鄒宇婷,王觀筠，劉軍，，3，王子乾，吳陽勛，孫志軍，秦留安，尹彤*

(1解放軍醫(yī)學(xué)院,北京 100853；2解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心心血管內(nèi)科,北京 100853；3解放軍總醫(yī)院第二醫(yī)學(xué)中心老年醫(yī)學(xué)研究所, 北京 100853)

急性冠狀動脈綜合征(acute coronary syndrome,ACS)是嚴(yán)重危害人類健康的常見心血管疾病之一，盡管過去10年ACS的死亡率已大大降低，且冠心病的年死亡率下降了34.4%，但經(jīng)歷復(fù)發(fā)事件的患者死亡風(fēng)險(xiǎn)仍較高[1]。血小板P2Y12受體拮抗劑聯(lián)合阿司匹林雙聯(lián)抗血小板治療(dual antiplatelet therapy,DAPT)仍是目前公認(rèn)的ACS標(biāo)準(zhǔn)治療和預(yù)防經(jīng)皮冠狀動脈介入術(shù)(percutaneous coronary intervention,PCI)術(shù)后支架內(nèi)血栓形成的金標(biāo)準(zhǔn)[2]。氯吡格雷作為一種P2Y12受體拮抗劑，可以單獨(dú)使用或與阿司匹林聯(lián)合使用以預(yù)防缺血性事件并改善ACS患者預(yù)后，并已在全球范圍內(nèi)廣泛使用了10多年[3]。盡管氯吡格雷抗血小板治療在許多患者中是安全有效的，但個(gè)體間的治療反應(yīng)存在很大差異[4]。研究證實(shí)，造成P2Y12受體拮抗劑抗血小板反應(yīng)性的個(gè)體差異因素包括疾病狀態(tài)，合并用藥和藥物劑量[5,6]，以及藥物基因組學(xué)因素(CYP2C19基因多態(tài)性)[7]。然而，已知的這些因素尚不足以解釋血小板反應(yīng)性的個(gè)體差異。

研究顯示，血小板的活性受到許多微小核糖核酸(microribonucleic acid,miRNA)的影響，這些miRNA調(diào)控血小板內(nèi)信使RNA(messenger ribonucleic acid， mRNA)的表達(dá)[8]。Kaudewitz等[9]研究發(fā)現(xiàn)，血漿中微小核糖核酸-126(microribonucleic acid-126，miR-126)與ACS患者的血小板功能及正常人群中血小板活化標(biāo)記物具有相關(guān)性。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，血小板源性miR-126能夠預(yù)測氯吡格雷的抗血小板反應(yīng)性[10]。功能分析證實(shí)，miR-126的功能單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP；dbSNP：rs4636297)，能夠阻斷miR-126的加工成熟，從而抑制miR-126的表達(dá)[11]。因此，我們推測miR-126的功能SNPrs4636297可能影響氯吡格雷抗血小板反應(yīng)性和療效。鑒于此，本研究旨在分析miR-126的功能基因多態(tài)性rs4636297與ACS患者中氯吡格雷抗血小板反應(yīng)性及療效的相關(guān)性。

1 對象與方法

1.1 研究對象

連續(xù)募集2015年11月至2017年2月在解放軍總醫(yī)院心血管內(nèi)科住院期間接受DAPT，同時(shí)在氯吡格雷治療第3天進(jìn)行血小板功能檢測的ACS患者，對所有患者均進(jìn)行血小板功能檢測。入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡≥18歲；(2)按照美國心臟聯(lián)合會/美國心臟病學(xué)會診斷標(biāo)準(zhǔn)[12]診斷為ACS的患者；(3)服用氯吡格雷及阿司匹林治療；(4)自愿參加本次臨床試驗(yàn)并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)應(yīng)用影響血小板活性或功能的藥物(如非甾體類抗炎藥、阿片類藥物等)的患者；(2)患有影響血小板功能或活性的疾病(如急、慢性炎癥,肝、腎功能障礙,近期有出血傾向,潛在出血危險(xiǎn)或血液系統(tǒng)疾病)的患者；(3)禁用抗血小板藥物的患者。

ACS患者中氯吡格雷的治療原則為：對于PCI或者急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)的患者，接受氯吡格雷聯(lián)合阿司匹林雙聯(lián)抗血小板負(fù)荷劑量治療(氯吡格雷600 mg/d和阿司匹林300 mg/d)后，進(jìn)行穩(wěn)定治療劑量(氯吡格雷75 mg/d和阿司匹林100 mg/d)的治療；對于非PCI或非AMI的患者，接受氯吡格雷聯(lián)合阿司匹林的穩(wěn)定劑量雙聯(lián)抗血小板治療。本研究符合赫爾辛基宣言，并通過了解放軍總醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的論證和批準(zhǔn)。

1.2 血小板功能檢測及分組方法

采集ACS患者3 ml外周全血, 通過血栓彈力圖(thromboelastography，TEG)檢測血小板反應(yīng)性。TEG檢測采用樂普科技有限公司的西芬斯TEG分析儀及配套試劑。根據(jù)二磷酸腺苷(adenosine diphosphate,ADP)誘導(dǎo)的血小板纖維蛋白凝塊強(qiáng)度指標(biāo)(ADP-induced platelet-fibrin clot strength，MAADP)和ADP誘導(dǎo)的血小板抑制率(ADP抑制率)，進(jìn)行抗血小板反應(yīng)性呈極端值的病例篩選。

極端值的病例篩查分組標(biāo)準(zhǔn)：TEG MAADP>47 mm, ADP 抑制率<30%的患者入血小板反應(yīng)性呈極端高反應(yīng)性(high on-treatment platelet reactivity,HTPR)為HTPR組；TEG MAADP<31 mm, ADP 抑制率>90%的患者入血小板反應(yīng)性呈極端低反應(yīng)性(low on-treatment platelet reactivity，LTPR)為LTPR組。

1.3 全血DNA的SNP分型

采用全血基因組 DNA 提取系統(tǒng)(Solarbio, D1850)提取DNA，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用SnapShot法[13]檢測候選SNP位點(diǎn)，通過多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction, PCR)擴(kuò)增，檢測miR-126(rs4636297)、CYP2C19*2 (rs4244285)、CYP2C19*3(rs4986893)3個(gè)SNPs位點(diǎn)。檢測位點(diǎn)的引物序列分別為：rs4636297上游5’ACACTTCAAACTCGTACCGTGAG3’，下游 5’CACGCTGAGGGAGGTCAA3’；rs4244285上游5’ GAGCTTGGCATATTGTATCTATACCTT3’，下游5’ CGATTCTTGGTGTTCTTTTACTTTCTC 3’； rs4986893上游5’ TCAGCAATTTCTTAACTTGATGGA 3’，下游5’ TTC-AGGGCTTGGTCAATATAGA 3’。測序采用美國ABI公司的3730XL基因測序儀、SnapShot試劑盒及配套試劑，PCR采用北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司的東勝龍黑金剛EDC-810 PCR儀及配套試劑。

1.4 缺血終點(diǎn)事件及隨訪

缺血終點(diǎn)事件包括心源性死亡、非致死性心肌梗死、非致死性腦卒中、緊急血運(yùn)重建及支架內(nèi)血栓形成。隨訪時(shí)間1年，由專人負(fù)責(zé)，詳細(xì)記錄患者主要缺血事件發(fā)生的癥狀,統(tǒng)一填寫隨訪表格。上述隨訪均由專門經(jīng)過培訓(xùn)的醫(yī)師在門診或經(jīng)電話隨訪完成，缺血終點(diǎn)事件的判斷由臨床藥物試驗(yàn)中心終點(diǎn)事件判斷專家組確定。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 患者臨床基線資料及SNP分布

連續(xù)募集了1 134例符合入選標(biāo)準(zhǔn)的ACS患者。根據(jù)TEG檢測篩查獲得的HTPR組患者193例和LTPR組患者171例。入選患者中，男女比例為2.5∶1(男性 260例，女性104例)，平均年齡(64.87±10.73)歲。2組患者總膽固醇和ACS分型的水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；2組患者年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)、血壓、病史、合并用藥及實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)等基線資料均無明顯差異(表1)。

表1 2組患者的基線資料比較

本研究共選擇3個(gè)基因位點(diǎn)進(jìn)行SNP檢測，分別為miR-126 rs4636297,CYP2C19*2(rs4244285), CYP2C19*3(rs4986893)。在364例患者中，miR-126 rs4636297 AG等位基因攜帶者104例(28.57%)，AA等位基因攜帶者8例(2.20%)，miR-126 rs4636297最小A等位基因頻率為16.48%；CYP2C19*2(rs4244285) AG等位基因攜帶者139例(38.19%)，AA等位基因攜帶者45例(12.36%)，CYP2C19*2(rs4244285)最小A等位基因頻率為31.46%；CYP2C19*3(rs4986893) AG等位基因攜帶者36例(9.89%)，未發(fā)現(xiàn)AA等位基因攜帶者，CYP2C19*3(rs4986893)最小A等位基因頻率為4.95%。

2.2 與氯吡格雷抗血小板反應(yīng)性的相關(guān)性分析

通過校正性別、年齡、高脂血癥、高血壓、糖尿病多種因素后證實(shí)，CYP2C19功能缺失性等位基因是氯吡格雷抗血小板反應(yīng)性的獨(dú)立影響因素(P<0.05)；miR-126 rs4636297 A等位基因也是氯吡格雷抗血小板反應(yīng)性降低的獨(dú)立影響因素(P<0.05；表2)。

2.3 與臨床終點(diǎn)事件的相關(guān)性分析

通過校正年齡、性別、CYP2C19功能缺失性等位基因、高血壓、糖尿病及高脂血癥等因素后，CYP2C19功能缺失性等位基因主要缺血事件的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)2組患者無明顯差異；而rs4636297 A等位基因是1年內(nèi)口服氯吡格雷患者發(fā)生主要缺血終點(diǎn)事件的獨(dú)立危險(xiǎn)因素 (P<0.05；表3)。

表3 logistic 回歸分析各基因分型與缺血終點(diǎn)事件關(guān)系

3 討 論

血小板表面的P2Y12受體在血小板活化以及血栓的生長和穩(wěn)定中起著核心作用[14]，P2Y12受體拮抗劑是ACS抗栓治療的一線用藥。P2Y12受體拮抗劑氯吡格雷抗血小板反應(yīng)性具有個(gè)體差異，已知的臨床環(huán)境和藥物基因組學(xué)因素并不足以解釋P2Y12受體拮抗劑抗血小板反應(yīng)性差異。已有研究證實(shí)，多種miRNA的表達(dá)可能與血小板反應(yīng)性相關(guān)[15, 16]，其中miR-126-3p在巨核細(xì)胞中的過表達(dá)被證實(shí)與血小板活化水平升高有關(guān)[17]，且被證實(shí)能夠通過抑制P2Y12受體的表達(dá)參與血小板功能的調(diào)節(jié)[9]。前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-126的功能單核苷酸多態(tài)性rs4636297能夠通過阻斷miR-126的加工成熟，抑制miR-126的表達(dá)，進(jìn)而可能影響血小板反應(yīng)性[11]。本研究在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步證實(shí)，rs4636297 A等位基因能夠獨(dú)立于已知的藥物基因因素(CYP2C19功能缺失性等位基因)和臨床環(huán)境因素，與高血小板反應(yīng)性密切相關(guān)，并且還是經(jīng)氯吡格雷抗血小板治療的ACS患者1年內(nèi)主要缺血終點(diǎn)事件發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。鑒于此，我們認(rèn)為rs4636297可能成為評估ACS患者抗血小板治療反應(yīng)性和預(yù)后的生物標(biāo)志物。

既往有研究顯示，血小板miR-126能夠作為生物標(biāo)志物預(yù)測PCI術(shù)后患者心血管不良事件的發(fā)生[18]，miR-126也有可能參與預(yù)測患者發(fā)生心肌梗死[19]。本研究進(jìn)一步證實(shí)了miR-126的表達(dá)水平還可能通過影響抗血小板藥物的反應(yīng)性影響ACS患者的臨床轉(zhuǎn)歸。后續(xù)通過對miR-126 rs4636297深入的生物功能機(jī)制分析可能進(jìn)一步證實(shí)，干預(yù)血小板源性 miR-126的表達(dá)是否能夠影響P2Y12受體拮抗劑的抗血小板反應(yīng)性,進(jìn)而成為抗血小板治療的新靶點(diǎn)。

本研究有一定的局限性。本研究為單中心觀察性研究，納入病例數(shù)較少，且難以排除其他與ACS患者臨床轉(zhuǎn)歸相關(guān)的影響因素。此外，本研究僅僅入選了接受氯吡格雷抗血小板治療的ACS患者，因此尚難以明確miR-126 rs4636297對其他P2Y12受體拮抗劑(如替格瑞洛等)抗血小板反應(yīng)性的影響。未來可通過開展多中心大樣本真實(shí)世界的臨床研究，以及深入的功能機(jī)制分析，進(jìn)一步證實(shí)miR-126 rs4636297對抗血小板藥物個(gè)體化選擇和應(yīng)用的價(jià)值。