào)控機(jī)制和分子生物學(xué)功能需要進(jìn)一步的研究。