孫 妍，王 靜，侯 喆，武天元，王偉明

(1黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院·黑龍江 哈爾濱 150036;2黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)·黑龍江 哈爾濱 150040)

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 100只BALB/c小鼠，SPF級(jí)，體質(zhì)量18～22 g，雌雄各半，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)SCXK(京)2012-0001。

1.2 菌株 肺炎支原體國際標(biāo)準(zhǔn)株(ATCCFH15531)：美國菌株保藏中心。

1.3 藥物及試劑 麥冬飲片：河北安國振宇藥業(yè)有限公司，批號(hào)：130109，經(jīng)鑒定麥冬為四川麥冬Radix Ophiopogonis(Thunb.)Ker-Gawl.的干燥塊根；阿奇霉素分散片(哈藥集團(tuán)制藥六廠，批號(hào)：30130502)；養(yǎng)陰清肺糖漿：北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠，批號(hào)：3150021。TRIzol試劑：美國Invitrogen；One Step SYBR PrimeScript RT-PCR Kit：TaKaRa 公司；MUC5ac引物、β-actin引物：哈爾濱博仕生物技術(shù)有限公司；小鼠黏蛋白5ac(MUC5ac)檢測(cè)試劑盒：USCN Life Science Inc.；PPLO培養(yǎng)基：Becton，Dickinson and Company，USA。試藥均在給藥前研磨成粉，溶解，渦旋混勻。

1.4 主要儀器 DL-CJ-1W生物凈化工作臺(tái)：北京東連哈爾儀器制造有限公司；MDF-382E-80 ℃低溫冰箱：日本三洋公司；Milli-Q Reference system自動(dòng)雙重純水蒸餾器：MILLI-Q公司；SorvaⅡ ST16低溫離心機(jī)：Thermo公司；2、20、200μL微量加樣器：Eppendoff公司；9600熒光定量PCR儀：杭州博日有限公司；Infinite M200 Pro酶標(biāo)儀：Tecan公司。

2 方法

2.1 肺炎支原體培養(yǎng) 將MP菌株按1∶9加入到PPLO完全培養(yǎng)基中，置37 ℃生化培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，每天觀察顏色變化，培養(yǎng)液由紅色變?yōu)辄S色并澄清透明時(shí)即為支原體生長。將處于對(duì)數(shù)生長期的MP進(jìn)行CCU定量，常規(guī)凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 動(dòng)物分組 100只BALB/c小鼠，隨機(jī)分為10組，每組10只。分別為正常對(duì)照組，模型對(duì)照組，阿奇霉素組，養(yǎng)陰清肺組，麥冬多糖高劑量組、中劑量組、低劑量組和麥冬皂苷高劑量組、中劑量組、低劑量組。

2.3 造模、給藥及標(biāo)本采集 除正常對(duì)照組外，其余各組用乙醚麻醉，然后用無菌注射器吸取106CCU/mLMP，滴鼻復(fù)制MP感染模型，20μL，連續(xù)感染3 d；之后各組小鼠開始灌胃給藥，正常組和模型組灌胃等容積生理鹽水，阿奇霉素組給藥5 d(第1天給65 mg/kg，第2～5天給32.5 mg/kg)、養(yǎng)陰清肺組(5 mL/kg)、麥冬多糖高劑量組(81.2 mg/kg)、麥冬多糖中劑量組(40.6 mg/kg)、麥冬多糖低劑量組(20.3 mg/kg)、麥冬皂苷高劑量組(66.8 mg/kg)、麥冬皂苷中劑量組(33.4 mg/kg)、麥冬皂苷低劑量組(16.7 mg/kg)，連續(xù)給藥6 d。頸椎脫臼處死小鼠，肺門處結(jié)扎右主支氣管后向左側(cè)肺內(nèi)注入生理鹽水1mL，反復(fù)抽洗2次，合并灌洗液，3 000r/min，4 ℃離心10 min，收取上清液，-80 ℃凍存?zhèn)溆?；剪取右肺組織中葉，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 觀察指標(biāo)及測(cè)定

2.4.1 Real-time PCR方法檢測(cè)MUC5ac mRNA的表達(dá) 取100 mg組織置于離心管中，加入適量去離子水，用勻漿機(jī)打勻，加入1 mLtrizol(預(yù)冷)提取RNA；以DEPC H2O做空白調(diào)零，混勻樣品在260、280 nm波長下讀數(shù)，OD260/OD280的比值用于估算核酸純度，計(jì)算總RNA濃度，調(diào)整樣品體積。以β肌動(dòng)蛋白(β-actin)為內(nèi)參照，MUC5AC正向引物：5′-ACCACTTTCTCCTTCTCCACAC-3′，反向引物：5′-AACAGGGCTCTTCACAGACAATA-3′；β-actin 正向引物：5′-GACGGCCAGGTCATCACTATTG-3′，反向引物：5′-AGGAAGGCTGGAAAAGAGCC-3′。PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行循環(huán)擴(kuò)增：42 ℃ 5 min,95 ℃ 10 sec,1 cycle；95 ℃ 5 sec,60 ℃ 20 sec,40 cycle；95 ℃0 sec,65 ℃15 sec,95 ℃ 0 sec。采用比較閾值法分析基因表達(dá)的量，直接得到各組小鼠肺組織MUC5ac mRNA對(duì)空白組相對(duì)表達(dá)的量。采用2-ΔΔCt公式，相對(duì)定量的方法進(jìn)行計(jì)算，得出的相對(duì)表達(dá)量。

2.4.2 ELISA檢測(cè)BALF中MUC5ac蛋白的含量 按試劑盒說明書操作。

3 結(jié)果

3.1 麥冬有效部位對(duì)MP感染小鼠肺組織MUC5ac蛋白表達(dá)的影響 見表1。

表1 各組小鼠肺組織MUC5AC mRNA 表的比較

3.2 麥冬有效部位對(duì)MP感染小鼠BALF中 MUC5ac蛋白含量的影響 見表2。

表2 各組小鼠 BALF中 MUC5ac蛋白含量比較

4 討論

正常情況下，氣道黏膜腺體和杯狀細(xì)胞為保持呼吸道黏膜的濕潤時(shí)只分泌少量黏液，當(dāng)某些病因刺激呼吸道時(shí)，氣道黏液分泌量明顯增多，并通過咳嗽和纖毛運(yùn)動(dòng)將其排出，但持續(xù)的黏液分泌增多可導(dǎo)致氣道阻滯、氣流不暢、肺功能進(jìn)行性降低。氣道中的黏液是由不同分泌物混合而成，黏蛋白(muc)是氣道黏液中的重要組成部分，其數(shù)量和性質(zhì)決定氣道黏液的黏度。在已有的21 種黏蛋白中，杯狀細(xì)胞分泌的MUC5ac為氣道中主要的分泌性黏蛋白，MUC5ac的過度表達(dá)是氣道黏液分泌量及黏液黏度增加的主要原因[6]。

肺炎支原體肺炎是由肺炎支原體引起的呼吸道和肺部急性炎癥。2-3d后出現(xiàn)明顯呼吸道癥狀，陣發(fā)性刺激性咳嗽為突出表現(xiàn)，咳少量黏液或黏液膿性痰。由肺炎支原體還可引起支氣管擴(kuò)張[7]，并與支氣管哮喘[8]有較強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性。

本實(shí)驗(yàn)在對(duì)肺組織中MUC5ac基因表達(dá)情況及BALF中MUC5ac含量進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，結(jié)果顯示，小鼠在正常情況下MUC5ac表達(dá)量極少，MP小鼠模型組與正常組相比MUC5ac表達(dá)含量明顯上升，提示MPP可致肺部MUC5ac生成增加，氣道黏液分泌量增多。麥冬多糖組與麥冬皂苷組可明顯降低MP所致小鼠肺組織MUC5ac的表達(dá)，提示麥冬有效部位可通過調(diào)節(jié)MUC5ac的表達(dá)，減少肺組織黏蛋白的分泌，降低氣道黏液分泌量及黏液的粘度，起到祛痰止咳作用。但麥冬有效部位的劑量與MUC5ac的表達(dá)沒有明確的量效關(guān)系，需通過后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行闡明。