李崇萍， 劉倩葶， 劉琨毅,3， 梁正維， 劉明麗， 張正艷， 程建勝，趙菊潤(rùn)， 安江珊， 李紅葉， 張新鳳， 趙 明*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)龍潤(rùn)普洱茶學(xué)院， 昆明 650201； 2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)云南省藥用植物生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/西南中藥材種質(zhì)創(chuàng)新與利用國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心， 昆明 650201； 3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 昆明 650201； 4.云南品斛堂生物科技有限公司， 德宏 678300； 5.龍陵縣石斛研究所， 德宏 678300； 6.浙江農(nóng)林大學(xué)省部共建亞熱帶森林培育國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 杭州 311300)

石斛屬(DendrobiumSw.)為蘭科(Orchidaceae)植物中的第二大屬，廣泛分布于亞洲熱帶和亞熱帶地區(qū)[1]。在全世界有1 400多種，目前中國(guó)已記載石斛屬植物81種，2變種，其中18種為中國(guó)特有種[1]。中醫(yī)認(rèn)為，石斛具有滋陰清熱、生津益胃、潤(rùn)肺止咳、明目強(qiáng)身等功效；現(xiàn)代藥理研究認(rèn)為石斛具有增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤、抗衰老、降血壓等功效[2-3]?！吨袊?guó)藥典》(2020版)收載鐵皮石斛與石斛兩個(gè)藥材，前者指鐵皮石斛(D.officinaleKimura et Migo)的莖，是傳統(tǒng)名貴藥材[4]；后者包括金釵石斛(D.nobile Lindl)、鼓槌石斛(D.chrysotoxumLindl.)或流蘇石斛(D. fimbriatum Hook.)及其同屬植物近似種的新鮮或干燥莖[5]。紫皮石斛(D.devonianumPaxt)是一種多糖含量較高，集藥用、保健、食用和觀賞為一體的石斛[6]。梳唇石斛(D.strongylanthumRchb. f.)主要分布于云南景洪、勐海，是中國(guó)一級(jí)珍稀瀕危藥用石斛原植物之一[7-9]。

隨著組培技術(shù)的發(fā)展，石斛已經(jīng)廣泛被人工種植。目前大面積種植的石斛，主要是鐵皮石斛、霍山石斛、紫皮石斛，除此之外鼓槌石斛及梳唇石斛也有部分種植。云南是中國(guó)石斛種植面積最大的省份，其種植面積多達(dá)8萬畝(1畝=666.67 m2)，全國(guó)70%的石斛出自云南[10]。截止到2018年，全國(guó)鐵皮石斛種植面積達(dá)8萬余畝，其中云南鐵皮石斛種植面積已達(dá)5萬畝，占全國(guó)鐵皮石斛種植面積的49.7%[11]。云南省龍陵縣是“紫皮石斛之鄉(xiāng)”，2018年，全縣紫皮石斛種植面積2.02萬畝，占全國(guó)種植和產(chǎn)量的70%以上[12]，云南鼓槌石斛人工栽培面積達(dá)已達(dá)1萬畝，年產(chǎn)鮮花1 198.21 t，實(shí)現(xiàn)產(chǎn)值2 396.4萬元；產(chǎn)鮮莖13 309.7 t，實(shí)現(xiàn)產(chǎn)值15 962.4萬元[13]。在石斛種植過程，產(chǎn)生了大量的石斛花，不僅具有觀賞價(jià)值，而且具有重要的開發(fā)價(jià)值。2018年6月，中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)衛(wèi)健委發(fā)布通告鐵皮石斛花作為新食品原料終止審查，按照地方特色食品進(jìn)行管理[14]。2020年6月，浙江省衛(wèi)生健康委員會(huì)發(fā)布關(guān)于《浙江省食品安全地方標(biāo)準(zhǔn) 干制鐵皮石斛花》(DB33/ 3011—2020)的通告[15]。2020年6月，廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生健康委員會(huì)發(fā)布《鐵皮石斛花》(DBS45/ 062—2019)食品安全地方標(biāo)準(zhǔn)[16]。2020年7月，福建省衛(wèi)生健康委員會(huì)關(guān)于發(fā)布《福建省食品安全地方標(biāo)準(zhǔn) 鐵皮石斛花》(DBS35/ 001—2020)的通告[17]。2020年7月，貴州省衛(wèi)生健康委員會(huì)發(fā)布《食品安全地方標(biāo)準(zhǔn)鐵皮石斛花(干葉)》(DBS52/ 045—2020)[18]。2018年2月，《云南省食品安全地方標(biāo)準(zhǔn) 紫皮石斛》(DBS 53/027—2018)開始實(shí)施[19]。由此可見，更多石斛花的品種即將納入食品管理行列，其物質(zhì)組成、生物活性以及產(chǎn)品開發(fā)利用將成為一個(gè)新的研究熱點(diǎn)。

關(guān)于石斛花的化學(xué)成分與生物活性，已經(jīng)有部分報(bào)道，如：李芳等[20]研究發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛花具有良好的抗氧化活性；呂素華等[21]研究表明鐵皮石斛花中含有較為豐富的多糖、浸出物及氨基酸等營(yíng)養(yǎng)成分；雷珊珊等[22]研究表明鐵皮石斛花能改善陰虛、改善肝功能損傷；楊曉娜等[23]研究表明紫皮石斛花色苷色素具有良好的抑菌及自由基清除能力；Deng等[24]認(rèn)為紫皮石斛花莖中含有大量具有免疫調(diào)節(jié)活性的多糖類物質(zhì)；鼓槌石斛花中含有的菲類、聯(lián)芐類、芴酮類、酯類、甾體、維生素等物質(zhì)，故其具有抗腫瘤活性、抗HIV活性、抗氧化活性和滋陰作用[25]，石斛花含有多糖、氨基酸、類黃酮、甾體、維生素等物質(zhì)，具有抗氧化等、滋陰、免疫調(diào)節(jié)等活性。并且不同種類的石斛花外觀與物質(zhì)組成，乃至生物活性都不同，有必要比較研究。

鐵皮、紫皮與鼓槌石斛在云南已經(jīng)大面積種植，隨之也產(chǎn)生了大量的石斛花。梳唇石斛在云南零星種植，也有一定量的石斛花。隨著栽培面積的逐年擴(kuò)大，產(chǎn)生了大量的石斛花，亟須對(duì)其產(chǎn)品進(jìn)行深度研發(fā)，以促進(jìn)云南石斛產(chǎn)業(yè)的良性發(fā)展。生物醫(yī)藥成為云南醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)最具活力，最具成長(zhǎng)性的產(chǎn)業(yè)，且未來前景樂觀[26-27]。研究4種石斛花的物質(zhì)組成與生物活性，不僅具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，也具有一定的科學(xué)意義。為此，現(xiàn)以鐵皮石斛花、紫皮石斛花、鼓槌石斛花與梳唇石斛花為材料，測(cè)定比較化學(xué)成分及抗氧化活性，旨在為不同種類石斛花的開發(fā)和利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

鐵皮石斛花(D.officinaleKimura et Migo’s flower，DOF)、紫皮石斛花(D.devonianumPaxt’s flower， DDF)、鼓槌石斛花(D.chrysotoxumLindl’s flower，DCF)、梳唇石斛花(D.strongylanthumRchb. f. ’s flower， DSF)于2018年5月采自云南品斛堂生物科技有限公司云南龍陵石斛種植基地(圖1)，采摘后40 ℃烘干，粉碎后過40目，待用?？偪寡趸?total anti-oxidation competence，T-AOC)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)自由基和羥自由基(·OH)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。楊梅素(myricetin, My)、槲皮素(quercetin，Qu)、木犀草素(luteolin，Lu)、山奈酚(kaempfero，Kf)、花旗松素(taxifolin，Tax)和蘆丁(rutin，Ru)標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自天津一方科技有限公司；天冬氨酸(aspartic acid，Asp)、谷氨酸(glutamic acid，Glu)、絲氨酸(serine，Ser)、組氨酸(histidine，His)、甘氨酸(glycine，Gly)、蘇氨酸(L-threonine，Thr)、精氨酸(L-arginine，Arg)、丙氨酸(alanine，Ala)、酪氨酸(tyrosine，Tyr)、半胱氨酸[L(+)-cysteine，Cys]、甲硫氨酸(methionine，Met)、苯丙氨酸(phenylalanine，Phe)、異亮氨酸(isoleucine，Ile)、亮氨酸(leucine，Leu)、賴氨酸(lysine，Lys)、纈氨酸(valine，Val)、脯氨酸(proline，Pro)標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自美國(guó)Agilent公司；乙腈(色譜純)、甲醇(色譜純)均購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

圖1 4種石斛花樣品Fig.1 Four kinds of Dendrobium’s flower

1.2 儀器與設(shè)備

CP214型電子天平，北京賽多利斯天平有限公司；HB10型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠； SHB-III型循環(huán)水式真空泵，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；HH-S28S型數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市大地自動(dòng)化儀器廠；756CRT 型紫外可見分光光度計(jì)，上海菁華科技儀器有限公司；1200型高速液相色譜系統(tǒng)，美國(guó)Agilent公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 理化指標(biāo)測(cè)定

應(yīng)用酒石酸亞鐵比色法[28]、茚三酮比色法[28]、苯酚-硫酸法[28]和蒽酮比色法[28]分別測(cè)定4種石斛花的多酚(polyphenols，PP)、游離氨基酸(free amino acid，F(xiàn)AA)、多糖(polysaccharide，PS)和可溶性糖(soluble sugar，SS)含量。

1.3.2 功能性成分測(cè)定

按照實(shí)驗(yàn)室前期建立的方法，應(yīng)用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)測(cè)定氨基酸組分(Ala、Arg、Asp、Cys、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Tyr、Val)，并根據(jù)峰面積使用外標(biāo)法進(jìn)行定量分析[29]。應(yīng)用實(shí)驗(yàn)室前期建立的HPLC方法測(cè)定類黃酮物質(zhì)(My、Qu、Lu、Kf、Tax、Ru)，并根據(jù)峰面積使用外標(biāo)法進(jìn)行定量分析[30]。

1.3.3 抗氧化活性測(cè)定

4種石斛花待測(cè)液的制備：在10 g石斛花粉末加入150 mL的50%乙醇，浸提48 h，經(jīng)四層紗布過濾得到浸提液，-60 ℃凍干成粉末。用蒸餾水適當(dāng)稀釋后分別按照T-AOC、DPPH·和·OH試劑盒要求進(jìn)行T-AOC、DPPH·清除率與·OH清除率的測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每個(gè)樣品提取3次，每次提取進(jìn)行2次重復(fù)測(cè)定，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用軟件SPSS statistics 22.0進(jìn)行單因素方差分析，組間采用最小顯著差數(shù)法進(jìn)行兩兩比較；利用軟件Origin 8.0進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 4種石斛花理化指標(biāo)比較分析

4種石斛花中均檢測(cè)到PP、FAA、PS及SS(圖2)。PP含量為6.28%～14.58%，各石斛花之間差異顯著(P< 0.05)，其中，DOF中PP含量最高，DCF含量最低。FAA在DOF中的含量最高(2.37%±0.07%)，在DSF中次之(2.23%±0.11%)，在DDF中再次之(1.64%±0.05%)，在DCF中最低(0.94%±0.07%)，且相互之間差異顯著(P<0.05)。對(duì)機(jī)體免疫力具有增強(qiáng)作用的PS[2-3]在DOF中的含量最高(5.73%±0.04%)，在DCF中次之(4.82%±0.39%)。SS在DCF中含量最高(53.46%±0.68%)，在其余3種石斛花中無顯著性差異(P>0.05)。

不同的小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

2.2 4種石斛花功能性成分比較分析

在4種石斛花中共檢測(cè)出24種功能性成分；除DSF沒有檢測(cè)到Val，其余3種石斛花均檢測(cè)到16種氨基酸，包括6種必需氨基酸(Ile、Leu、Met、Val、Phe、Thr)；除DDF沒有檢測(cè)到Tax，DCF沒有檢測(cè)到Ru、Lu，其余兩種石斛花均檢測(cè)到6種類黃酮物質(zhì)(My、Qu、Lu、Kf、Tax、Ru)，如表1所示。

由表1可知，DSF的氨基酸總含量最高[(8.95±0.78)mg/g]，其次是DDF的氨基酸含量[(6.58±0.36)mg/g]，再次是DOF的氨基酸含量[(4.93±0.31)mg/g]，DCF的氨基酸總含量最低[(3.07±0.19)mg/g]，且4種石斛花氨基酸總含量之間存在顯著性差異(P<0.05)。其中，Arg、Asp、Cys、Glu、Gly、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Thr、Tyr12種氨基酸的含量在DSF中最高，Ala、His、Val3種氨基酸的含量在DDF中最高，Ser的含量在DOF中最高。類黃酮物質(zhì)的總量在DDF中最高，達(dá)到了(5.87±1.41)mg/g；在DOF中其次，為(2.07±0.20)mg/g；在DSF中再次，為(1.01±0.41)mg/g；在DCF中最低，為(0.43±0.11)mg/g；4種石斛花類黃酮物質(zhì)總含量相互之間存在顯著性差異(P<0.05)。其中，具有改善機(jī)體脂肪代謝、抑制甘油三酯積累功能的Qu[31]在DDF中含量最高，為(3.61±0.76)mg/g；具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化應(yīng)激等生理功能的Tax[32]在DOF中含量最高，為(0.23±0.07)mg/g；用于心血管疾病等的治療與預(yù)防的Kf[33]在DDF中含量最高，為(1.51±0.30)mg/g；能改善由免疫應(yīng)答引起的炎癥反應(yīng)的My[34]在DDF中含量最高，為(0.65±0.29)mg/g；能有效消除自由基的Ru[35]在DSF中含量最高，為(0.61±0.17)mg/g；具有抗過敏、抗炎活性、降尿酸功能的Lu[35]在DDF中含量最高，為(0.06±0.01)mg/g。

表1 石斛花樣品功能性成分含量Table 1 Contents of functional components of Dendrobium’s flower

2.3 4種石斛花乙醇提取物抗氧化能力比較分析

氧化衰老是生物隨著時(shí)間推移自發(fā)的必然過程，延緩衰老是醫(yī)藥學(xué)家研究的重點(diǎn)[2-3]。4種石斛花乙醇提取物抗氧化活性測(cè)定結(jié)果如圖3所示。由圖3(a)可知，4種石斛花醇提物總抗氧化能力均隨著濃度增加而增強(qiáng)；濃度在1.5～4.0 mg/mL變化時(shí)，4種石斛花醇提物總抗氧化能力的高低順序均為：DSF>DOF>DDF>DCF，且在同一濃度條件下，4種石斛花醇提物的總抗氧化能力差異顯著(P<0.05)；當(dāng)濃度在4.0 mg/mL時(shí)，DSF的總抗氧化能力最強(qiáng)，為(98.76±0.96)U。

自由基被認(rèn)為是人體氧化衰老的主要因素，清除自由基的能力經(jīng)常被作為抗氧化能力的評(píng)價(jià)指標(biāo)[2-3]。由圖3(b)知，4種石斛花乙醇提取物濃度從0.15 mg/mL增加到0.45 mg/mL時(shí)，DDF對(duì)DPPH·清除能力均顯著高于另外3種石斛花(P<0.05)，其半抑制濃度(IC50)為0.054 1 mg/mL；DSF、DOF、DCF對(duì)DPPH·清除能力依次減弱，IC50分別為0.150 4、0.252 6、0.468 1 mg/mL。由圖3(c)知，4種石斛花乙醇提取物濃度從0.40 mg/mL增加到1.00 mg/mL時(shí)，DDF對(duì)·OH清除能力均顯著高于另外3種石斛花(P<0.05)，其IC50為0.509 2 mg/mL；DCF、DSF、DOF對(duì)DPPH·清除能力依次減弱，IC50分別為0.552 6、0.596 2、0.712 1 mg/mL。綜上，DDF與DSF相對(duì)于DOF和DCF具有較強(qiáng)的抗氧化能力。

同一濃度不同的小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

2.4 4種石斛花化學(xué)成分與抗氧化活性相關(guān)性分析

研究表明多酚與類黃酮物質(zhì)是石斛花的抗氧化活性成分[2-3]，但石斛花中含有多種化學(xué)成分，因此進(jìn)一步分析了本研究檢測(cè)到的化學(xué)成分與抗氧化能力之間的相關(guān)性，其結(jié)果如圖4所示。結(jié)果表明，Ru、Asp、Glu、Ser、His、Gly、Thr、Arg、Tyr、Cys、Met、Phe、Ile、Leu、PP、FAA均與總抗氧化能力呈正相關(guān)(P<0.01)，PS與總抗氧化能力呈負(fù)相關(guān)(P<0.01)；除Tax、Pro、PS與DPPH·清除能力相關(guān)性不顯著外，其余化學(xué)成分均與DPPH·清除能力呈正相關(guān)(P<0.05)；Glu、Gly、Thr、Ala、Arg、Tyr、Cys、Met、Phe、Ile、Leu均與·OH清除能力呈正相關(guān)(P<0.01)，Tax、Ser、PS均與·OH清除能力呈負(fù)相關(guān)(P<0.01)。由此可見，4種石斛花檢測(cè)到的化學(xué)成分除Tax、Pro、PS外，其他成分對(duì)石斛花的抗氧化活性均具有一定的貢獻(xiàn)。

圖4 化學(xué)成分含量與抗氧化活性相關(guān)性分析Fig.4 Correlation among levels of chemical components and antioxidant activities

3 討論

氨基酸是有機(jī)體細(xì)胞的基本組成成分，是生物體合成蛋白質(zhì)的基本原料，在生物體的生長(zhǎng)代謝過程中起著關(guān)鍵作用[36]。4種石斛花均含有人體所必需的6種氨基酸，且以DSF的含量最高。

自由基又稱為游離基，它是單質(zhì)或化合物的均裂而產(chǎn)生的帶有未成對(duì)電子的原子或基團(tuán)[37]。已有研究證明，自由基參與多種疾病的病理過程。自由基清除劑在清除機(jī)體自由基,保護(hù)機(jī)體免受氧化損害中起重要作用[38-39]。天然的自由基清除劑已成為醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、食品科學(xué)等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[40]。氧化衰老是生物隨著時(shí)間推移自發(fā)的必然過程，延緩衰老是醫(yī)藥學(xué)家的重點(diǎn)研究課題。自由基被認(rèn)為是人體氧化衰老的主要因素，清除自由基的能力經(jīng)常被作為抗氧化能力的評(píng)價(jià)指標(biāo)。研究表明，鐵皮石斛黃酮類化學(xué)成分主要集中于鐵皮石斛花中[20]。通過對(duì)4種石斛花的抗氧化能力檢測(cè)和比較，4種石斛花對(duì)DPPH自由基、羥自由基均具有較好的清除能力。其中，以DDF對(duì)自由基的清除能力最強(qiáng)，與具有良好抗氧化活性的類黃酮物質(zhì)的總量在DDF中最高的結(jié)論相一致。

2018年6月中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)發(fā)布通告將鐵皮石斛花新食品原料申請(qǐng)列入終止審查目錄，鐵皮石斛花相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)利用進(jìn)一步擴(kuò)大，多個(gè)省份已經(jīng)出臺(tái)相關(guān)食品安全標(biāo)準(zhǔn)。其他石斛花相關(guān)地方標(biāo)準(zhǔn)的制定也正在進(jìn)行中。進(jìn)行4種石斛花氨基酸檢測(cè)，為其余3種石斛花作為食品新原料開發(fā)提供一定的理論支持?？蔀楹罄m(xù)開發(fā)提取石斛花氨基酸產(chǎn)品相關(guān)產(chǎn)品提供理論支持。以期隨著中國(guó)大健康產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，石斛花能得到更加充分利用，石斛產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益增加，石斛產(chǎn)業(yè)良性發(fā)展。綜上所述，4種石斛花的開發(fā)有利于解決石斛花資源利用不充分的問題，對(duì)石斛產(chǎn)業(yè)的良性發(fā)展有重要作用。

4 結(jié)論

測(cè)定了DOF、DOF、DCF、DSF4類石斛花的理化指標(biāo)、功能性成分與抗氧化活性。結(jié)果表明，4種石斛花中PP、FAA、PS和SS的含量分別為6.28%～14.58%、0.94%～2.37%、1.47%～5.73%和46.85%～53.46%，其中，PP、FAA、PS在DOF中含量最高，SS在DCF中含量最高。DSF的氨基酸總含量最高，為(8.95±0.78)mg/g，且4種石斛花氨基酸總含量之間存在顯著性差異(P<0.05)。類黃酮物質(zhì)的總量在DDF中最高(5.87±1.41) mg/g，且4種石斛花相互之間存在顯著性差異(P<0.05)。DSF的總抗氧化能力最強(qiáng)，DDF對(duì)DPPH·清除能力及·OH清除能力最強(qiáng)。此外，相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)Ru、Asp、Glu、Ser、His、Gly、Thr、Arg、Tyr、Cys、Met、Phe、Ile、Leu、PP、FAA與抗氧化活性正相關(guān)(P<0.01)。因此，試驗(yàn)結(jié)果為今后石斛花相關(guān)的健康產(chǎn)品等研發(fā)奠定了一定的基礎(chǔ)。