彭 非， 盧經(jīng)偉， 李 勇， 張艷霞

(湖北省荊州市胸科醫(yī)院呼吸病臨床中心， 湖北 荊州 434020)

肺癌是起源于肺部支氣管粘膜或腺體的惡性腫瘤，其死亡率約占全球癌癥相關(guān)死亡的27%[1]。近年臨床研究顯示，肺癌患者10年的預(yù)后生存率低于7%[2]。ADAM17是解聚素-金屬蛋白水解酶家族成員之一，可通過水解MICA的α3區(qū)，致使腫瘤細胞表面的MICA脫落，促進腫瘤逃逸NK細胞的免疫殺傷[3]。MICA是NK細胞表面活化性受體NKG2D的配體，通過與NKG2D結(jié)合，給予NK細胞活化性信號，直接殺傷腫瘤細胞。而脫落型的MICA(sMICA)通過作用于NK細胞，引起NK表面NKG2D受體結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，影響NK細胞的殺傷活性，促進腫瘤的免疫逃逸。Xing等[4]研究發(fā)現(xiàn)，sMICA是肺癌患者血清標(biāo)志物。Arai等[5]研究發(fā)現(xiàn)，抑制ADAM17表達可抑制肝癌細胞MICA脫落，提示ADAM17可能可促進腫瘤細胞MICA水解，增加sMICA分泌。由于MICA與sMICA具有影響NK細胞對腫瘤細胞殺傷活性的作用，因此，本研究擬通過探究ADAM17在肺癌組織與癌旁正常組織的表達，闡明ADAM17對肺癌細胞sMICA和膜型MICA表達，及NK細胞對肺癌細胞殺傷敏感性的影響，以期為肺癌的抗腫瘤免疫機制研究提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1臨床組織標(biāo)本及患者基本資料：20例腫瘤組織樣本均來自我院2017年5月至2019年2月收治的肺癌病例。所有患者術(shù)后病理診斷皆為肺癌，術(shù)前未行化療或放療，所有患者已簽署知情同意書。4例健康人外周血來自我院身體健康的志愿者。組織樣本均保存于-80℃。

1.2細胞培養(yǎng)與si-ADAM17轉(zhuǎn)染：肺癌細胞系A(chǔ)549與人正常肺上皮細胞系BEAS-2B購自中國科學(xué)院上海細胞生物學(xué)研究所。將BEAS-2B細胞用BEAS-2B細胞專用培養(yǎng)基(普諾賽生命科技有限公司，武漢)，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細胞貼壁生長約至80%時，胰酶消化，以1∶3比例傳代培養(yǎng)。將A549細胞用含10%胎牛血清(Hyclone，美國)的DMEM培養(yǎng)基(Hyclone，美國)，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細胞貼壁生長約至75%時，胰酶(Hyclone，美國)消化，以1∶2比例傳代培養(yǎng)。收集對數(shù)生長期的A549細胞，胰酶消化細胞，含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸細胞，倒置顯微鏡下計數(shù)，以每孔3.0×106個細胞接種于6孔板內(nèi)，培養(yǎng)24h。根據(jù)LipofectamineTM 3000轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen，美國)說明書，將40ng的si-NC、si-ADAM17(Invitrogen，美國)分別轉(zhuǎn)入A549細胞，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后，更換培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染si-NC的A549細胞設(shè)置為對照組，轉(zhuǎn)染si-ADAM17設(shè)置為si-ADAM17組。

1.3分離及鑒定NK細胞：收集健康志愿者的外周血，根據(jù)淋巴細胞分離液(百奧萊博科技有限公司，北京)實驗步驟分離獲得外周血單個核細胞，使用NK細胞培養(yǎng)基(語純生物科技有限公司，上海)置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。PBS洗滌并重懸NK細胞，調(diào)整細胞濃度至1×107/mL，依次加入PE標(biāo)記的CD3、FITC標(biāo)記的CD56(CST，美國)，室溫避光條件下孵育15min，PBS重懸細胞，利用流式細胞儀檢測NK細胞表型。

1.4免疫組織化學(xué)法實驗(IHC)及ELISA檢測實驗：肺癌組織樣本與癌旁正常組織進行常規(guī)石蠟切片，切片脫蠟后蒸餾水浸洗1min后，進行切片抗原修復(fù)，滴加3%的過氧化氫，室溫孵育10min，PBS沖洗5次，每次2min。滴加已稀釋的山羊血清，孵育40min，去除玻片周圍液體，滴加ADAM17抗體(CST，美國)，置于4℃冰箱內(nèi)孵育過夜。PBS沖洗切片5次，每次2min，去除玻片周圍液體，滴加二抗(CST，美國)37℃孵育25min。PBS沖洗切片，滴加DAB顯色液(Thermo Fisher Scientific，美國)，自來水沖洗終止染色，Harris蘇木素復(fù)染1min，水洗后用1%的鹽酸酒精分化，再用自來水水洗返藍。將切片依次置于將切片進行梯度酒精脫水后，再依次滴加二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ，封片劑封片后，晾干鏡檢拍照。ELISA檢測實驗：收集各組細胞上清，離心去除細胞碎片，獲取細胞上清，根據(jù)人MICA的ELISA檢測試劑盒(Thermo Fisher Scientific，美國)說明書進行細胞上清中sMICA的含量測定。

1.5實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)：Trizol試劑(Thermo Fisher Scientific，美國)提取各組細胞的總RNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo Fisher Scientific，美國)一步法進行反轉(zhuǎn)錄，根據(jù)熒光定量試劑盒(Thermo Fisher Scientific，美國)所述實驗方法進行qRT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為：95 ℃變性15 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 s，進行40個循環(huán)。以GAPDH作為ADAM17與MICA的內(nèi)參對照。擴增結(jié)果采用2-△△Ct法計算ADAM17與MICA mRNA的相對表達量。qRT-PCR引物序列：ADAM17-F：5′-ATGAGGCAGTCTCTCCTAT T-3′，ADAM17-R： 5′-TCTGTTTCTTTGCTGTCAACA-3′；MICA-F：5′-GACTTGACA GGGAACGGAAA-3′，MICA-R：5′-CAGGTTTTGGGAGAGGAAGA-3′；GADPH-F：5′-CATGTTCGTCATGGGGTGAACCA-3′，GADPH-R：5′- AGTGATGGCATGGACTGT GGTCAT-3′。

1.6蛋白免疫印跡實驗(Western Blot)：RIPA細胞裂解液裂解各組的A549細胞，提取細胞總蛋白。采用BSA法試劑盒(Invitrogen，美國)檢測蛋白濃度。取100μg蛋白變性，通過SDS-PAGE電泳分離等量蛋白，將目標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜。5%脫脂牛奶4℃封閉1h，TBST洗膜5min，3次，加入ADAM17與MICA抗體(1∶1500)(CST，美國)，4℃搖床孵育過夜。TBST洗膜5min，3次，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔的二抗(1∶1000)(CST，美國)37℃孵育1h，TBST洗膜5min，5次。顯影曝光，才用Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)分析蛋白條帶的灰度值。

1.7流式細胞術(shù)：收集各組A549細胞，PBS重懸洗滌細胞，倒置顯微鏡下計數(shù)，以5.5×104/mL的細胞濃度接種于96孔板內(nèi)。以1μg/106個細胞濃度加入用MICA抗體(CST，美國)，4℃下孵育各組細胞25min，PBS洗滌細胞，加入FITC標(biāo)記的山羊抗鼠二抗(CST，美國)4℃孵育30min，PBS洗滌3次，利用流式細胞儀分析陽性細胞。

1.8乳酸脫氫酶釋放法實驗：胰酶消化各組的A549細胞，利用含無胎牛血清的DMEM培基重懸細胞，調(diào)整細胞密度至4×105/mL，設(shè)置為靶細胞。收集NK細胞，PBS洗滌重懸細胞，NKG2D抗體(CST，美國)孵育NK細胞20min。PBS洗滌NK細胞及NKG2D單抗孵育的NK細胞，利用含無胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸細胞，調(diào)整細胞密度至4×106/mL，設(shè)置為效應(yīng)細胞。按照效靶比為20∶1將各細胞加入96孔板內(nèi)，設(shè)置為實驗組。同時設(shè)置效應(yīng)細胞自然釋放組、靶細胞自然釋放組及靶細胞最大釋放組。每組各設(shè)置6個復(fù)孔。96孔板置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)6h，離心5min，每孔吸取100μL細胞上清置96孔板內(nèi)，加入100μL的LDH溶液(Abcam，英國)反應(yīng)5min，加入1moL/L的HCL 30μL，通過酶標(biāo)儀在490nm處檢測光密度值(OD值)。NK細胞的殺活性性=(實驗孔OD值-效應(yīng)細胞自然釋放組OD值)/(靶細胞最大釋放組OD值-靶細胞自然釋放組OD值)。

2 結(jié) 果

2.1肺癌組織及癌旁正常組織中ADAM17的表達：ADAM17在肺癌組織中表達升高：與相鄰的非癌組織相比，肺癌組織細胞質(zhì)中ADAM17的表達明顯升高(見圖1)。

2.2ADAM17在肺癌細胞中的表達：與人正常肺上皮細胞BEAS-2B相比，肺癌細胞A549中ADAM17蛋白相對表達量及ADAM17 mRNA相對表達量均顯著升高(P<0.05)，見表1。

表1 肺癌細胞及正常人肺上皮細胞中ADAM17的表達

2.3si-ADAM17對A549細胞上清中sMICA表達的影響：si-ADAM17轉(zhuǎn)染A549細胞后，與對照組相比，si-ADAM17組A549細胞上清中sMICA含量降低(P<0.05)，見表2。

表2 si-ADAM17對A549細胞上清中sMICA含量的影響

2.4si-ADAM17對A549細胞ADAM17與MICA表達的影響：si-ADAM17轉(zhuǎn)染A549細胞后，Western Blot實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，si-ADAM17組A549細胞中ADAM17蛋白表達降低(表3，圖2)(P<0.05)，MICA蛋白表達升高(表3，圖2)(P<0.05)。流式細胞術(shù)實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，si-ADAM17組A549細胞MICA表達升高(圖3)。

表3 si-ADAM17對A549細胞ADAM17與MICA表達的影響

圖1 肺癌組織及癌旁正常組織中ADAM17的表達

圖2 si-ADAM17對A549細胞ADAM17與MICA蛋白表達的影響

2.5NK細胞的純度：分離健康供體外周血，體外培養(yǎng)獲得NK細胞，CD3-CD56+的NK細胞純度達到90%以上(見圖4)。

2.6沉默ADAM17對NK細胞殺傷A549細胞的敏感性影響：si-ADAM17轉(zhuǎn)染A549細胞，與對照組相比，si-ADAM17組的NK細胞殺傷A549細胞的敏感性升高(P<0.05)，見表4。

圖3 si-ADAM17對A549細胞MICA表達的影響

圖4 CD3-CD56+NK細胞的純度

2.7NKG2D抗體對NK細胞殺傷轉(zhuǎn)染si-ADAM17的肺癌細胞的敏感性影響：NKG2D抗體封閉NK細胞表面的NKG2D受體，與si-ADAM17組相比，si-ADAM17+NKG2D-mcAb組的NK細胞的殺傷A549細胞的敏感性降低(P<0.05)，見表5。

表4 si-ADAM17對NK細胞殺傷肺癌細胞的敏感性影響

表5 NKG2D抗體對NK細胞殺傷轉(zhuǎn)染si-ADAM17的肺癌細胞的敏感性影響

3 討 論

肺癌是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因，其高復(fù)發(fā)率和死亡率一直是臨床研究面臨的主要問題[6]。近年研究發(fā)現(xiàn)，肺癌患者機體的免疫逃逸的是其預(yù)后較差的主要原因[7]。因此，探究肺癌免疫逃逸機制是臨床研究的熱點和關(guān)鍵。NK細胞是機體抗腫瘤免疫逃逸的重要淋巴細胞，通過其表面的活化或抑制受體，對“自身”及“非己”進行識別，直接殺傷腫瘤細胞，抑制腫瘤細胞逃逸。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，肺癌患者外周血NK細胞活性降低，且功能受到抑制[8]，提示肺癌的發(fā)生與發(fā)展可能與NK細胞功能降低有關(guān)。NK細胞抗腫瘤免疫活性主要依賴于其表面活化性受體自然殺傷細胞兩組成員D(natural killer group 2,member D，NKG2D)與腫瘤細胞表面MICA結(jié)合，給予NK細胞活化性信號，而靶向殺傷腫瘤細胞。但研究顯示，腫瘤細胞表面MICA可被ADAM17水解形成游離的MICA(sMCA)[3]。而且sMICA通過改變NK細胞表面的活化性受體NKG2D的構(gòu)象，影響膜型MICA與NKG2D的結(jié)合，抑制殺傷活化性信號的產(chǎn)生，可降低NK細胞對腫瘤細胞的殺傷敏感性[9]。因此，阻止ADAM17發(fā)揮其水解活性，抑制MCIA脫落，可能是提高NK細胞殺傷腫瘤細胞的方法之一。

ADAM17是一種含有多個結(jié)構(gòu)域的1型跨膜蛋白，其前體結(jié)構(gòu)域通過與鋅催化位點相結(jié)合被蛋白水解，而獲得水解活性，進而參與多種膜分子的蛋白的水解，例如TNF-α、雙調(diào)蛋白與MICA等[10]。Saad等研究發(fā)現(xiàn)，ADAM17在小細胞肺癌組織中高表達[11]。與Saad等人研究結(jié)果相似，本研究發(fā)現(xiàn)ADAM17在肺癌組織中高表達，說明ADAM17與肺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Jun等研究顯示[12]，敲低ADAM17通過降低sMICA表達,促進肝癌細胞表面的MICA表達[12]。與Jun等研究方法略有不同，本研究利用RNAi技術(shù)沉默肺癌細胞ADAM1基因，下調(diào)ADAM17表達，發(fā)現(xiàn)肺癌細胞MICA表達升高，sMICA分泌減少。

Ou等研究發(fā)現(xiàn)，缺氧誘導(dǎo)胰腺癌細胞表面MICA的脫落促進腫瘤細胞逃避NK細胞免疫殺傷[13]，提示sMICA是影響NK細胞殺傷活性的原因。研究顯示，調(diào)控ADAM9的表達，可促進肝癌細胞MICA的表達，提高NK細胞對腫瘤細胞的免疫殺傷[14]，說明調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶的表達，通過影響MICA表達，進而了影響NK細胞的殺傷活性。在本研究中，下調(diào)ADAM17表達后，NK細胞對肺癌細胞的殺傷活性升高。但下調(diào)ADAM17是否是通過促進MICA與NKG2D的結(jié)合，而提高NK細胞對肺癌細胞的殺傷,為此，本研究利用NKG2D單抗封閉NK細胞表面的NKG2D受體，發(fā)現(xiàn)NK細胞對沉默ADAM17的A549細胞的殺傷敏感性降低，這可進一步說明沉默ADAM17是通過抑制A549細胞sMICA的產(chǎn)生，促進MICA與NKG2D的結(jié)合，進而增強了NK細胞對肺癌細胞的殺傷。

綜上所述，ADAM17在肺癌組織中高表達，沉默ADAM17可促進A549細胞MICA的表達，抑制A549細胞sMICA的分泌，增強NK細胞對A549細胞的殺傷敏感性，以期為肺癌的免疫治療提供新的思路。