田 鋒，吳宸廣，陳 明，楊菲菲，李淑菊

(1黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院·黑龍江 哈爾濱 150036；2黑龍江省老年病醫(yī)院·黑龍江 哈爾濱 150036)

慢性腎衰竭(CRF)特征在于進(jìn)行性的腎間質(zhì)纖維化(RIF)，最終導(dǎo)致終末期腎臟疾病，其發(fā)病率逐漸上升且呈現(xiàn)年輕化的趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅人們的健康，給國(guó)家造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。參地補(bǔ)腎膠囊是國(guó)醫(yī)大師張琪教授根據(jù)多年治療CRF的經(jīng)驗(yàn)，鉚定CRF脾腎兩虛、濕濁內(nèi)蘊(yùn)的病機(jī)特點(diǎn)而擬定，臨床上應(yīng)用于治療CRF，能夠改善患者腎功能，調(diào)節(jié)脂代謝，提高腎小球?yàn)V過(guò)率，具有一定的抗RIF的作用[2]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于“藥物-靶點(diǎn)-疾病”相互作用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行藥物研究，適合于研究中藥與疾病的復(fù)雜作用機(jī)制。故本文運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)參地補(bǔ)腎膠囊活性成分及其抗RIF相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行體統(tǒng)研究，為參地補(bǔ)腎膠囊治療CRF的臨床應(yīng)用供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)、Universal Protein數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org/)、Gene Cards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org/)、OMIN生物數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.omim.org/)、Venny2.1在線軟件作圖工具平臺(tái)(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)、STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/)、Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.metascape.org/)和 Cytoscape3.7.2軟件、Origin Lab 2019繪圖軟件。

1.2 方法

1.2.1 藥物化學(xué)成分及其作用靶點(diǎn)的收集 將參地補(bǔ)腎膠囊中涉及的中藥成分(人參、白術(shù)、茯苓、大黃、黃連、半夏、草果仁、竹茹、熟地黃、菟絲子、淫羊藿、桃仁、紅花、丹參、赤芍)逐一輸進(jìn)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(TCMSP)中進(jìn)行檢索，設(shè)定口服生物利用度(OB)≥30%及類藥性(DL)≥0.18篩選得到所有中藥的活性成分，并在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索活性成分對(duì)應(yīng)的作用靶點(diǎn)。所獲得的作用靶點(diǎn)名稱(protein name)輸入到Universal Protein數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索，選定物種來(lái)源為“human”，找到各靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的基因名(gene name)，方便后續(xù)的分析。

1.2.2 疾病靶點(diǎn)獲取 在Gene Cards生物數(shù)據(jù)庫(kù)和OMIN生物數(shù)據(jù)庫(kù)，輸入“Renal interstitial fibrosis”，去掉重復(fù)項(xiàng)目獲得RIF靶點(diǎn)集。

1.2.3 潛在作用靶點(diǎn)的獲取 在Venny2.1在線作圖工具平臺(tái)上分別錄入?yún)⒌匮a(bǔ)腎膠囊作用靶點(diǎn)和RIF靶點(diǎn)，得到兩者的交集，作為潛在作用靶點(diǎn)，并繪制韋恩圖。

1.2.4 蛋白之間相互作用(Protein-Protein Interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析 將方法3中所得到潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索，設(shè)置蛋白種類為“Homo sapiens”，最低相互作用閾值設(shè)置為0.9，獲取蛋白之間相互作用關(guān)系的數(shù)據(jù)信息，將其導(dǎo)入Cytoscape3.72軟件，繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2.5 網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建及分析 將藥物的活性成分，以及“1.2.3”中所得的潛在作用靶點(diǎn)分別導(dǎo)入Cytoscape軟件，使用Network Analyzer功能對(duì)藥物中的主要活性成分進(jìn)行分析，構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”相互作用網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。

1.2.6 基因本體(Gene Ontology，GO)與京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析 將潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入metascape數(shù)據(jù)庫(kù)，分別得到GO中的生物過(guò)程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)和細(xì)胞組成(cellular component，CC)，和KEGG富集分析結(jié)果。并通過(guò)Origin Lab 2019繪圖軟件對(duì)之進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化。

2 結(jié)果

2.1 參地補(bǔ)腎膠囊活性成分及作用靶點(diǎn)信息 將參地補(bǔ)腎膠囊中涉及的中藥成分(人參、白術(shù)、茯苓、大黃、黃連、半夏、草果仁、竹茹、熟地黃、菟絲子、淫羊藿、桃仁、紅花、丹參、赤芍)逐一輸進(jìn)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(TCMSP)中進(jìn)行檢索，在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中設(shè)定口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18篩選化合物靶點(diǎn)信息。其中未檢索到中藥竹茹的相關(guān)信息，經(jīng)查詢文獻(xiàn)找尋中藥竹茹的化學(xué)成分，在TCMSP中對(duì)其分子進(jìn)行單項(xiàng)查詢，結(jié)合(OB)及類藥性結(jié)合既往研究結(jié)果，納入相應(yīng)成分及其作用靶點(diǎn)[3-4]。并結(jié)合已有化學(xué)成分、藥理作用和臨床應(yīng)用文獻(xiàn)報(bào)道，去掉多種中藥含有相同的成分后得到163個(gè)有效化學(xué)成分和286個(gè)可能有效靶點(diǎn)。將所獲得的作用靶點(diǎn)名稱(protein name)輸入到Universal Protein數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索，選定物種來(lái)源為“human”，找到各靶點(diǎn)與之對(duì)應(yīng)的基因名(gene name)。中藥成分靶點(diǎn)信息概況見(jiàn)表1。

表1 參地補(bǔ)腎膠囊成分及靶點(diǎn)

2.2 疾病靶點(diǎn)和潛在靶點(diǎn)獲取 在Gene Cards生物數(shù)據(jù)庫(kù)，OMIN生物數(shù)據(jù)庫(kù)，按疾病“Chronic renal failure”搜檢索，去除重復(fù)項(xiàng)目后共獲得關(guān)于RIF的靶點(diǎn)1 248個(gè)。將2.1中得到的286個(gè)藥物活性成分作用的靶點(diǎn)與1 248個(gè)疾病靶點(diǎn)導(dǎo)入在Venny2.1在線做圖工具平臺(tái)上，兩者取交集后獲得共同靶點(diǎn)121個(gè)，即為參地補(bǔ)腎膠囊抗RIF的潛在作用靶點(diǎn)，并繪制韋恩圖。見(jiàn)圖1。

圖1 疾病與藥物靶點(diǎn)交集韋恩圖

2.3 參地補(bǔ)腎膠囊治療慢性腎衰竭潛在作用靶點(diǎn)的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI) 將“2.2”中得到的121個(gè)潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，物種選擇為Homo sapiens，最低相互作用閾值設(shè)為最高等“Highest confidence(0.9)”，獲得蛋白-蛋白相互作用關(guān)系，得到蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，剔除游離節(jié)點(diǎn)后獲得114個(gè)節(jié)點(diǎn)，586條邊。把獲得的TSV數(shù)據(jù)導(dǎo)入到Cytoscape3.7.2軟件進(jìn)行分析，其中節(jié)點(diǎn)的大小、顏色的深淺變化代表度值(degree)的大小，邊的粗細(xì)反映結(jié)合律評(píng)分(Combined Score)大小，并根據(jù)節(jié)點(diǎn)的度值篩選出核心靶點(diǎn)，見(jiàn)圖2。其中Degree值≥20的有15個(gè)，從大到小分別是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(Signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)、細(xì)胞腫瘤抗原基因(TP53)、AP-1轉(zhuǎn)錄因子亞單位c-jun轉(zhuǎn)錄因子(JUN)、蛋白激酶B(protein kinase B，又名AKT，AKT1為AKT家族蛋白之一)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)、酪氨酸蛋白激酶(SRC)、絲裂原活化蛋白激酶-1(mitogen-activated protein kinase，MAPK1)、MAPK8、白介素6(interleukin6，IL-6)、MAPK14、RELA(核因子κB蛋白-p65)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)、上皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)、AP-1轉(zhuǎn)錄因子亞單位c-FOS轉(zhuǎn)錄因子(FOS)、雌激素受體1(Estrogen receptor 1，ESR1)。提示參地補(bǔ)腎膠囊治療慢性腎衰竭的機(jī)制與上述核心靶點(diǎn)具有密切的聯(lián)系，參地補(bǔ)腎膠囊很有可能通過(guò)作用于這些核心靶點(diǎn)而發(fā)揮其藥理作用的。

圖2 PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 構(gòu)建參地補(bǔ)腎膠囊治療慢性腎衰竭網(wǎng)絡(luò)圖(中藥-潛在活性成分-潛在作用靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖) 將參地補(bǔ)腎膠囊的163個(gè)活性化學(xué)成分與121個(gè)潛在作用靶點(diǎn)輸入Cytoscape軟件，篩除與靶點(diǎn)無(wú)交集的孤立成分，繪制網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖3。使用Network Analyzer對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析顯示，度值表示預(yù)測(cè)出該成分與作用靶點(diǎn)的關(guān)聯(lián)個(gè)數(shù)，度值越大說(shuō)明該成分越重要。圖3中，左邊圓形圖標(biāo)組成的外圍環(huán)代表潛在作用靶點(diǎn)，環(huán)中八邊形圖標(biāo)代表疾病；右邊三角形圖標(biāo)組成的外圍環(huán)代表中藥活性成分，環(huán)中長(zhǎng)方形圖標(biāo)代表中藥名稱。節(jié)點(diǎn)間的連線代表二者的對(duì)應(yīng)關(guān)系，連線越多的成分或靶點(diǎn)，提示該成分或靶點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮越關(guān)鍵的作用，該成分或靶點(diǎn)可能為參地補(bǔ)腎膠囊中抗RIF的關(guān)鍵成分或發(fā)揮作用的主要靶點(diǎn)。通過(guò)網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)槲皮素、木犀草素、山奈酚、丹參酮IIA、β-谷甾醇、黃芩素、β-胡蘿卜素、植物甾醇、蘆薈大黃素、脫水淫羊藿素、隱丹參酮、鞣花酸、D-乳酸、異鼠李素、苦參堿、芝麻素、去甲脫水淫羊藿黃素等度值大于10，其與中藥之間的關(guān)系見(jiàn)表2。

圖3 藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病圖

表2 主要成分-藥物關(guān)系表

在網(wǎng)絡(luò)中，如槲皮素來(lái)源于黃連、草果仁、菟絲子、淫羊藿、紅花，可作用于ADRB2、AKT1、ALOX5、BAX、BCL2、BCL2L1、BIRC5、CASP3等靶點(diǎn)上。而人參、菟絲子、淫羊藿、紅花中的活性成分木犀草素，半夏，紅花，赤芍中的活性成分黃芩素亦可以作用于AKT1靶點(diǎn)上，上述一種成分與多個(gè)靶點(diǎn)作用，多種成分又可共同作用于同一個(gè)靶點(diǎn)的現(xiàn)象體現(xiàn)了參地補(bǔ)腎膠囊多成分、多靶點(diǎn)的綜合調(diào)控特點(diǎn)。

2.5 基因本體(GO)與京都基因與基因組百科全書(shū)(KEGG)通路富集分析 應(yīng)用Metascape數(shù)據(jù)平臺(tái)對(duì)參地補(bǔ)腎膠囊抗RIF的相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG富集分析，借助Origin Lab 2019對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化，得到篩選靠前的20條通路；其中Y軸為通路名稱，X軸分別代表富集在此通路的數(shù)量(Count)及富集顯著性(q-Value)。BP分析結(jié)果顯示，這些靶點(diǎn)主要涉及對(duì)脂多糖的反應(yīng)，細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號(hào)通路，對(duì)無(wú)機(jī)物的反應(yīng)，凋亡信號(hào)通路，活性氧代謝過(guò)程等生物過(guò)程。見(jiàn)圖4。

圖4 BP分析結(jié)果

CC分析結(jié)果顯示，可以看出這些靶點(diǎn)主要涉及細(xì)胞內(nèi)的膜筏，膜微區(qū)，膜區(qū)，小窩，質(zhì)膜筏等。見(jiàn)圖5。

圖5 CC分析結(jié)果

MF分析顯示靶點(diǎn)主要涉及在激酶結(jié)合，細(xì)胞因子受體結(jié)合，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合，轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，蛋白質(zhì)均二聚活性等。見(jiàn)圖6。

圖6 MF分析結(jié)果

KEGG通路富集分析顯示主要是是流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化，癌癥的途徑，乙型肝炎，HIF-1信號(hào)通路，TNF信號(hào)通路等。見(jiàn)圖7。

圖7 KEGG分析結(jié)果

3 討論

CRF是各種原因等導(dǎo)致的腎臟功能不可逆地喪失，臨床出現(xiàn)以代謝產(chǎn)物潴留，水、電解質(zhì)、酸堿平衡失調(diào)，全身各系統(tǒng)受累尤其是心腦血管為主的綜合征。近些年糖尿病、高血壓等基礎(chǔ)疾病已成為導(dǎo)致CRF的主要原因[5]。目前研究表明，雖然RIF和腎小球硬化都可以導(dǎo)致慢性腎臟病(CKD)發(fā)展為CRF，但對(duì)于腎功能的減退程度而言，RIF扮演著更為重要的角色[6]。RIF機(jī)制與細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)沉積、細(xì)胞因子釋放增加，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，上皮到間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)和成纖維細(xì)胞活化等有關(guān)，最終導(dǎo)致纖維化的組織替代失去功能的腎單位[7]。

參地補(bǔ)腎膠囊是國(guó)醫(yī)大師張琪教授根據(jù)多年治療CRF的經(jīng)驗(yàn)，鉚定CRF脾腎兩虛、濕濁內(nèi)蘊(yùn)的病機(jī)特點(diǎn)而擬定，廣泛在臨床上使用且療效頗佳。參地補(bǔ)腎膠囊藥物組成為人參、白術(shù)、茯苓、熟地黃、菟絲子、淫羊藿、大黃、黃連、半夏、草果仁、竹茹、桃仁、紅花、丹參、赤芍。全方藥味主要從補(bǔ)虛、瀉實(shí)與活血方面著手。人參、白術(shù)、茯苓相伍為補(bǔ)氣健脾；菟絲子補(bǔ)腎益精；淫羊藿與熟地黃二藥合用則陰陽(yáng)并補(bǔ)；大黃、黃連、草果仁、竹茹、半夏專為CRF主要的病理產(chǎn)物濕、瘀、毒而設(shè)；桃仁、紅花、丹參和赤芍 4味藥物活血化瘀，溫涼相配，相須為用?？v觀全方，攻補(bǔ)兼施，溫涼并用，標(biāo)本兼顧。多藥協(xié)同起到補(bǔ)腎健脾、化濕濁、解毒活血之功用。

本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法初步篩選參地補(bǔ)腎膠囊治療抗RIF的活性成分。排名前5的是槲皮素、木犀草素、山奈酚、丹參酮IIA、黃芩素；此類化合物廣泛存在于自然界，已有許多學(xué)者對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)研究。研究表明槲皮素可通過(guò)降低TGF-β1水平抑制高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞增殖，并通過(guò)抑制Smad2磷酸化影響TGF-β1/Smads信號(hào)通路的激活，起到抗RIF的作用[8]。張翠等[9]研究表明木犀草素對(duì)腎臟保護(hù)的機(jī)制可能與其抗氧化作用及降低腎組織TGF-β1、PAI-1的蛋白表達(dá)有關(guān)。段斌等[10]研究發(fā)現(xiàn)山奈酚對(duì)高糖條件下人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激及凋亡具有抑制作用。丹參酮IIA磺酸鈉干預(yù)阿霉素腎病大鼠腎損傷的研究發(fā)現(xiàn)，丹參酮IIA磺酸鈉能降低24h尿蛋白定量、改善病理組織損傷、可能與抑制腎組織TGF-β1、PAI-1的表達(dá)有關(guān)[11]。研究顯示β-谷甾醇可通過(guò)抑制TNF-α、NF-κB和TβR1-Smad2/3等信號(hào)通路達(dá)到抗小鼠肝纖維化[12]。黃芩素可抑制糖尿病腎病患者外周血NF-κB活化及降低VEGF、TGF-β1水平，減少尿白蛋白排泄延緩糖尿病腎病進(jìn)展，對(duì)早期糖尿病腎病進(jìn)展延緩明顯[13]。鞣花酸可通過(guò)抗氧化、減少炎癥反應(yīng)和抑制腎小管上皮細(xì)胞凋亡起到抗RIF的作用[14]。異鼠李素預(yù)處理對(duì)大鼠IR損傷導(dǎo)致的急性腎損傷(AKI)有保護(hù)作用，且呈劑量依賴性，其作用機(jī)制可能是抑制了NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的過(guò)度活化及氧化應(yīng)激[15]。

本研究分析獲得參地補(bǔ)腎膠囊與RIF有關(guān)的靶點(diǎn)共有121個(gè)，對(duì)靶點(diǎn)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖分析發(fā)現(xiàn)度值≥20的有15個(gè)，分別為STAT3、TP53、JUN、AKT1、TNF、SRC、MAPK1、MAPK8、IL-6、MAPK14、RELA、VEGFA、EGFR、FOS、ESR1。STAT3是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)家族的成員，并在其中充當(dāng)轉(zhuǎn)錄激活因子，該蛋白通過(guò)響應(yīng)各種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，包括IFN、EGFR、IL6等磷酸化而被激活，可刺激轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)和ECM的分泌，導(dǎo)致ECM在腎間質(zhì)大量沉積促進(jìn)RIF。JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活可上調(diào)FOS、JUN的表達(dá)，形成的轉(zhuǎn)錄因子活化蛋白-1(AP-l)可引起TGF-β的表達(dá)增多，啟動(dòng)RIF的進(jìn)程[16]。TP53、AKT1常見(jiàn)于腎腫瘤中異常表達(dá)。EGFR也稱ErbB-1，是表皮生長(zhǎng)因子受體HER家族成員之一，EGFR是上皮生長(zhǎng)因子(EGF)細(xì)胞增殖和信號(hào)傳導(dǎo)的受體。其突變或過(guò)表達(dá)一般會(huì)引發(fā)腫瘤。有研究顯示其過(guò)度表達(dá)可能導(dǎo)致RIF[17]。腫瘤壞死因子(TNF)作為一種重要的細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)NF-κB通路和MAPK通路引起基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)表達(dá)異常，導(dǎo)致ECM降解紊亂引起RIF；其中RELA作為NF-κB的一種蛋白質(zhì)亞基參與調(diào)節(jié)NF-κB的活性和功能[18]。SRC是酪氨酸蛋白激酶家族的重要成員，缺氧條件下其磷酸化后可調(diào)節(jié)多種與RIF相關(guān)的膜受體信號(hào)通路，如：TGF-β/Smad、STAT3等通路。

本研究發(fā)現(xiàn)參地補(bǔ)腎膠囊抗RIF涉及7條關(guān)鍵信號(hào)通路：流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化、HIF-1信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路血管內(nèi)皮、ErbB信號(hào)通路、Jak-STAT信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路。KEGG結(jié)果顯示流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化通路為顯著性最高的通路，已有研究證實(shí)該通路中相關(guān)的Toll樣受體、NF-κB、MAPK信號(hào)通路等密切參與了RIF的過(guò)程[19]；而心血管疾病(CVD)中尤其是那些涉及全身性炎癥過(guò)程的疾病，例如動(dòng)脈粥樣硬化，是慢性腎臟病(CKD)患者發(fā)病和死亡的主要原因；心肌和血管的重塑會(huì)導(dǎo)致多種心血管并發(fā)癥，例如心肌病，動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)而導(dǎo)致缺血性心臟病，心力衰竭，腦血管和心血管死亡以及CRF的進(jìn)展[20]。缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)作為一種轉(zhuǎn)錄因子，可以通過(guò)與這些基因的啟動(dòng)子區(qū)域中的缺氧反應(yīng)元件結(jié)合，直接調(diào)節(jié)纖維化因子的表達(dá)，激活基因轉(zhuǎn)錄，從而激活成纖維細(xì)胞和ECM沉積導(dǎo)致RIF[21]；HIF-1除了直接激活纖維化因子的轉(zhuǎn)錄外，HIF還可以與多種促纖維化信號(hào)通路(包括TGF-β、Notch、NF-κB和PI3K/Akt通路)發(fā)生串?dāng)_，調(diào)控腎纖維化的過(guò)程[22]。而TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是公認(rèn)的RIF的一個(gè)重要途徑，它通過(guò)刺激MMPs的產(chǎn)生，減少ECM降解的蛋白酶的產(chǎn)生和上調(diào)蛋白酶抑制劑的產(chǎn)生來(lái)誘導(dǎo)ECM[23-24]。HIF又是VEGF通路的主要調(diào)節(jié)因子，現(xiàn)在有許多證據(jù)表明，VEGFR-2是內(nèi)皮細(xì)胞中VEGF驅(qū)動(dòng)反應(yīng)的主要介體，并且被認(rèn)為是生理和病理性血管生成中的關(guān)鍵信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)者；VEGF與VEGFR-2的結(jié)合可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞增殖基因上調(diào)。在腎臟中，VEGF-1主要在腎小球足細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞中表達(dá)，其正常表達(dá)對(duì)于維持完整的腎小球和腎小管毛細(xì)血管內(nèi)皮十分重要[25-26]；研究表明VEGF-1的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致腎小球增大和腎小球膜擴(kuò)張，以及引起RIF[27]。TNF通路中TNF-α可誘導(dǎo)許多基因的激活，其中涉及NF-κB通路和MAPK通路。NF-κB信號(hào)通路是炎癥相關(guān)的經(jīng)典通路，而炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是腎纖維化發(fā)展的驅(qū)動(dòng)力，因?yàn)樗_(kāi)始了纖維化階段。研究表明尿蛋白可激活腎小管上皮細(xì)胞中NF-κB信號(hào)通路，引起炎癥反應(yīng)，引起腎單位損傷[28]。Fuihara CK等[29]在大鼠5/6腎消融模型中，使用PDTC進(jìn)行治療，可在不降低腎小球血壓的情況下大大減輕腎臟損害和炎癥，這表明觀察到的直接決定因素是直接抑制或通過(guò)抗氧化活性抑制NF-κB系統(tǒng)。TNF通路還可調(diào)控MMPs從而干預(yù)ECM的生成過(guò)多和(或)降解受抑，而ECM是導(dǎo)致在腎間質(zhì)的過(guò)度沉積是引起RIF的主要原因之一[30]。JAK/STAT通路是多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的主要信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制。細(xì)胞因子與其同源受體結(jié)合后，STATs被酪氨酸激酶的JAK家族成員激活。一旦激活，它們就會(huì)二聚化并轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核，并調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。Peter Y.Chuang等[31]研究證實(shí)血管緊張素II介導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞中，JAK/STAT途徑的激活可增強(qiáng)TGF-β，膠原IV和纖連蛋白的產(chǎn)生引起ECM過(guò)度沉積引起RIF。ErbB信號(hào)通路上的受體在被EGF，TGF-α等配體激活后，可通過(guò)許多途徑發(fā)出信號(hào)，包括Akt和MAPK途徑，導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖，分化，凋亡參與RIF的進(jìn)展。其中ErbB-1即EGFR，許多臨床前研究表明EGFR可能是腎臟疾病的潛在治療靶標(biāo)，正常表達(dá)于腎小球和腎小管間質(zhì)區(qū)。EGFR其信號(hào)通路的激活與幾種細(xì)胞反應(yīng)的調(diào)節(jié)有關(guān)，包括細(xì)胞增殖，炎癥過(guò)程和細(xì)胞外基質(zhì)調(diào)節(jié)，所有這些都參與腎臟損害的發(fā)生和發(fā)展。實(shí)驗(yàn)研究表明，阻斷EGFR可能是通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥、細(xì)胞增殖達(dá)到抗RIF的作用。ErbB家族其他成員(ErbB2，ErbB3和ErbB4)又可與EGFR發(fā)生串?dāng)_，并將其信號(hào)廣布[32-33]?？梢?jiàn)ErbB信號(hào)通路在RIF的研究前景未來(lái)可期。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)RIF涉及多條通路、多個(gè)靶點(diǎn)；而在這些通路中尤其需要關(guān)注HIF-1信號(hào)通路、TNF通路、JAK/STAT通路和ErbB信號(hào)通路，這幾個(gè)通路中的蛋白和下游蛋白表達(dá)常常是其他通路參與RIF的啟動(dòng)因子或其他通路中的關(guān)鍵因子。參地補(bǔ)腎膠囊的多種成分協(xié)同作用于多條通路，多個(gè)靶點(diǎn)，綜合調(diào)控干預(yù)可能是參地補(bǔ)腎膠囊抗RIF，治療CRF的途徑。