田亞萍，張明威，葛京平，張春妮，汪俊軍，王成(1.常州市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇常州 213003；2.中國(guó)人民解放軍東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 a.檢驗(yàn)科，b.泌尿外科，南京 210002)

腎透明細(xì)胞癌(clear cell renal cell carcinoma，ccRCC)是腎臟常見(jiàn)的惡性腫瘤，且易對(duì)放、化療耐受，目前手術(shù)切除仍是首要治療方案。ccRCC尚缺乏有效的血清學(xué)標(biāo)志物，病理活檢是ccRCC診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但因具有創(chuàng)傷性使其臨床應(yīng)用受限[1]。目前已證實(shí)幾種血清蛋白質(zhì)具有一定的診斷ccRCC或提示復(fù)發(fā)的價(jià)值，但其臨床應(yīng)用價(jià)值尚不明確[2]。細(xì)胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)是細(xì)胞主動(dòng)分泌的30～150 nm的囊泡，可攜帶miRNAs等生物活性分子在細(xì)胞組織間傳遞交流。因EVs miRNAs的釋放是一個(gè)主動(dòng)過(guò)程，其作為腫瘤分子生物學(xué)標(biāo)志物更具特異性[3]。miR-99b-3p在多種不同類型腫瘤中表達(dá)異常，而與其源于同一前體miRNA的miR-99b-5p，在ccRCC患者組織中呈低表達(dá)，且與酪氨酸激酶抑制劑治療的腫瘤進(jìn)展有關(guān)[4]，提示miR-99b-3p亦可能與ccRCC密切相關(guān)。本研究擬通過(guò)檢測(cè)miR-99b-3p在ccRCC患者和健康人對(duì)照血清EVs中的表達(dá)水平，評(píng)估其作為輔助診斷ccRCC的潛在臨床價(jià)值。

1 材料與方法

1.1研究對(duì)象 收集2016年12月至2018年10月于東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院泌尿外科初診且確診為腎臟疾病患者的血清樣本100例。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)ccRCC伴有乙肝、結(jié)核、急性炎癥、腎腫瘤未確診或其他器官腫瘤；(2)接受過(guò)干預(yù)治療的ccRCC、ccRCC復(fù)發(fā)或最后被確診為非腎臟惡性腫瘤，如腎囊腫、腎良性腫瘤；(3)腎臟其他惡性腫瘤，如多房囊性腎細(xì)胞癌、嫌色腎細(xì)胞癌、乳頭狀腎細(xì)胞癌、Xp11.2易位/轉(zhuǎn)錄因子E3(translocation facor E3，TFE3)基因融合相關(guān)性腎細(xì)胞癌。參照WHO腫瘤分型標(biāo)準(zhǔn)對(duì)所有患者手術(shù)切除樣本進(jìn)行病理學(xué)確診，最終共有65例ccRCC患者樣本納入分析，且在入院之前均未進(jìn)行任何治療，其中男37例，女28例，年齡(57.31±1.33)歲。按照Furhman分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[5]對(duì)腫瘤進(jìn)行分級(jí)，其中Ⅰ級(jí)(高分化)5例、Ⅱ級(jí)(高分化)47例、Ⅲ級(jí)(中分化)10例、Ⅳ級(jí)(低分化)3例。75名健康人對(duì)照為同期在本院體檢中心就診的體檢者，男43例，女32例，年齡(56.54±1.55)歲，兩組間性別(χ2=0.002，P>0.05)、年齡(t=0.380，P>0.05)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究經(jīng)東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(No.2017NZGKJ-068)，納入對(duì)象均知情同意。

1.2主要試劑與儀器 分析純級(jí)別無(wú)水乙醇、異丙醇、氯仿(上?；瘜W(xué)試劑公司)，ExoQuick-exosome試劑盒(美國(guó)CA公司)，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、rTaq酶、buffer、dNTP及MgCl2等均購(gòu)自日本TaKaRa公司，除RNA酶水(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)，Trizol試劑(美國(guó)Life Technologies公司)，miR-99b-3p及內(nèi)參miR-16所用逆轉(zhuǎn)錄引物、TaqMan探針、7300型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)，Tissuelyser-48全自動(dòng)樣品自動(dòng)研磨儀(上海凈信科技公司)，SAS67120型超純水機(jī)(美國(guó)Millipore公司)，5418型高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)。

1.3標(biāo)本前期處理與保存 抽取健康人對(duì)照體檢時(shí)和ccRCC患者治療前的空腹靜脈血3.5 mL于含分離膠的生化管中。1 500×g離心5 min后取血清，4 ℃、12 000×g離心5 min，進(jìn)一步去除殘留血細(xì)胞和細(xì)胞碎片，將收集上清置于-80 ℃保存。

1.4血清EVs的提取 按照ExoQuick試劑盒操作說(shuō)明書(shū)提取100 μL血清中EVs，并將其重懸于25 μL除RNA酶水中。

1.5EVs RNA提取 用Trizol試劑從EVs重懸液中提取RNA[6]，所得總RNA溶解于20 μL除RNA酶水后，置于-80 ℃保存待用。

1.6qRT-PCR檢測(cè)EVs miR-99b-3p水平 用基于TaqMan探針技術(shù)的qRT-PCR檢測(cè)EVs miR-99b-3p。首先將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：3.5 μL DEPC ddH2O、2 μL 5×buffer、1 μL反向引物、0.5 μL AMV酶、2 μL RNA和1 μL 10 mmol/L dNTPs，共10 μL，反應(yīng)條件：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，4 ℃保存，將所得cDNA樣本置于-20 ℃保存。qRT-PCR反應(yīng)體系共20 μL，包括： 14.77 μL ddH2O、2 μL 10×PCR緩沖液、1.2 μL 25 mmol/L MgCl2、0.4 μL 10 mmol/L dNTP、0.3 μL rTaq酶、0.33 μL TaqMan探針和miRNA上、下游引物、1 μL cDNA。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)。另外，以無(wú)RNA模板的ddH2O為陰性對(duì)照，每份樣本均進(jìn)行3個(gè)復(fù)孔檢測(cè)。采用內(nèi)參基因miR-16對(duì)結(jié)果進(jìn)行校正以及計(jì)算EVs miR-99b-3p的表達(dá)水平；應(yīng)用2-△Ct法[7]計(jì)算EVs miR-99b-3p相對(duì)于內(nèi)參miR-16的表達(dá)水平，公式：△Ct=CtmiR-99b-3p-CtmiR-16。

2 結(jié)果

2.1ccRCC患者EVs miR-99b-3p水平變化 miR-16在ccRCC患者和健康人對(duì)照血清EVs中的表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。進(jìn)一步利用miR-16對(duì)miR-99b-3p的水平進(jìn)行校正和計(jì)算。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，ccRCC患者血清EVs miR-99b-3p水平[19.770(4.724，22.910)]顯著高于健康人對(duì)照組[5.830(2.046，7.862)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.2ccRCC早期患者EVs miR-99b-3p變化水平 Ⅰ/Ⅱ級(jí)ccRCC(早期)患者的EVs miR-99b-3p水平[16.960(4.429，20.960)]和Ⅲ/Ⅳ級(jí)ccRCC患者(晚期)的EVs miR-99b-3p水平[27.490(5.248，37.060)]均顯著高于體檢健康者(P均<0.01)；但早期與晚期ccRCC患者EVs miR-99b-3p水平間的差異則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3ROC曲線評(píng)估EVs miR-99b-3p水平篩查ccRCC的效能 將ccRCC患者和健康人對(duì)照分別設(shè)為疾病組和對(duì)照組，繪制ROC曲線。根據(jù)Youden指數(shù)最大原則，確定cut-off值，并計(jì)算其RCC曲線下面積(AUCROC)、敏感性、特異性，評(píng)估EVs miR-99b-3p對(duì)于ccRCC的篩查價(jià)值，結(jié)果顯示，當(dāng)取cut-off值6.483時(shí)，其篩查ccRCC患者與健康人對(duì)照的AUCROC為0.757(95%CI：0.674～0.840)；篩查早期ccRCC患者與健康人對(duì)照的AUCROC為0.754(95%CI：0.663～0.846)，篩查ccRCC及早期ccRCC的敏感性均為69.2%，特異性均為77.3%，但早、晚期ccRCC患者EVs miR-99b-3p水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖1。

注：A，EVs miR-99b-3p對(duì)ccRCC篩查價(jià)值；B，EVs miR-99b-3p對(duì)早期ccRCC篩查價(jià)值。

2.4EVs miR-99b-3p水平與ccRCC的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估分析 在單因素Logistic回歸分析中，將ccRCC狀態(tài)作為因變量，EVs miR-99b-3p為自變量，結(jié)果顯示EVs miR-99b-3p與ccRCC密切相關(guān)(OR=7.677，95%CI：3.610～16.328，P<0.01)；校正性別、年齡、飲酒史及吸煙史等因素后，多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，EVs miR-99b-3p仍是ccRCC患者潛在的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(OR=7.745，95%CI：3.596～16.682，P<0.01)。

2.5EVs miR-99b-3p水平與ccRCC患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)分析 Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，EVs miR-99b-3p與ccRCC患者的臨床分級(jí)、腫瘤大小、有無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均無(wú)明確相關(guān)性(r值分別為0.018、-0.152、0.020，P均>0.05)。

3 討論

EVs miRNA與ccRCC的關(guān)系已有相關(guān)報(bào)道。ccRCC患者尿液EVs中的miR-126-3p、miR-449a以及miR-34b-5p可作為ccRCC潛在的非侵入性診斷性尿液生物標(biāo)志物[8]。Dias等[9]分析來(lái)自32例ccRCC原位癌患者手術(shù)前后及37例伴隨轉(zhuǎn)移的ccRCC患者血漿EVs miRNA圖譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與術(shù)前相比，術(shù)后EVs hsa-miR-25-3p、hsa-miR-126-5p、hsa-miR-200c-3p和hsa-miR-301a-3p的水平降低，而hsa-miR-1293水平升高；與原位癌患者相比，已發(fā)生轉(zhuǎn)移患者的hsa-miR-301a-3p水平升高，而hsa-miR-1293水平降低，提示hsa-miR-301a-3p、hsa-miR-1293可作為轉(zhuǎn)移性ccRCC的腫瘤標(biāo)志物。

本研究通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)miR-99b-3p在ccRCC患者血清EVs中的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)相比于健康人對(duì)照，ccRCC患者血清EVs miR-99b-3p顯著升高。ROC曲線分析提示，血清EVs miR-99b-3p對(duì)ccRCC的診斷有潛在應(yīng)用價(jià)值，但對(duì)早期患者尚不具備更好的診斷效率。同時(shí)Logistics回歸結(jié)果顯示，miR-99b-3p是ccRCC的獨(dú)立危險(xiǎn)因子。然而，本研究尚存在一些不足：(1)樣本量不夠充足，已有數(shù)據(jù)無(wú)法證實(shí)EVs miR-99b-3p與ccRCC的臨床分期、腫瘤大小、是否發(fā)生轉(zhuǎn)移相關(guān)；(2)EVs miR-99b-3p的具體來(lái)源、去向及分子調(diào)控機(jī)制并不清楚，對(duì)其調(diào)控的靶基因以及生物學(xué)功能還需進(jìn)一步研究；(3)患者隨訪時(shí)間較短，無(wú)法評(píng)估EVs miR-99b-3p對(duì)ccRCC預(yù)后價(jià)值；(4)ccRCC組織中miR-99b-3p的表達(dá)水平如何，是否與EVs表達(dá)一致尚不清楚。后期我們將擴(kuò)大樣本量并加強(qiáng)隨訪以及增加組織樣本進(jìn)一步探討。

miR-99b在多種不同類型腫瘤中發(fā)揮不同作用，如miR-99b通過(guò)抑制κB-Ras2和mTOR基因的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的吞噬作用和抗原呈遞能力，但具體調(diào)控機(jī)制尚不明確[10]；Li等[11]發(fā)現(xiàn)，miR-99b可抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路，抑制人宮頸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，并證實(shí)其以與mRNA 3′-UTR結(jié)合方式下調(diào)mTOR的表達(dá)。另外，Yao等[12]通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-99b-3p通過(guò)直接靶向原鈣黏蛋白19，促進(jìn)肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和增殖，其調(diào)控機(jī)制也是在轉(zhuǎn)錄后水平與原鈣黏蛋白19 mRNA結(jié)合，且高表達(dá)的miR-99b-3p與肝癌患者的惡性臨床病理特征和較差的預(yù)后密切相關(guān)。由于miR-99b-3p和miR-99b-5p由同一前體經(jīng)核酸內(nèi)切酶處理而來(lái)，據(jù)此猜測(cè)miR-99b-3p亦可能與ccRCC的進(jìn)展密切相關(guān)。本研究結(jié)果表明，miR-99b-3p在ccRCC患者血清中EVs表達(dá)水平升高，且對(duì)ccRCC具有潛在的診斷價(jià)值，但對(duì)其潛在的靶基因、其對(duì)靶基因的調(diào)控是經(jīng)典的轉(zhuǎn)錄后水平或通過(guò)其他方式進(jìn)行調(diào)控，以及如何影響ccRCC的生物學(xué)行為仍需進(jìn)一步研究。