蓋 凱，唐 葉，權(quán)永剛，陳愛民，陳全家，吳家和，胡保民，

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院農(nóng)業(yè)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室棉花教育部工程研究中心，烏魯木齊830052；2.農(nóng)業(yè)部西北棉花品種創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室九圣禾種業(yè)股份有限公司，昌吉831100；3.中國科學(xué)院微生物研究所植物基因組國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100101）

棉花是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物［1］。棉花纖維是紡織 工業(yè)的重要原料［1］。由大麗輪枝菌（Verticillium dahli?ae）引起的棉花黃萎病是影響當(dāng)前棉花生產(chǎn)的最重要因素之一，因此如何防治黃萎病發(fā)生成為當(dāng)前棉花生產(chǎn)的一個(gè)主要問題。

棉花黃萎病俗稱棉花的“癌癥”，在生產(chǎn)上難以防治［2］。發(fā)生面積涉及我國各大種植棉區(qū)。然而，在不同年份、不同地區(qū)甚至不同棉花單株黃萎病發(fā)生程度各不相同；棉花黃萎病發(fā)病程度的不均勻性是其主要特征，因此，往往采取病指來對(duì)抗感材料進(jìn)行分類［3?5］。一般認(rèn)為棉花黃萎病發(fā)病不均勻原因包括：土壤中病原菌含量不同、單株之間的生長(zhǎng)狀況不同、農(nóng)田小氣候差異等［6?12］。

土壤中黃萎病菌含量應(yīng)該包括其孢子、菌絲和微菌核等［13?14］。測(cè)定土壤中大麗輪枝菌的含量可能對(duì)棉花抗黃萎病生產(chǎn)有著重要的意義。魏鋒等［15］利用土樣水篩提純微菌核和實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)對(duì)土壤中黃萎病微菌核量；羅舒文等［10］利用培養(yǎng)土壤中微菌核進(jìn)行定量檢測(cè)，探明棉花黃萎病菌的分布區(qū)域及在土壤中的動(dòng)態(tài)變化過程；李艷［16］通過菌絲生長(zhǎng)速率法，對(duì)棉花黃萎病菌的菌絲及微菌核進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。但是，對(duì)于棉田棉株發(fā)病程度差異尚鮮見報(bào)道。

本研究利用盆栽棉花作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，探討不同時(shí)間點(diǎn)病原菌含量的變化與植株發(fā)病程度直接關(guān)系，并結(jié)合一種抑制大麗輪枝菌生長(zhǎng)的抑制菌——枯草芽孢桿菌和常年發(fā)病嚴(yán)重的病圃地土壤為正負(fù)對(duì)照，探索棉花黃萎病發(fā)病程度與土壤中大麗輪枝菌含量的相關(guān)性，以期為棉花抗病生產(chǎn)提供一定的理論依據(jù)和實(shí)踐保證。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料和棉花栽培

本實(shí)驗(yàn)所用大麗輪枝菌（V.dahliae）菌株“V991”以及枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）于本實(shí)驗(yàn)室保存。陸地棉（Gosspium hirsutum）新陸早57 由九圣禾種業(yè)股份公司提供，盆栽供試土壤樣品采集于新疆昌吉市九圣禾產(chǎn)業(yè)園區(qū)內(nèi)，沒有大麗輪枝菌污染；病圃地土壤來自新疆瑪納斯縣六戶地鎮(zhèn)黃萎病抗性鑒定試驗(yàn)地。

將接菌和對(duì)照土壤裝入花盆（15 cm × 15 cm）中，然后將盆埋入土中10 cm；在盆里直接播種，最后定苗為每盆1 株。澆水、施肥等農(nóng)田管理和日常農(nóng)田管理一致；實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.1.2 相關(guān)試劑盒與引物

DNA 提取試劑盒DNeasy powerSoil Kit 購自德國QIAGEN 公司；DNA 聚合酶2×Super Pfx Master Mix 購自聚合美生物公司；其余試劑盒購自北京擎科生物有限公司。測(cè)序及引物合成均由北京擎科公司完成。

1.2 方法

1.2.1 黃萎病菌和枯草芽孢桿菌的活化培養(yǎng)及接種

將用于本實(shí)驗(yàn)的黃萎病菌菌株“V991”和枯草芽孢桿菌活化，分別接種至Czapek 和LB 培養(yǎng)液中，使大麗輪枝菌孢子液濃度為1×108mL-1，枯草芽孢桿菌菌液濃度OD600為1.39。將收集到的孢子液及菌液接種土壤，按10 kg土壤50 mL菌量接種。

1.2.2 土壤黃萎病菌基因組DNA提取

將盆栽和溫室中接種了黃萎病菌和枯草芽孢桿菌的土壤及棉花病圃地土壤樣品分別稱取0.1 g，根據(jù)土壤樣品基因組提取試劑盒DNeasy powerSoil Kit 說明書提取樣品DNA進(jìn)行qPCR分析。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 定量分析土壤中大麗輪枝菌含量

qPCR 特異引物參照中國農(nóng)業(yè)大學(xué)張力群教授提供的大麗輪枝菌glyceraldehyde?3?phosphate dehydroge?nase（G3PD）基因序列。通過Primer premier 5軟件設(shè)計(jì)引物qG3PD?F/R，該對(duì)引物在NCBI 上進(jìn)行全物種Blast，結(jié)果顯示為大麗輪枝菌特異序列。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 按照擎科SYBR Green qPCR Master mix 試劑盒說明書進(jìn)行操作，以qG3PD?F/R 為引物擴(kuò)增，其中qG3PD?F：5'?cacggcgtcttcaagggt?3'，qG3PD?R：5' cagtg?gactcgacgacgtac?3'，反應(yīng)體系為20 μL：SYBR Green qP?CR Master mix 10 μL，稀釋模板DNA 20 ng／μL，引物qG3PD?F/R 各1.0 μL，加ddH2O 補(bǔ)齊至20 μL。擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性1 min；95 ℃變性10 s，58 ℃退火5s，72 ℃延伸15 s，40 個(gè)循環(huán)。將已知濃度的GFP 質(zhì)粒作為熒光定量的質(zhì)粒作為內(nèi)參，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增［17］。

1.2.4 水洗涂布菌落計(jì)數(shù)和PCR鑒定大麗輪枝菌落

稱取土樣5 g，根據(jù)Yang 等［18］的實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)土壤中的黃萎病菌進(jìn)行水篩，并涂布于PDA 培養(yǎng)基上，待菌落形成時(shí)，利用PCR對(duì)大麗輪枝菌菌落進(jìn)行鑒定，然后計(jì)數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

常規(guī)PCR反應(yīng)所用大麗輪枝菌特異引物序列由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)張力群教授提供，引物擴(kuò)增基因?yàn)镚3PD。其中G3PD?F：5'?gtctatcatgtgctggggttctcc?3'，G3PD?R：5'?gagatgatgaccttcttggcgcc?3'，擴(kuò)增體系為25.0 μL：模板DNA 20 ng／μL，引物G3PD?F/R 各0.5 μL，2×Super Pfx Master Mix 10 μL，加ddH2O 補(bǔ)齊至25 μL。擴(kuò)增條件：98 ℃預(yù)變性30 s；98 ℃變性10 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，32個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.5 發(fā)病程度分析

參照農(nóng)業(yè)部棉花抗性鑒定方法與評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病級(jí)劃分，發(fā)病等級(jí)分為0、1、2、3 和4，統(tǒng)計(jì)5 個(gè)病級(jí)的棉花植株，根據(jù)植株的發(fā)病等級(jí)計(jì)算接菌植株的發(fā)病指數(shù)（Disease index，DI），病指計(jì)算參照Wang 等［4］并進(jìn)行適當(dāng)修改。

將浸染后的植株截取子葉節(jié)以下相同部位的莖稈進(jìn)行徒手斜剖，觀察其木質(zhì)部褐化程度，參照Fradin等［2］方法，將徒手橫剖的植株莖稈進(jìn)行表面消毒，于PDA培養(yǎng)基上恢復(fù)培養(yǎng)。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

通過Excel 2010、GraphPad 5和SPSS 21.00等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 棉花植株之間發(fā)病程度差異分析

棉花植株發(fā)病程度差異較大，幼苗接種等量的黃萎病菌時(shí)，植株發(fā)病程度存在明顯差異（圖1），發(fā)病程度5 個(gè)級(jí)別植株分別為26%、11%、17%、6%和40%，發(fā)病指數(shù)為51%。統(tǒng)計(jì)分析表明，不同發(fā)病程度植株的株高、始節(jié)高度、果枝數(shù)、有效果指枝數(shù)、結(jié)鈴數(shù)和鈴重等農(nóng)藝性狀呈現(xiàn)顯著性差異（表1）。

圖1 棉花個(gè)體之間的發(fā)病程度差異性Figure 1 The difference of disease degree among cotton individuals

表1 不同盆栽植株農(nóng)藝性狀Table 1 Agronomic character of different potted plants

2.2 土壤大麗輪枝菌含量分析

利用試劑盒提取盆栽土壤中的總DNA，電泳分析表明這些DNA 質(zhì)量較好（圖2），滿足qPCR 分析要求。qPCR 分析結(jié)果表明：不同取樣時(shí)間土壤中大麗輪枝菌的相對(duì)含量存在顯著差異；同一時(shí)間點(diǎn)，不同盆栽土壤病菌量差異也為顯著水平（圖3）。

圖2 土壤提取DNA凝膠分析Figure 2 Gel analysis of DNA extracted from soil

圖3 土壤中大麗輪枝菌相對(duì)含量Figure 3 The relative contents of V.dahliae in soil

使用水洗涂布和PCR 鑒定相結(jié)合進(jìn)一步測(cè)定土壤中大麗輪枝菌含量，盆栽土壤浸提液稀釋后平板真菌菌落生長(zhǎng)情況見圖4（a），對(duì)不同類型菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定［圖4（b）］，并進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。統(tǒng)計(jì)分析表明不同時(shí)間點(diǎn)和盆栽土壤病原菌含量呈顯著差異，并且隨著時(shí)間的后移差異越大（表2）。

圖4 病圃土壤中真菌菌落分析和鑒定Figure 4 Analysis and identification of fungal colonies in disease nursery soil

表2 盆栽棉株土壤不同時(shí)間點(diǎn)大麗輪枝菌含量的方差分析Table 2 Variance analysis of the content of V.dahliae in potted cotton plant soil at different time points

2.3 植株發(fā)病程度與土壤大麗輪枝菌含量的相關(guān)性

對(duì)不同植株的發(fā)病程度與其土壤含菌量qPCR 結(jié)果進(jìn)行協(xié)方差分析，以土壤樣品的發(fā)病級(jí)數(shù)為縱軸（y），Ct值為橫軸（x），建立的曲線方程為y = -0.159x +8.289,該方程的相關(guān)系數(shù)為0.869，說明不同盆栽苗的發(fā)病程度與不同時(shí)間點(diǎn)土壤里病原菌含量存在相關(guān)性，隨著時(shí)間的推移相關(guān)性增大（圖5）。

圖5 植株發(fā)病程度與土壤大麗輪枝菌含量的相關(guān)性分析Figure 5 The correlation analysis between the disease degree of individual plant and the V.dahliae content in soil

2.4 枯草桿菌抑制大麗輪枝菌生長(zhǎng)影響植株發(fā)病程度

為進(jìn)一步證明土壤大麗輪枝菌含量與植株發(fā)病程度的相關(guān)性，一個(gè)能抑制大麗輪枝菌生長(zhǎng)的菌株（枯草芽孢桿菌）被應(yīng)用。在使用枯草芽孢桿菌的盆里，棉花植株發(fā)病很輕或不發(fā)?。▓D6）。用涂布平板和PCR 分析，枯草芽孢桿菌處理盆栽土壤大麗輪枝菌含量顯著低（圖6）。這些數(shù)據(jù)再次證明了土壤中大麗輪枝菌含量低，其對(duì)應(yīng)的植株發(fā)病程度輕或不發(fā)病。

圖6 枯草芽孢桿菌抑制黃萎病的發(fā)病程度分析Figure 6 Analysis of Verticillium wilt in habited by Bacillus subtilis

為從另一個(gè)方向證明土壤大麗輪枝菌含量與植株發(fā)病程度的相關(guān)性，選取新疆常年發(fā)病病圃土壤作為對(duì)照，這些病圃中棉花植株發(fā)病均為4 級(jí)程度［圖7（a）］。每個(gè)病圃地的微菌核量可以達(dá)到每克土壤50個(gè)以上，qPCR 分析結(jié)果表明這些土壤中的大麗輪枝菌相對(duì)含量達(dá)到1.25×105以上，為盆栽土壤含量的100倍（圖7），0～4 級(jí)植株發(fā)病程度分析分別為3.85%、6.25%、4.52%、8.94%和76.44%，發(fā)病指數(shù)為85.92%，這些數(shù)據(jù)表明土壤中大麗輪枝菌含量直接決定棉花植株發(fā)病程度。

圖7 病圃土壤大麗輪枝菌含量分析Figure 7 Analysis on the content of V.dahliae in the soil of the disease nursery

3 討論與結(jié)論

研究假設(shè)土壤里大麗輪枝菌含量存在局部不均勻是造成地面上棉花單株發(fā)病程度不同的主要原因，然而在培養(yǎng)箱、溫室和病圃中接種等量病原菌時(shí)，也會(huì)出現(xiàn)單株發(fā)病程度不同的現(xiàn)象［4］，利用盆栽棉花接種等量大麗輪枝菌分析不同時(shí)間點(diǎn)每盆土壤菌量的變化和其棉株發(fā)病程度的關(guān)系，結(jié)果表明隨著時(shí)間的推移，不同盆之間的大麗輪枝菌含量呈現(xiàn)顯著差異，這些差異可能是造成不同盆間棉株發(fā)病程度差異的主要原因。與前人［19?20］研究得出的大麗輪枝菌在土壤里含量的變化受多種因素的影響，比如多年種植棉花、氣候和耕作處理等結(jié)果一致。因此，研究結(jié)果證明土壤中病原菌含量是不斷變化的，甚至不同棉株下的局部土壤菌量也是變化的，這可能是影響其上棉株發(fā)病程度不同的主要原因。研究利用枯草芽孢桿菌抑制大麗輪枝菌生長(zhǎng)作為實(shí)驗(yàn)的正對(duì)照，枯草芽孢桿菌能夠抑制土壤大麗輪枝菌的生長(zhǎng)，其機(jī)制目前還不清楚［21?22］。研究結(jié)果顯示枯草芽孢桿菌降低土壤中大麗輪枝菌的含量，減輕了棉花黃萎病的發(fā)病程度，也說明了棉花植株的發(fā)病程度與土壤里的病原菌含量呈相關(guān)性。同時(shí)研究也利用多年發(fā)病嚴(yán)重的病圃地土壤為負(fù)對(duì)照研究菌含量與發(fā)病程度的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)病圃地土壤含有高的病原菌含量，這與其他報(bào)道［23?24］結(jié)果一致。也再次說明土壤里大麗輪枝菌的含量是影響棉花單株發(fā)病程度的一個(gè)重要因素。