劉 娟 張俊輝 王 芹 周 影 錢 錕 祝長(zhǎng)杰

(吉林省蠶業(yè)科學(xué)研究院，吉林吉林 132012)

柞蠶蛹蟲草中含有豐富的蛋白質(zhì)及氨基酸，蛋白質(zhì)含量為30%，氨基酸含量為22%，還含有冬蟲夏草所不含有的抗癌物質(zhì)蟲草素，所以蛹蟲草是冬蟲夏草的良好替代品。在柞蠶蛹蟲草的批量生產(chǎn)中，蛹蟲草菌的保藏方法對(duì)柞蠶蛹蟲草的產(chǎn)量及活性物質(zhì)含量影響較大。本文對(duì)蛹蟲草菌的保藏方法及不同保藏方法對(duì)蛹蟲草菌生產(chǎn)能力的影響作一探討。

1 材料與方法

1.1 供試材料

蛹蟲草菌，柞蠶蛹，均由吉林省蠶業(yè)科學(xué)研究院提供。PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養(yǎng)基(potato dextrose agar medium，PDA)；豐富培養(yǎng)基：葡萄糖2%，蛋白胨2%，磷酸鈉0.25%，磷酸氫二鉀0.15%，硫酸鎂0.075%，馬鈴薯15%；米飯培養(yǎng)基：大米20%，大麥35%，糙米20%，黃豆25%。

1.2 試劑與儀器

試劑：乙腈、甲醇購(gòu)于美國(guó)Fisher試劑公司，蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)。儀器：Agilent 1290超高效液相色譜儀，KOKUSAN H-19F離心機(jī)，0.45μm水系濾膜等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 蛹蟲草菌冷凍保藏

蛹蟲草菌接種于米飯培養(yǎng)基中，接種量為15%，待蛹蟲草菌長(zhǎng)滿米飯培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)10 d，放置于-19 ℃冷凍保藏。

1.3.2 冷凍保藏蛹蟲草菌活化

取-19 ℃冷凍保藏的蛹蟲草菌，放置于-4 ℃的環(huán)境中進(jìn)行活化12 h再應(yīng)用于試驗(yàn)中。

1.3.3 柞蠶蛹蟲草培育

取固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)旺盛、轉(zhuǎn)色能力強(qiáng)的蛹蟲草菌菌塊(約黃豆粒大小)接種于100 mL PDA液體培養(yǎng)基中，23 ℃避光、120 r/min搖床培養(yǎng)96 h，得到蛹蟲草菌菌絲球懸液。每只柞蠶蛹接種量為0.2～0.3 mL。在適當(dāng)培養(yǎng)條件下進(jìn)行柞蠶蛹蟲草的培育(吉林省蠶業(yè)科學(xué)研究院專利技術(shù))，測(cè)定蛹蟲草菌的僵化率和出草率，得到柞蠶蛹蟲草。

1.3.4 蛹蟲草菌繼代培育

取PDA固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)旺盛、轉(zhuǎn)色能力強(qiáng)的第1代蛹蟲草菌約黃豆粒大小，再次接種于PDA固體培養(yǎng)基中，23 ℃避光培養(yǎng)至蛹蟲草菌全部覆蓋培養(yǎng)基后見光培養(yǎng)，此為第2代菌株，依次繼代培養(yǎng)至第6代菌株，即得到蛹蟲草菌的第1代至第6代菌株。豐富培養(yǎng)基繼代培育相同。

1.3.5 樣品的制備

柞蠶蛹蟲草60 ℃烘干至恒重，粉碎，100目過(guò)篩，取0.5 g柞蠶蛹蟲草粉加水定容至100 mL，超聲水提3 h，5 000 r/min離心取上清，0.45 μm水系濾膜過(guò)濾用于液相色譜測(cè)定。

1.3.6 蟲草素含量測(cè)定

精密稱取蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品，配制成濃度范圍為0.255～50 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，每濃度進(jìn)樣10 μL，3次平行。HPLC檢測(cè)條件：Welch Ultimate XB-C18色譜柱(5 μm，4.6mm×250mm)；流動(dòng)相為水：乙腈=90∶10(V/V)；柱溫30 ℃；流速1 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm。

記錄不同濃度蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品溶液吸收峰面積并取平均值，以蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，以其不同濃度所對(duì)應(yīng)的吸收峰面積為縱坐標(biāo)。繪制蟲草素標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖1為蟲草素標(biāo)準(zhǔn)溶液(20 ug/mL)液相色譜圖，圖2為蟲草素標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性方程為Y=0.6693X+0.5083，R2=0.9999。

圖1 蟲草素標(biāo)準(zhǔn)溶液(20 ug/mL)液相色譜圖

圖2 蟲草素標(biāo)準(zhǔn)曲線

2 結(jié)果與分析

2.1 蛹蟲草菌冷凍保藏不同時(shí)間對(duì)其生產(chǎn)能力的影響

蛹蟲草菌在冷凍保藏不同時(shí)間時(shí)注蛹后其柞蠶蛹蟲草的數(shù)量見圖3，隨著冷凍保藏時(shí)間的延長(zhǎng)，蛹蟲草菌均出現(xiàn)出草率降低的情況。以菌株B為例，初始時(shí)菌株B出草率為82.3%，冷凍保藏6月激活后出草率為80.7%，較初始時(shí)出草率降低1.9%；冷凍保藏12月激活后出草率為74.3%，較初始時(shí)出草率降低9.7%；冷凍保藏18月激活后出草率為69.7%，較初始時(shí)出草率降低15.3%。可見，隨著冷凍保藏時(shí)間的延長(zhǎng)蛹蟲草菌仍然具有生產(chǎn)能力，但生產(chǎn)能力大幅下降，故以生產(chǎn)柞蠶蛹蟲草為目的批量生產(chǎn)中，蛹蟲草菌不適合過(guò)長(zhǎng)時(shí)間冷凍保藏。

圖3 蛹蟲草菌冷凍保藏不同時(shí)間對(duì)其生產(chǎn)能力的影響

2.2 蛹蟲草菌冷藏保藏不同時(shí)間對(duì)其生產(chǎn)能力的影響

不同蛹蟲草菌在冷藏保藏不同時(shí)間時(shí)注蛹后柞蠶蛹蟲草的數(shù)量見圖4，隨著冷藏保藏時(shí)間的延長(zhǎng)，不同蛹蟲草菌均出現(xiàn)出草率降低的情況。以菌株B為例，初始時(shí)菌株B出草率為82.3%；冷藏保藏6月后出草率為78.3%，較初始時(shí)出草率降低4.9%；冷藏保藏12月后出草率為70.3%，較初始時(shí)出草率降低14.6%；冷藏保藏18月后出草率為64%，較初始時(shí)出草率降低22.2%?？梢姡S著冷藏保藏時(shí)間的延長(zhǎng)蛹蟲草菌注蛹后出草率逐漸降低，故以生產(chǎn)柞蠶蛹蟲草為目的批量生產(chǎn)中，蛹蟲草菌亦不適合過(guò)長(zhǎng)時(shí)間冷藏保藏。

圖4 蛹蟲草菌冷藏保藏不同時(shí)間對(duì)其生產(chǎn)能力的影響

2.3 蛹蟲草菌冷藏保藏不同時(shí)間其蟲草素含量變化

蛹蟲草菌在冷藏保藏不同時(shí)間注蛹后柞蠶蛹蟲草中蟲草素含量見圖5，隨著蛹蟲草菌冷藏保藏時(shí)間的延長(zhǎng)，柞蠶蛹蟲草出現(xiàn)蟲草素含量降低的現(xiàn)象。以菌株D為例，初始時(shí)蟲草素含量為1.07 mg/g，冷藏保藏6月后蟲草素含量為1.01 mg/g，較初始時(shí)含量降低5.6%；冷藏保藏12月后蟲草素含量為0.93 mg/g，較初始時(shí)含量降低13.1%；冷藏保藏18月后蟲草素含量為0.87 mg/g，較初始時(shí)含量降低18.7%?？梢?，隨著蛹蟲草菌冷藏保藏時(shí)間的延長(zhǎng)柞蠶蛹蟲草中蟲草素含量逐漸降低。

圖5 蛹蟲草菌冷藏保藏不同時(shí)間其蟲草素含量變化

2.4 蛹蟲草菌在豐富培養(yǎng)基中不同傳代次數(shù)時(shí)其生產(chǎn)能力的變化

蛹蟲草菌在豐富培養(yǎng)基中不同傳代次數(shù)時(shí)生產(chǎn)能力見圖6。以菌株A為例，第1代蛹蟲草菌出草率為86.7%；第2代蛹蟲草菌出草率為81%，較第1代下降6.6%；第3代出草率為76.7%，較第1代下降11.5%；第4代蛹蟲草菌出草率為72.3%，較第1代下降16.6%；第5代蛹蟲草菌出草率為68.7%，較第1代下降20.8%；第6代出草率為63.7%，較第1代下降26.5%。可見，豐富培養(yǎng)基中蛹蟲草菌隨傳代次數(shù)的增加其生產(chǎn)能力均出現(xiàn)下降的現(xiàn)象，故在柞蠶蛹蟲草的批量生產(chǎn)中蛹蟲草菌不適宜在豐富培養(yǎng)基中傳代次數(shù)過(guò)多。

圖6 蛹蟲草菌在豐富培養(yǎng)基中不同傳代次數(shù)時(shí)其生產(chǎn)能力的變化

2.5 蛹蟲草菌在PDA培養(yǎng)基中不同傳代次數(shù)時(shí)其生產(chǎn)能力的變化

在PDA培養(yǎng)基中，蛹蟲草菌在不同傳代次數(shù)時(shí)出草率見圖7，蛹蟲草菌在PDA培養(yǎng)基中繼代培育其出草率均不斷降低。以菌株A為例，第1代蛹蟲草菌出草率為86%；第2代蛹蟲草菌出草率為83.7%，較第1代下降2.7%；第3代出草率為78.7%，較第1代下降8.5%；第4代蛹蟲草菌出草率為73.3%，較第1代下降14.8%；第5代蛹蟲草菌出草率為68.7%，較第1代下降20.1%；第6代出草率為65%，較第1代下降24.4%?？梢?，在PDA培養(yǎng)基中蛹蟲草菌隨傳代次數(shù)的增加其生產(chǎn)能力均出現(xiàn)下降的現(xiàn)象，且趨勢(shì)與在豐富培養(yǎng)基中相同。

圖7 蛹蟲草菌在PDA培養(yǎng)基中不同傳代次數(shù)時(shí)其生產(chǎn)能力的變化

3 討 論

在柞蠶蛹蟲草的生產(chǎn)中，蛹蟲草菌的保藏時(shí)間、保藏方法、傳代次數(shù)等都對(duì)柞蠶蛹蟲草生產(chǎn)的影響巨大。

菌種保藏過(guò)程中，隨著保藏時(shí)間的延長(zhǎng)蛹蟲草菌均會(huì)出現(xiàn)生產(chǎn)能力降低的現(xiàn)象，但冷凍保藏較冷藏保藏蛹蟲草菌生產(chǎn)能力降低的速度慢，故冷凍更適合用來(lái)保藏蛹蟲草菌，但在柞蠶蛹蟲草的批量生產(chǎn)中還應(yīng)盡量減少蛹蟲草菌的保藏時(shí)間以達(dá)到良好的生產(chǎn)效果。

隨著冷藏保藏時(shí)間的延長(zhǎng)蟲草素含量逐漸降低，故在以高產(chǎn)蟲草素為目的的柞蠶蛹蟲草的批量生產(chǎn)中，應(yīng)盡量減少蛹蟲草菌的保藏時(shí)間。

PDA培養(yǎng)基中蟲草菌生產(chǎn)能力下降的速度在不同傳代次數(shù)時(shí)均慢于在豐富培養(yǎng)基中，可見PDA培養(yǎng)基更適合蛹蟲草菌的繼代保藏，在柞蠶蛹蟲草的批量生產(chǎn)中應(yīng)盡量選擇PDA培養(yǎng)基作為蛹蟲草菌的保藏培養(yǎng)基，同時(shí)盡量減少生產(chǎn)用蛹蟲草菌的傳代次數(shù)，以達(dá)到高產(chǎn)柞蠶蛹蟲草的目的。