王沁蕓，潘 曄，陳克平，王慧英，呂 鵬

（1.江蘇大學生命科學研究院，鎮(zhèn)江212013；2.江蘇維爾生物科技有限公司，常州213003）

基因工程抗體，也稱重組抗體，是通過基因工程和重組抗體技術(shù)獲得的高質(zhì)量第三代抗體，是從雜交瘤、免疫脾細胞、外周血淋巴細胞等中提取mRNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，PCR 擴增出抗體基因，按一定方式連接到表達載體中，在適當?shù)募毎斜磉_并折疊成有功能的抗體分子片段。相對于雜交瘤技術(shù)需要幾個月以上時間才能生產(chǎn)抗體，基因工程抗體僅需幾周就能在細菌、酵母或其他細胞中產(chǎn)生［1］，并基本消除抗體的免疫原性，生產(chǎn)工藝簡單，廉價易得，應(yīng)用前景廣闊。

基因工程抗體已用于治療、診斷、檢測等領(lǐng)域的藥物或產(chǎn)品開發(fā)，涉及對小分子的識別。小于1 ku 的小分子，包括寡肽、寡糖、寡核苷酸、維生素、礦物質(zhì)、小分子團水、動植物的代謝產(chǎn)物等，不能單獨誘導(dǎo)免疫反應(yīng)產(chǎn)生抗體。這些小分子通常與載體蛋白綴合以觸發(fā)免疫反應(yīng)，因此易產(chǎn)生載體效應(yīng)，難以獲得高特異性抗體。基因工程抗體與體外展示技術(shù)結(jié)合可完全排除載體蛋白的干擾。在構(gòu)建抗體文庫［2］和大規(guī)模淘選時使用不同的載體蛋白，能快速富集僅識別小分子特異性抗體。通過改變淘選條件，可在增強特異性的同時提高抗體的穩(wěn)定性和親和力［3］。

1 基因工程抗體種類

根據(jù)抗體基因的不同來源，基因工程抗體可分為嵌合抗體、改型抗體、全人源化抗體等。嵌合抗體基因通常由鼠源可變區(qū)基因和人源恒定區(qū)基因拼接而成，保留高特異性和親和力的同時大大降低了異源抗體引起的不良反應(yīng)。改型抗體是將鼠源互補決定區(qū)基因接入人抗體骨架得到的抗體，可基本消除免疫原性。全人源化抗體的基因全部來自人抗體基因。

根據(jù)抗體結(jié)構(gòu)，基因工程抗體包括抗原結(jié)合片段（Fragment antigen?binding，F(xiàn)ab）、單鏈抗體（Single?chain variable fragment，scFv）、單域抗體（Single?do?main antibody，sdAb）等（圖1）［4］。Fab 是抗體上與抗原結(jié)合的區(qū)域，包含輕鏈可變區(qū)（VL）、恒定區(qū)和重鏈可變區(qū)（VH）、CH1 區(qū)。與Ig（約155 ku）相比，F(xiàn)ab 體積小，易于在細菌系統(tǒng)中表達，組織穿透能力強［5］；與其他重組抗體相比，F(xiàn)ab 免疫原性低、親和力高，近幾年廣泛應(yīng)用于預(yù)防、診斷、治療等領(lǐng)域。scFv 是VH 與VL 的融合蛋白，連接肽通常富含甘氨酸以提高柔韌性，可將VH 的N 端（或C 端）與VL 的C 端（或N 端）相連［7］。雖然去除了C 區(qū)并加入連接肽，但scFv 仍然保留了原免疫球蛋白的特異性［8］。sdAb 也稱納米抗體，它的發(fā)現(xiàn)基于駱駝和鯊魚體內(nèi)天然缺失輕鏈的重鏈抗體。sdAb 是已知最小的功能性抗原結(jié)合片段，大小僅14 ku［9］，結(jié)構(gòu)簡單，易于在細菌和酵母［10］中表達，特別適合基因工程方法［11］。sdAb 可溶性好，穩(wěn)定性高，可用于探索抗原受體起源、研發(fā)疫苗、治療藥物、診斷試劑和生物技術(shù)研究工具等。scFv 是最常用的抗體類型，可能是因為考慮到抗體與小分子的結(jié)合效率。雖然sdAb 可單獨識別小分子，但親和力往往不夠理想。scFv 是滿足VH 和VL 同時存在的最小的抗體片段。雖然Fab 也有VH 和VL，但兩個C 區(qū)和中間的鉸鏈區(qū)使其分子體積比scFv 大了一倍多。且C 區(qū)不參與小分子的識別與結(jié)合，其主要功能是維持抗體分子的穩(wěn)定，所以單從親和力角度考慮，F(xiàn)ab 與scFv相比沒有特別的優(yōu)勢，反而雙倍的體積會在構(gòu)建抗體文庫和淘選過程中帶來不便。雖然缺失C 區(qū)而易于多聚化一直是scFv 的不足，但通過開發(fā)雙特異性抗體可以克服這個缺點。

圖1 不同基因工程抗體形式［4］Figure 1 Different genetically engineered antibody formats［4］

2 基因工程抗體的制備

抗體庫技術(shù)是制備基因工程抗體的主要方法，分為構(gòu)建和篩選兩個過程。構(gòu)建抗體庫是在DNA 水平上獲得抗體可變區(qū)基因并克隆到載體中，在展示系統(tǒng)中表達抗體以便通過淘選富集陽性克隆，最后利用抗原篩選出攜帶特異性抗體基因的克隆，進行鑒定與分析。不同的展示系統(tǒng)其原理不盡相同，在構(gòu)建和篩選抗體庫的方法上也有所差別，各具優(yōu)勢。

2.1 抗體庫構(gòu)建

根據(jù)抗體基因的來源可將抗體庫分為天然庫、合成庫和免疫庫。天然庫的V 基因來自未免疫個體的抗體基因。構(gòu)建高度多樣性的天然抗體庫需要花費大量精力，但構(gòu)建成功后可以反復(fù)使用，針對多種抗原進行篩選。然而，由于抗體基因來自人或動物免疫系統(tǒng)，所以無法保證通過篩選獲得的克隆能在細菌中表達。此外，天然庫篩出的抗體常常會引起宿主菌的不良表達或?qū)ζ洚a(chǎn)生毒性，這些問題可以通過合成抗體庫來解決［12］。天然抗體庫一般不適合在沒有載體分子的情況下分離識別小分子的抗體。合成庫不受天然免疫系統(tǒng)的限制，因此更有可能包含目的抗體。全合成庫是通過克隆生殖系DNA 抗體基因序列構(gòu)建的。VH、D、J或Vκ／λ、Jκ／λ 基因片段在體外進行排列組合，重組成完整的VH 和VL 基因。隨后將合成庫克隆到表達載體中，可生成107～1010的文庫。已有研究從合成庫中分離出蛋白和半抗原的特異性抗體，但親和力一般不高。免疫庫是為代替雜交瘤而最先被開發(fā)出的抗體庫，具有庫容小但特異性和親和力高的特點。通常將小分子與載體蛋白偶聯(lián)后對動物進行注射免疫，動物體內(nèi)對此抗原產(chǎn)生高水平的抗體，在總抗體mRNA 中高度表達對應(yīng)的抗體mRNA。因此，即使來自免疫供體的抗體文庫庫容只有105，也能產(chǎn)生特異性抗體，并且由于抗體基因在體內(nèi)已經(jīng)經(jīng)歷了親和力成熟，所以不需要進一步提高親和力。免疫庫已被用于篩選病毒表面抗原、細菌霉素、細胞表面腫瘤抗原的特異性抗體，其KD值低至10-10mol/L。在構(gòu)建免疫抗體庫時，用多種抗原免疫單只動物可同時獲得多種特異性高親和力抗體［13］。

2.2 抗體庫篩選

基因工程抗體的體外分離取決于篩選大型抗體基因組合文庫以分離出與靶分子特異性結(jié)合的克隆的能力。大多數(shù)免疫技術(shù)應(yīng)用都需要篩選105～1011大小的抗體庫，所以必須開發(fā)出高效、高通量的篩選技術(shù)。過去30 年來，各種技術(shù)的復(fù)雜性和靈敏度不斷提高，已從大量抗體庫中分離高親和力抗體。展示技術(shù)是目前篩選抗體庫的主流方法，其中使用最廣泛的是基于絲狀噬菌體表面的抗體展示。將抗體基因與外殼蛋白基因連接并融合表達，使抗體蛋白成為噬菌體外殼蛋白的一部分，陽性克隆與固定抗原結(jié)合，其他噬菌體被洗去，洗脫后再重復(fù)該過程，以達到富集的目的（圖2）。3～6 輪后感染合適的細菌，以便收集噬菌粒，獲得DNA序列并測序，以鑒定具有親和性的抗體。噬菌體展示可直接得到抗體基因并高選擇性地篩選抗體，但易受轉(zhuǎn)化效率限制。

也可在微生物細胞表面展示抗體，如大腸桿菌和釀酒酵母［14］。以大腸桿菌為例，將抗體基因插入大腸桿菌外膜蛋白基因，使抗體蛋白進入重組細胞外表面并展示在外膜蛋白上，但不能展示過大的蛋白?？贵w庫的每個細胞展示不同抗體的多個拷貝，將抗體庫與熒光標記的抗原共孵育以達到篩選目的。能與抗原結(jié)合的細胞被熒光標記，通過熒光激活細胞分選（Fluo?rescence?activated cell sorting，F(xiàn)ACS）分離。

圖2 噬菌體展示流程Figure 2 General protocol of phage display

核糖體展示需要核糖體、mRNA 和抗體形成三元復(fù)合物，通過加工修飾DNA，使核糖體翻譯到mRNA末端時缺乏終止密碼子而不脫離，形成三元復(fù)合物。復(fù)合物的mRNA 被反轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生編碼抗體的DNA，抗體負責與固定化抗原結(jié)合。然后DNA 被RNA 聚合酶轉(zhuǎn)錄，開始另一個形成和篩選三元復(fù)合物的循環(huán)。也可以直接通過活性氨基酸類似物嘌呤霉素形成共價的mRNA?抗體復(fù)合物，優(yōu)點是共價mRNA?抗體復(fù)合物更穩(wěn)定，可以在嚴格的篩選條件下富集抗體并增強穩(wěn)定性。核糖體展示不受細胞轉(zhuǎn)染和表達影響，但操作過程較復(fù)雜。

不同的淘選策略決定了最終的結(jié)果，例如淘選中使用的洗脫方法會影響抗體的結(jié)合特性，但有效的策略在實驗前是很難預(yù)測的［15］。多種方式組合的淘選策略可能比單一的方法效果更好，有研究稱噬菌體展示、酵母展示和FACS結(jié)合的篩選方法廣泛適用于分離可溶性抗原的scfv［16］。抗體庫的篩選是抗體工程最重要的工具之一。篩選大容量抗體庫的能力使模擬哺乳動物免疫反應(yīng)的技術(shù)得以發(fā)展，無需動物免疫即可分離抗體，并改造出具有更高親和力、穩(wěn)定性、效應(yīng)子功能的抗體。

3 基因工程抗體在識別小分子中的應(yīng)用

常見的小分子類別包括農(nóng)藥、除草劑、殺蟲劑、藥物、維生素、類固醇、激素、炸藥、染料、毒素和代謝物等。還有一些是生物學研究中常用的試劑，如熒光素、生物素、地高辛和二硝基酚［17］。因此識別小分子的基因工程抗體大多應(yīng)用于食品、環(huán)境污染物檢測，醫(yī)學檢驗及免疫療法中［18］。

3.1 食品和環(huán)境污染物檢測

基因工程抗體已經(jīng)較多應(yīng)用到食品和環(huán)境污染物檢測中，表現(xiàn)出良好的靈敏度和特異性。殺蟲劑、多氯聯(lián)苯、生物毒素、多環(huán)芳烴和金屬等低分子量污染物的特異性抗體對食品、水源、生態(tài)系統(tǒng)安全至關(guān)重要［16］。霉菌毒素不僅污染食品，還會危害人體健康，如黃曲霉毒素B1［19］和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇［20］致癌，貝類毒素和微囊藻毒素［21］等海洋毒素也是研究熱點。食品中的另一類主要污染源來自農(nóng)藥、除草劑和殺菌劑，如莠去津［22］，這類物質(zhì)也是環(huán)境污染物之一。其他由于濫用或殘留而易造成污染的物質(zhì)有維生素、抗生素［23］、抗菌素［15］、藥物［24］，經(jīng)過治療的動物的肉和牛奶中可能會有殘留［25］。此外，環(huán)境中的污染物還涉及工業(yè)相關(guān)的石油、阻燃劑、炸藥等（表1）。

值得注意的是，這些研究開發(fā)的免疫分析系統(tǒng)針對的分析物雖然不同，但研發(fā)的目的與方向卻是一致的：一是用非競爭性免疫測定或其他更優(yōu)的免疫測定法代替競爭法；二是提高其廣譜特異性，這對實現(xiàn)快速、方便、準確的現(xiàn)場檢測十分重要，也對抗體的特異性提出了更高的要求?；诳贵w重鏈和輕鏈結(jié)合的開放夾心免疫分析（Open?sandwich immunoassay，OS?IA）只需要單個抗體就能快速非競爭地均相檢測小分子，然而這種免疫分析方法更青睞scFv 和Fab。雖然sdAb在檢測小分子中也有應(yīng)用，且在與小分子結(jié)合過程中，VH 的作用似乎比VL 重要，但由于缺乏常規(guī)抗體的重鏈?輕鏈結(jié)構(gòu)域，所以不容易結(jié)合小分子，成功的例子很少［26］。

3.2 醫(yī)學檢驗與免疫治療

針對小分子的抗體可用于體外快速診斷［21］、濫用藥物診斷、毒品檢測（表2），不限于傳統(tǒng)診斷和藥物檢測所用的血清，可直接測定人的唾液、尿液、排泄物等。Immunalysis公司的毒品尿檢試劑盒使用了抗6?乙酰嗎啡的Fab，能特異性識別6?乙酰嗎啡而與分子結(jié)構(gòu)上只差一個醛基的嗎啡沒有交叉反應(yīng)［27］。完整抗體相對較大的體積和較長的血清半衰期不利于腫瘤的深層滲透，對放射敏感性組織（如骨髓）的高輻射劑量也一直是個問題。為了獲得較高的腫瘤特異性信號和治療功效，在靶向藥物遞送過程中需要提高腫瘤對背景的比率［28］。除了直接靶向蛋白抗原，基因工程抗體與小分子的結(jié)合為腫瘤治療、基因治療、蛋白替代療法提供了新的思路。

表1 用于檢測食品和環(huán)境污染物的基因工程抗體Table 1 Genetically engineered antibodies prepared for detection of food and environmental contaminants

表2 用于醫(yī)學檢驗與免疫治療的基因工程抗體Table 2 Genetically engineered antibodies prepared for medical examination and immunotherapy

4 討論與展望

與傳統(tǒng)抗體相比，基因工程抗體在識別小分子方面的優(yōu)勢十分明顯。雖然通過傳統(tǒng)免疫方法已獲得具有特異性的小分子單克隆抗體和多克隆抗體，但多抗的功能在不同免疫批次之間可能會有所不同，生產(chǎn)單抗的雜交瘤細胞系也可能不夠穩(wěn)定［29］，其親和力和特異性遠不如基因工程抗體。結(jié)合體外展示技術(shù)，通過控制篩選條件，基因工程抗體能夠識別相關(guān)小分子間的細微差異，如甲基化、磷酸化等化學修飾、蛋白質(zhì)序列和特定的構(gòu)象，其效果好于通過免疫獲得的抗體。盡管抗體庫技術(shù)還沒有完全取代傳統(tǒng)方法，但通過體外展示篩選出的基因工程抗體能快速獲得抗體序列信息，更好地控制抗體的性質(zhì)，有利于在基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究中的應(yīng)用［30］。基因工程抗體還克服了免疫耐受性，可選擇識別高度保守的靶標的親和試劑，對化學或熱變性有更高抗性［12］。在技術(shù)層面，基因工程抗體的體外展示相對簡單、廉價、快速，易于自動化以提高篩選效率［31］。

在制備基因工程抗體時，小分子與載體分子結(jié)合作為抗原，具有高溶解度和易于固定的優(yōu)點，但也可能會改變小分子的抗原性。將兩種性激素尿液代謝物分別與BSA偶聯(lián)時，發(fā)現(xiàn)小分子本身的活性基團、不飽和立體結(jié)構(gòu)等對產(chǎn)生抗體的特異性存在一定影響。此外，體外展示通常會產(chǎn)生針對免疫優(yōu)勢表位的抗體片段，而當小分子的表位較弱時，則不會或很少產(chǎn)生針對小分子的抗體?？蓪⑿》肿又苯优c固相載體結(jié)合，針對固定的小分子篩選抗體來避免這個問題。雖然理想目標是抗體對靶分子獨具高特異性，但也有可能會出現(xiàn)僅識別小分子?載體加合物和載體蛋白而不能單獨識別小分子的情況，最有效且直接的方法是在淘選階段改變載體蛋白［32］。雖然原理上將抗體庫與過量的載體蛋白共孵育也能去除與載體蛋白結(jié)合的抗體［22］，但在實驗中發(fā)現(xiàn)，判斷載體蛋白是否過量十分困難，且需要控制加入的抗體庫的量，這種間接競爭的方法無法完全去除非陽性克隆。

出于檢測的目的，基因工程抗體需要具備識別小分子與其結(jié)構(gòu)類似物的能力。雖然通過抗體庫技術(shù)可以產(chǎn)生滿足這類要求的抗體，但僅通過展示技術(shù)無法直接將其篩選出來。目前的鑒定方法一般以酶聯(lián)免疫吸附測定（Enzyme?linked immunosorbent assay，ELISA）為主，不僅要測定抗體識別小分子的親和力，還需測定抗體與其他相似小分子的交叉反應(yīng)率以判斷特異性，通常需要分析上千個克隆才能得到親和力和特異性都滿足產(chǎn)品要求的抗體，巨大的工作量也成為基因工程抗體識別小分子應(yīng)用中的阻礙。其他不利因素還包括許多小分子的標準品難以獲得或價格昂貴，增加了制備基因工程抗體的成本。開發(fā)免疫測定產(chǎn)品的趨勢之一是開發(fā)類別特異性檢測法或多種分析物測定法，一次測試即可測定多個目標。針對小分子的分析測定和診斷方法種類繁多，除了最常見的高效液相色譜法、ELISA、放射免疫分析之外，還有基于表面等離子共振的抑制免疫分析、OS?IA、雙抗體夾心ELISA、間接競爭性噬菌體ELISA、免疫PCR 等。不同的檢測方法對抗體的要求不同，在制備識別小分子的基因工程抗體時，也必須選擇合適的檢測方法。