于新祥，高召軍，李 珂，齊永秀

(1山東第一醫(yī)科大學(xué)·山東 濟(jì)南 276000；2泰安市立醫(yī)院·山東 泰安 271016)

舒腦欣滴丸由古方“芎歸湯”發(fā)展而來(lái)，由川芎和當(dāng)歸組成，具有活血化瘀的功效，可用于治療多種心腦血管及精神疾病[1-2]。川芎中含有較多的揮發(fā)油，當(dāng)歸的主要化學(xué)成分為有機(jī)酸、揮發(fā)油及皂苷，而制備的舒腦欣滴丸保留了這兩種藥材中有機(jī)酸及揮發(fā)油；其中阿魏酸具有抗血小板聚集、增強(qiáng)免疫功能的作用[3]；洋川芎內(nèi)酯I及洋川芎內(nèi)酯A對(duì)免疫系統(tǒng)及抗心血管疾病引起的炎癥具調(diào)節(jié)作用[4]；當(dāng)歸及川芎中的共有成分藁本內(nèi)酯具有改善微循環(huán)舒張血管的功效[5]。

由川芎和當(dāng)歸制備而成的舒腦欣滴丸，其化學(xué)成分復(fù)雜，通過(guò)某一成分對(duì)舒腦欣滴丸進(jìn)行質(zhì)量控制有一定的片面性。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC方法建立舒腦欣滴丸指紋圖譜對(duì)舒腦欣滴丸中多個(gè)成分進(jìn)行歸屬和評(píng)價(jià)，同時(shí)進(jìn)行4種成分含量測(cè)定，為舒腦欣滴丸的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料

1.1 試藥與試劑 阿魏酸：上海源葉生物科技有限公司，批號(hào):H27J7L16718,純度≥98%；洋川芎內(nèi)酯I：上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：P02F9F54166,純度≥98%；洋川芎內(nèi)酯A：上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：P10J9F52613,純度≥98%；藁本內(nèi)酯：上海廣銳生物科技有限公司，批號(hào)：G-010-160719,純度≥98%；舒腦欣滴丸：天津中新藥業(yè)，批號(hào)：676014，676018，677008，677019，677030；舒腦欣滴丸：解放軍第88醫(yī)院，批號(hào)：170121，170608，171019，180103，180523。甲醇：賽默飛世爾科技有限公司，色譜純；冰醋酸:天津市凱通化學(xué)試劑有限公司，分析純；純凈水:杭州哇哈哈集團(tuán)有限公司。

1.2 儀器 Waters e2695高效液相色譜儀：美國(guó)Waters公司；2998 PDA Detector紫外檢測(cè)器：美國(guó)Waters公司；FR224CN電子天平：奧豪斯儀器上海有限公司；KQ-250DB數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件和系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 色譜柱：Venuisu MP C18(4.6 mm×250 mm,5μm);流動(dòng)相：甲醇(A)-1.0%冰醋酸(B),梯度洗脫程序如下：0→25 min,30%→45%A;25→40 min,45%→70%A;40→45 min,70%→75%A;45→50 min,75%→75%A。柱溫：30 ℃;流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量：10μL;檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm。在此色譜條件下，計(jì)算理論塔板數(shù)分別為阿魏酸4 293，洋川芎內(nèi)酯I為7 553，洋川芎內(nèi)酯A為12 464，藁本內(nèi)酯為64 043，計(jì)算各色譜峰之間的分離度均大于1.5。將空白溶劑、混合對(duì)照品溶液和供試品溶液的色譜圖進(jìn)行對(duì)比后，其各成分之間無(wú)相互干擾，見(jiàn)圖1。

1.阿魏酸；2.洋川芎內(nèi)酯I; 3.洋川芎內(nèi)酯A; 4.藁本內(nèi)酯

2.2 對(duì)照品儲(chǔ)備溶液的配制 分別精密稱取適量的阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯A及藁本內(nèi)酯，加入70%甲醇使其成濃度分別為100、110、150、200 mg·L-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液，置于4 ℃冰箱進(jìn)行保存，并在使用前稀釋成工作溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取5粒舒腦欣滴丸粉碎，粉碎后置于具塞錐形瓶中，加入10 mL70%的甲醇后稱定重量，在100 MZ的條件下進(jìn)行超聲處理30 min，靜置放冷，再用70%的甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜進(jìn)行過(guò)濾，再取1 mL的續(xù)濾液置于10 mL容量瓶中，用70%的甲醇稀釋至刻度，搖勻，所得即為供試品溶液，置于4 ℃冰箱保存。

2.4 指紋圖譜方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取批號(hào)為171019舒腦欣滴丸按“2.3”項(xiàng)下制備同一供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄色譜圖，通過(guò)計(jì)算可得舒腦欣滴丸色譜圖中各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD均<1.0%,各共有峰的相對(duì)峰面積RSD均<3.0%，即說(shuō)明該方法具有良好的精密度。

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取批號(hào)為171019舒腦欣滴丸的同一供試品溶液5份，在“2.1”項(xiàng)色譜方法下進(jìn)樣，記錄色譜圖，舒腦欣滴丸中共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均<3.0%，表明該方法的重現(xiàn)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取批號(hào)為171019舒腦欣滴丸的同一供試品溶液，分別在0、2、4、8、12 h按“2.1”項(xiàng)色譜方法下進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果表明，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均<1.0%，共有峰的相對(duì)峰面積的RSD均<3.0%，表明樣品在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 指紋圖譜相似性評(píng)價(jià)

取10批舒腦欣滴丸樣品，按照“2.3”項(xiàng)下方法制備10批供試品溶液，照上述色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，將所得數(shù)據(jù)導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)》軟件中，以S1為參照，對(duì)色譜峰進(jìn)行多點(diǎn)校正，Mark峰匹配，以中位數(shù)法建立對(duì)照指紋圖譜R，并進(jìn)行相關(guān)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10批供試品有8個(gè)特征峰，通過(guò)對(duì)照品定位指認(rèn)了4個(gè)色譜峰分別為阿魏酸(1號(hào)峰)、洋川芎內(nèi)酯I(2號(hào)峰)、洋川芎內(nèi)酯A(4號(hào)峰)、藁本內(nèi)酯(5號(hào)峰)，見(jiàn)圖2。其中藁本內(nèi)酯峰面積較大，保留時(shí)間較為居中，并且較為穩(wěn)定，與相鄰色譜峰的分離度良好，便于識(shí)別和評(píng)價(jià)色譜指紋圖譜的特征峰，故選擇藁本內(nèi)酯作為參比峰。對(duì)各批次舒腦欣滴丸進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，10批舒腦欣滴丸指紋圖譜的相似度均>0.9，各特征圖譜與共有特征圖譜R的相似度見(jiàn)表1，計(jì)算各共有峰藁本內(nèi)酯的保留時(shí)間和峰面積。結(jié)果見(jiàn)表2～表3。

表1 指紋圖譜相似度結(jié)果

表2 指紋圖譜共有峰的相對(duì)保留時(shí)間

表3 指紋圖譜共有峰的相對(duì)峰面積

圖2 10批舒腦欣滴丸相似度比較

2.6 多指標(biāo)含量測(cè)定方法學(xué)考察

2.6.1 線性關(guān)系考察 分別精密量取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、3.0 mL,分別置于10 mL容量瓶中，用70%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，制成混合堆照品系列溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣10μL,以峰面積(Y)對(duì)濃度(X,mg·L-1)進(jìn)行回歸分析。阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯的線性方程分別為Y=59501X-27966(R2=0.9997)、Y=49512X+11945(R2=0.9995)、Y=13216X+17612(R2=0.9996)、Y=40216X+3059.3(R2=0.9992)進(jìn)樣量分別在1.0～30μg、1.1～33μg、1.5～45μg、2.0～60μg內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.6.2 精密度 取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量分別稀釋至阿魏酸20 mg·L-1、洋川芎內(nèi)酯I 22 mg·L-1、洋川芎內(nèi)酯A 30 mg·L-1、藁本內(nèi)酯40 mg·L-1在“2.1”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄色譜圖。其峰面積的RSD分別為2.80%、1.29%、2.11%、2.15%；表明該方法精密度良好，符合舒腦欣滴丸4種成分含量測(cè)定要求。

2.6.3 重復(fù)性 取批號(hào)為171019舒腦欣滴丸供試品溶液5份，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，記錄色譜圖。阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯峰面積的RSD值分別為1.62%、2.67%、2.89%、2.49%；表明該含量測(cè)定方法的重復(fù)性良好。

2.6.4 穩(wěn)定性 取批號(hào)為17019舒腦欣滴丸的同一供試品溶液，分別在0、2、4、8、12 h，按“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果顯示阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯的RSD分別在1.26%、0.73%、2.13%、1.51%；表明阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6.5 加樣回收率 取已知各成分含量的供試品溶液3 mL,共9 份，分別加入各對(duì)照品溶液適量，配成低、中、高濃度的混合溶液，每一濃度制備3 份，按“2.1”項(xiàng)色譜方法進(jìn)樣，記錄色譜圖。阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯平均回收率見(jiàn)表4。

表4 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.6.6 樣品含量測(cè)定 分別取3個(gè)不同批次的舒腦欣滴丸按“2.3”項(xiàng)制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜方法進(jìn)樣，樣品含量測(cè)定的結(jié)果如表5。

表5 舒腦欣滴丸中4種成分含量測(cè)定丸)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)首先對(duì)樣品的提取溶劑進(jìn)行考察，選擇50%甲醇、70%甲醇、甲醇三種溶劑進(jìn)行考察，結(jié)果顯示，50%甲醇中阿魏酸的含量較高而洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯含量較低；甲醇中阿魏酸的含量較低而洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯的含量較高，選擇70%甲醇可兼顧兩種成分含量的最大化，故選用70%甲醇作為提取溶劑。

此次試驗(yàn)對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行優(yōu)化，通過(guò)查閱文獻(xiàn)[6-8],對(duì)甲醇-乙酸(0.1%、0.25%、0.5%、1.0%)、甲醇-水進(jìn)行考察，結(jié)果顯示，采用甲醇-水時(shí)阿魏酸的出峰情況不好，加入乙酸能夠改善，經(jīng)試驗(yàn)探究采用甲醇-1.0%乙酸各成分的分離效果最好。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)采用PDA檢測(cè)器進(jìn)行全波段的掃描，發(fā)現(xiàn)280 nm條件下各成分色譜峰型較好，基線平穩(wěn)，無(wú)相互干擾?？疾炝酥鶞卦?0、25、30 ℃分離效果，結(jié)果顯示在30 ℃分離效果較好。

本課題利用建立了舒腦欣滴丸指紋圖譜的測(cè)定方法，同時(shí)測(cè)定了舒腦欣滴丸中阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯的含量，方法靈敏簡(jiǎn)單易行，重復(fù)性好，為舒腦欣滴丸的質(zhì)量控制提供了參考依據(jù)。