楊雅麗，馬玉德，段云燕，陳 徹，王 勇，李海龍

(甘肅中醫(yī)學(xué)藥大學(xué)·甘肅 蘭州 730000)

甘肅地道藥材紅芪為豆科植物多序巖黃芪(Hedysarum polybotrys Hand.-Mazz)的干燥根，是黃芪中的上品，有補(bǔ)氣神藥之譽(yù)，具有補(bǔ)氣固表、利尿排毒、排膿、斂瘡生肌等多種功效。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明紅芪中含有一類低分子黃酮類化合物(flavanoids)[1-2]，作為可終止自由基產(chǎn)生的天然抗氧化劑已在醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域引起了相應(yīng)的關(guān)注[3-5]。課題組前期研究已經(jīng)證實(shí)，采用紅芪總黃酮進(jìn)行干預(yù)，能夠降低離心運(yùn)動后大鼠骨骼肌中的NO、LDH、MDA、ROS的含量，并提高SOD的活性，提示紅芪總黃酮可降低大強(qiáng)度運(yùn)動后引發(fā)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而減輕骨骼肌損傷，可增強(qiáng)大強(qiáng)度離心運(yùn)動大鼠的耐力[6-7]。但是，紅芪總黃酮是否能在基因表達(dá)層面抑制離心運(yùn)動引起的骨骼肌細(xì)胞凋亡尚未見報(bào)道。

本研究以NF-κB信號通路為切入點(diǎn)，通過建立離心力竭運(yùn)動模型，觀察一次性離心力竭運(yùn)動下大鼠骨骼肌細(xì)胞凋亡及NF-κB信號通路相關(guān)分子bcl-2、bax、cyt-c、caspase-3基因和蛋白表達(dá)的變化，觀察離心力竭運(yùn)動對NF-κB信號通路的影響，探討該運(yùn)動方式引起的骨骼肌細(xì)胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制；并用紅芪總黃酮進(jìn)行干預(yù)，從NF-κB 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及細(xì)胞凋亡層面進(jìn)一步探討其抗運(yùn)動疲勞和損傷的分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 藥物與主要試劑 紅芪為甘肅隴西產(chǎn)道地藥材，其總黃酮由本研究室分離和純化，含量經(jīng)測定為32.7%。TRIzol：美國Ambion；反轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量PCR試劑盒：美國Promega；RIPA裂解液和BCA試劑盒：西安晶彩；蛋白酶抑制劑：北京艾德萊；pNF-κB抗體：北京天德悅；Bcl-2、Bax抗體：美國Bioworld；Cyt c、Caspase-3抗體：美國CST；山羊抗兔二抗：美國Affinity；TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒：碧云天；高敏ECL發(fā)光試劑：美國Bio-BAD；其他試劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物 3月齡清潔級健康雄性 Wistar 大鼠24只，體質(zhì)量200～250 g，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動物中心提供，動物許可證號：SCXK(甘)2011-0001。大鼠喂養(yǎng)環(huán)境溫度為17～23 ℃，相對濕度為50%～60%。所有大鼠常規(guī)喂養(yǎng)，分籠飼養(yǎng)，自由飲食，保持12 h光照。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組與給藥處理 大鼠進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練(速度為16 m/min，坡度為-16°，時(shí)間為5～10 min)3 d后，隨機(jī)分為安靜對照組(Control group，CG)、離心運(yùn)動組(Eccentric Group，EG)和離心運(yùn)動聯(lián)合藥物預(yù)處理組(Drug pretreatment Group，DPG),每組8只。離心運(yùn)動前3 d，DPG組大鼠每日定時(shí)給予0.2 mg/kg紅芪總黃酮灌胃，CG組、EG大鼠給予等量生理鹽水灌胃。EG組、DPG組大鼠均采用恒定速度20 m/min，-16°下坡跑臺中做離心運(yùn)動，直至力竭；不能堅(jiān)持運(yùn)動的大鼠休息 2 min后繼續(xù)運(yùn)動，從跑臺拿出呈明顯疲勞狀且無逃避能力時(shí)，判定為離心力竭運(yùn)動完成[8]。各組大鼠在預(yù)設(shè)時(shí)間用7% 水合氯醛按大鼠體質(zhì)量(0.4 mg/100 g)進(jìn)行腹腔注射麻醉，分離腓腸肌，并放入 4 ℃ 預(yù)冷的生理鹽水中清洗，濾紙吸干后錫紙包裹，標(biāo)記后放入液氮中冰凍保存待測。

1.4 觀察指標(biāo)及檢測方法

1.4.1 RT-qPCR實(shí)驗(yàn) 按照Trizol的TaKaRa-RNA定量和反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，提取大鼠骨骼肌細(xì)胞總RNA，內(nèi)參為GAPDH。引物序列為：NF-κB(120bp)上游：5′-TGA GTCCCGCCCCTTCTAAA-3′，下游：5′-CCTGGATCACTTCAATGGCCT-3′；bcl-2(144bp)上游：5′-AACATCGCCCTGTGGATGAC-3′，下游：5′-GGTCTTCAGAGACAGCC AGG AG-3′；bax(102bp)上游：5′-CAGGATGCGTCCACCAAGAA-3′，下游：5′-CGTGTC CACGTCAGCAATCA-3′；caspase-3(128bp)：上游：5′-GGCCTGAAATACC AAGTCA GGAA-3′，下游：5′-CCATGGCTTAGAATCACACACACA-3′；cyt-C(110 bp)上游：5′-GTTGGACAGCCC CGAT-GTTAG-3′，下游：5′-TTGAGAAAGGGAAAGGCAGTGAT G-3′；GAPDH(79 bp)上游：5′-AGGAAATGATGACCTCCTGAACT-3′，下游：5′-TGT TTTTGTAAGTATCTTGGTGCCT-3′。PCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性5 s。退火1 min后采集信號，重復(fù)40次循環(huán)。用2-ΔΔCt方法計(jì)算mRNA的相對表達(dá)量。

1.4.2 Western blotting實(shí)驗(yàn) 取50～100 mg大鼠肌肉組織，加入蛋白抽提劑500(L剪碎勻漿，BCA蛋白定量。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，300 mA恒流轉(zhuǎn)膜，3%BSA封閉。4 ℃孵育一抗pNF-κB(pp65)(1∶1 000)、Bcl-2(1∶1 000)、Bax(1∶1 000)、Caspase-3(1∶1 000)、GAPDH(1∶5 000)過夜。第二天恢復(fù)至室溫30 min，TBST洗膜5次，每次5 min。5%脫脂奶粉配制二抗(1∶8 000)，室溫孵育2 h。TBST洗膜5 min×5次。按照比例配置ECL發(fā)光液，凝膠成像系統(tǒng)成像分析。以NF-κB、Bcl-2、Bax、Caspase-3、Cyt c蛋白條帶與GAPDH條帶之比進(jìn)行分析。結(jié)果用Image Lab Software 5.2分析，然后用GraphPad Prism 8軟件作圖分析。

1.4.3 TUNEL染色 按照試劑盒說明書操作。每張切片隨機(jī)拍攝5 個(gè)視野進(jìn)行陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)，以凋亡陽性細(xì)胞數(shù)所占百分比的平均值作為凋亡指數(shù)(apoptotic index，AI)。

2 結(jié)果

2.1 紅芪總黃酮對離心運(yùn)動大鼠骨骼肌NF-κB、bcl-2、bax、cyt c、caspase-3 mRNA表達(dá)的影響 見表1。RT-qPCR結(jié)果顯示，與CG組比較，EG組和DPG組NF-κB、bax、cyt c、caspase-3 mRNA的表達(dá)均顯著性升高(P<0.05)，bcl-2 mRNA的表達(dá)明顯下降(P<0.05)；與EG組比較，DPG組NF-κB、bax、cyt c、caspase-3 mRNA的表達(dá)均顯著性降低(P<0.05)，bcl-2 的mRNA表達(dá)明顯增高(P<0.05)。

表1 各組大鼠骨骼肌NF-κB、bax、bcl-2、cyt c、caspase-3 mRNA表達(dá)的比較

2.2 紅芪總黃酮對離心運(yùn)動大鼠骨骼肌pNF-κB、Bcl-2、Bax、Cyt c、Caspase-3蛋白表達(dá)的影響 見圖1。Western blotting結(jié)果顯示：與CG組比較，EG組和DPG組NF-κB、Bax的表達(dá)顯著增高(P<0.05)，Bcl-2的表達(dá)顯著降低(P<0.05)，Bcl-2/Bax比值顯著降低(P<0.05)；與EG組比較，DPG組NF-κB、Bax的表達(dá)明顯降低(P<0.05)，Bcl-2的表達(dá)明顯增高(P<0.05)，Bcl-2/Bax比值顯著增高(P<0.05)。與CG組比較，EG組和DPG組Cyt c、Caspase-3的表達(dá)顯著增高(P<0.05)；與EG組比較，DPG組Cyt c、Caspase-3的表達(dá)明顯降低(P<0.05)。

圖1 紅芪總黃酮對離心運(yùn)動大鼠骨骼肌NF-κB、Bcl-2、Bax、Cyt c、Caspase-3蛋白表達(dá)的影響

2.3 紅芪總黃酮對離心運(yùn)動大鼠骨骼肌細(xì)胞凋亡的影響 Tunel染色陽性的凋亡細(xì)胞顯色為棕色，蘇木素染色的細(xì)胞核顯色為藍(lán)色。EG 組有少數(shù)散在的凋亡細(xì)胞，EG 組出現(xiàn)較多的凋亡細(xì)胞，DPG組凋亡細(xì)胞數(shù)量較EG組有所減少。TUNEL 染色后結(jié)果表明，各組大鼠骨骼肌細(xì)胞凋亡指數(shù)分別為：CG組(2.9±0.6)%、EG組(21.6±1.9)%、DPG組(12.5±1.7)%；與CG組比較，EG組、DPG組大鼠骨骼肌細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著升高(P<0.01)；與EG組比較，DPG組大鼠骨骼肌細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著降低(P<0.05)。

3 討論

適度運(yùn)動可以增加機(jī)體的耐力和適應(yīng)能力，達(dá)到強(qiáng)身健體的作用；但如果長時(shí)間超負(fù)荷運(yùn)動，特別是力竭運(yùn)動，勢必會對機(jī)體造成不同程度的損傷。運(yùn)動性骨骼肌微損傷(Exercise-Inducer Muscle micro-Injury，EIMmI)指的是在不習(xí)慣運(yùn)動或者高強(qiáng)度運(yùn)動條件下，引起的肌肉體積變大、肌肉酸痛、肌肉力量變化及關(guān)節(jié)活動度縮小等情況。該運(yùn)動經(jīng)常會導(dǎo)致延遲性肌肉酸情況的發(fā)生[9]。運(yùn)動性骨骼肌損傷除包含骨骼肌組織超微結(jié)構(gòu)異常之外，還包括蛋白水平、基因及分子水平的異常。離心運(yùn)動是致骨骼肌微損傷的主要運(yùn)動方式，研究表明，骨骼肌細(xì)胞損傷過程中，細(xì)胞凋亡發(fā)揮著重要的作用[10-11]。引發(fā)力竭性訓(xùn)練導(dǎo)致肌肉酸痛和運(yùn)動能力降低的主要病理生理機(jī)制可能是骨骼肌細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)采用一次性大強(qiáng)度下坡跑訓(xùn)練方式，建立大鼠骨骼肌損傷模型，研究發(fā)現(xiàn)大鼠在經(jīng)過一次性離心力竭運(yùn)動后，骨骼肌細(xì)胞發(fā)生了細(xì)胞凋亡，其凋亡指數(shù)在運(yùn)動后即刻明顯升高，與正常對照組有顯著的差異，而紅芪總黃酮干預(yù)后凋亡指數(shù)明顯下降，紅芪總黃酮可顯著抑制離心運(yùn)動后的骨骼肌細(xì)胞凋亡。

NF-κB是細(xì)胞核內(nèi)重要核轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞漿中與其抑制因子I-κB結(jié)合，呈非活性狀態(tài)。當(dāng)受到如細(xì)胞因子、內(nèi)毒素、病毒、活性氧自由基、鈣離子載體、紫外線及射線等信號刺激時(shí)活化，進(jìn)入細(xì)胞核與靶基因增強(qiáng)子上的特異性位點(diǎn)結(jié)合，參與應(yīng)激反應(yīng)、炎癥和細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[12]。NF-κB可通過對其下游基因如bcl-2、bax及cyclinD1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控來實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞的增殖分化、凋亡與細(xì)胞周期的控制[13-14]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，一次性離心力竭運(yùn)動后大鼠骨骼肌細(xì)胞NF-κB有效激活，可能參與了力竭運(yùn)動對機(jī)體骨骼肌細(xì)胞凋亡的誘發(fā)。

NF-κB的激活是細(xì)胞凋亡通路的始動因素，對細(xì)胞凋亡產(chǎn)生關(guān)鍵調(diào)節(jié)因素的是Bcl-2家族成員的比例關(guān)系。在Bcl-2家族中最常見基因包括3 種[15]：第一種為促細(xì)胞凋亡基因，以Bax為代表，又被稱為抑癌基因。第二種為抗細(xì)胞凋亡基因，以Bcl-2為主要代表，也被稱為原癌基因。第三種為Bcl-2同源基因，代表基因?yàn)锽ik、Blk、Bad和Bid等，主要發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用。Bax與 Bcl-2形成異源二聚體，使得Bcl-2失去抑制細(xì)胞凋亡活性；Bax還可單獨(dú)形成同源二聚體，從而達(dá)到促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用。Bcl-2/Bax 異源二聚體是引發(fā)細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)的主要因素，這一比值決定了細(xì)胞凋亡與否：比值升高可抑制細(xì)胞凋亡，而比值下降則促進(jìn)細(xì)胞凋亡[15-16]。Bax 還可通過線粒體外膜產(chǎn)生通道，并且誘導(dǎo)線粒體內(nèi)的細(xì)胞色素 C 等進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，能有效激活凋亡相關(guān)蛋白酶 Caspase[17]。在Caspase家族中，Caspase-3是一種主要的凋亡效應(yīng)因子，Caspase-3激活后，可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并影響其他凋亡因子共同誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[18]。本研究結(jié)果顯示，在一次離心力竭運(yùn)動后，EG組和DPG組骨骼肌組織NF-κB、Bax、Cyt c、Caspase-3 mRNA和蛋白的表達(dá)明顯升高，而Bcl-2 mRNA和蛋白的表達(dá)卻顯著減低，證明離心力竭運(yùn)動的確可以造成骨骼肌細(xì)胞凋亡。DPG組與EG組相比，離心力竭運(yùn)動后DPG組骨骼肌組織NF-κB、Bax、Cyt c、Caspase-3 mRNA和蛋白的表達(dá)明顯降低，而Bcl-2 mRN和蛋白的表達(dá)顯著增高。提示：紅芪總黃酮可通過降低離心力竭運(yùn)動大鼠骨骼肌細(xì)胞NF-κB、Bax、Cyt-c、Caspase-3蛋白的表達(dá)，升高Bcl-2蛋白的表達(dá)，抑制離心運(yùn)動后的骨骼肌細(xì)胞凋亡。

綜上所述，一次離心力竭運(yùn)動可激活大鼠骨骼肌細(xì)胞NF-κB信號分子，啟動細(xì)胞的凋亡程序；紅芪總黃酮能夠降低大強(qiáng)度運(yùn)動后氧化應(yīng)激所導(dǎo)致的骨骼肌損傷，其機(jī)制可能與降低骨骼肌組織NF-κB、Bcl-2/Bax、Cyt c、Caspase-3 表達(dá)水平，抑制骨骼肌細(xì)胞凋亡有關(guān)。