張力文，胡 娜，袁 琳，陸 敏，林 敏，鐘霄毓，孫銀強(qiáng)，姜 逸，陸 雄

(上海中醫(yī)藥大學(xué)科技實(shí)驗(yàn)中心·上海 201203)

隨著人們飲食結(jié)構(gòu)和生活方式的改變，代謝綜合征(metabolic syndrome，MS)發(fā)病率近幾年顯著增長(zhǎng)[1]，代謝綜合征的典型癥狀如肥胖、高血壓、高血脂等已被公認(rèn)為糖尿病的危險(xiǎn)因素, 而血糖的升高與胰島素抵抗和胰島分泌功能缺陷相關(guān)[2]。黃連屬多年生草本植物，黃連的有效成分小檗堿具有提高胰島素敏感性、降低血糖等作用[3]。本研究旨在探究黃連對(duì)高脂飲食喂養(yǎng)的肥胖小鼠胰島的保護(hù)作用,分析其對(duì)胰腺組織insulin蛋白表達(dá)的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物 C57BL/6小鼠，6周齡，雄性，體質(zhì)量(18±2)g，購(gòu)自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(滬)2013-0016，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF實(shí)驗(yàn)室。

1.2 藥品與試劑 黃連(產(chǎn)地四川，代碼90010201，批號(hào)：170531)：購(gòu)自上海市浦東新區(qū)養(yǎng)和堂，取黃連15 g黃連水煎濃縮至0.76 g/mL。Anti-INS Antibody(1:50)：BOSTER，BM0080；DAB顯色試劑盒：上海威奧生物科技；葡萄糖注射液：國(guó)藥集團(tuán)；Mouse Insulin ELISA試劑盒：ALPCO，REF:80-INS MSEO1，lot:06956。高脂飼料(D12492)(20%蛋白質(zhì)，20%碳水化合物，60%脂肪)：購(gòu)自Research Diets 公司。

1.3 儀器 YZB/GER314-40羅康全活力型血糖檢測(cè)儀：德國(guó)羅氏診斷公司；血糖試紙：羅氏，批號(hào)：D1682；光學(xué)顯微鏡：Leica；超波切片機(jī)：Leica；全自動(dòng)免疫組化儀：Leica；EG1150H自動(dòng)包埋儀：Leica；ASP200S全自動(dòng)脫水機(jī)：Leica；Autotainer XL自動(dòng)染色機(jī)：Leica；RM2235切片機(jī)：Leica；HI1210烘片機(jī)：Leica；AI顯微圖像分析儀：ZEISS。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 小鼠肥胖模型建立及分組處理 C57BL/6小鼠21只，適應(yīng)性喂養(yǎng)2 周后，隨機(jī)分為正常組7只與高脂組(HF)14只。正常組飼以常規(guī)鼠飼料；高脂組則飼以高脂組飼料，喂養(yǎng)8周，檢測(cè)體質(zhì)量以及空腹血糖(FBG)值。根據(jù)體質(zhì)量、血糖值，將高脂組隨機(jī)分成模型組、黃連組，每組各7只。正常組小鼠和模型組小鼠分別給予常規(guī)鼠飼料和高脂飼料，并同時(shí)給予生理鹽水灌胃，黃連組小鼠在高脂飼料喂養(yǎng)的同時(shí)給予黃連水煎液(3.8 g/kg，70 kg成人等效劑量的2倍)灌胃，每日1次，連續(xù)4 周。

2.2 觀察指標(biāo)

2.2.1 空腹血糖以及血清胰島素(INS)檢測(cè) 末次給藥后小鼠禁食不禁水12小時(shí)，眼球取血，收集血清。采用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血清中葡萄糖(FBG)水平；采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)血清中胰島素水平，檢測(cè)嚴(yán)格按照試劑盒使用說(shuō)明書進(jìn)行。

2.2.2 HE染色觀察小鼠胰腺組織病理學(xué)形態(tài) 采血結(jié)束后處死小鼠取胰腺組織固定于10%甲醛溶液中，過(guò)夜保存。后經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、展片、烘片、脫蠟、染色等步驟，制作胰腺組織 HE 染色切片，封片后光鏡下觀察胰島的形態(tài)變化。

2.2.3 免疫組化染色觀察胰島insulin蛋白表達(dá) 取出胰腺組織石蠟切片，脫蠟，脫蠟結(jié)束后，用PBS(1X)沖洗3 次，每次3 min；3%過(guò)氧化氫甲醇溶液室溫孵育10 min,用PBS沖洗3次，每次3 min;置于Tris-EDTA堿性緩沖溶液中，微波修復(fù)，采用微波爐中火、中低火、低火依次加熱5 min，PBS沖洗3次，每次3 min；每片滴加一抗100μL(一抗稀釋比例為1∶500)，PBS沖洗3次，每次,3 min；滴加二抗，室溫20 min(二抗稀釋比例為1∶200)PBS沖洗3次，每次3 min；DAB顯色，顯色劑A、B、C溶液各50μL 加入1 mL蒸餾水中，混勻。5 min后光鏡下觀察，顯色后流水清洗；蘇木素復(fù)染3 min,流水沖洗將蘇木精沖洗干凈，1%鹽酸酒精分化30 s，70 ℃水藍(lán)化15 min；后依次放入95%乙醇，無(wú)水乙醇，二甲苯各5 s，風(fēng)干后，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察。通過(guò) Image J 軟件測(cè)量各組胰島細(xì)胞陽(yáng)性信號(hào)面積并分析。在每組中隨機(jī)抽取4張切片,每張切片選定4個(gè)明顯的陽(yáng)性信號(hào)輪廓,然后用 Image J軟件側(cè)量其陽(yáng)性信號(hào)的面積。

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠空腹血糖(FBG)、血清胰島素(INS)水平比較 見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠FBG、INS比較

3.2 各組小鼠胰腺形態(tài)學(xué)觀察

正常組小鼠胰腺HE染色可見(jiàn)正常的胰島分布，胰島內(nèi)未見(jiàn)細(xì)胞數(shù)目的增多和毛細(xì)血管擴(kuò)張。和正常組相比，模型組小鼠胰腺HE染色可見(jiàn)胰島數(shù)目增多，體積增大，胰島內(nèi)細(xì)胞數(shù)目增多，胰島內(nèi)毛細(xì)血管明顯擴(kuò)張充血。和模型相比，黃連組胰島數(shù)量減少，體積明顯縮小，未見(jiàn)明顯的毛細(xì)血管擴(kuò)張充血。見(jiàn)圖1。

圖1 各組小鼠胰腺組織HE染色觀察(×100)

3.3 各組小鼠胰島insulin蛋白表達(dá)的免疫組化觀察 免疫組化染色顯示可見(jiàn)模型組胰島素陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量較正常組明顯增多；與模型組相比，黃連組胰島素陽(yáng)性細(xì)胞明顯減少。見(jiàn)圖2，表2。

圖2 各組小鼠胰島insulin蛋白表達(dá)免疫組化染色(×100)

表2 各組小鼠胰島Insulin蛋白表達(dá)免疫組化檢測(cè)結(jié)果比較

4 討論

代謝綜合征(MS)是一系列代謝紊亂聚集發(fā)病的臨床癥候群，包括中心性肥胖、血脂異常、糖尿病或者糖代謝受損、高血壓等[4]。研究表明，MS增加了2型糖尿病和心血管疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，MS可作為兩者發(fā)病的前兆[5]。胰島素抵抗作為代謝綜合征的一個(gè)顯著特征，同時(shí)也是2型糖尿病發(fā)病的重要因素[6]。中藥黃連具有清熱、燥濕和排毒的功能，在治療糖尿病方面自魏晉時(shí)期就有記載?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為，黃連具有抗病原微生物活性、保護(hù)心血管系統(tǒng)、治療糖尿病等藥理作用[7]，其有效成分小檗堿能夠通過(guò)改善葡萄糖代謝[8]、胰島素抵抗和改善胰腺β細(xì)胞以及促進(jìn)胰島素分泌[9]等方面治療糖尿病。

本實(shí)驗(yàn)采用高脂飲食喂養(yǎng)的C57BL/6肥胖小鼠模型作為研究對(duì)象，給予黃連灌胃治療，通過(guò)檢測(cè)正常組、模型組以及用藥組的 FBG、INS的水平，來(lái)評(píng)價(jià)黃連的降糖和改善胰島素抵抗的作用，同時(shí)通過(guò)觀察胰腺病理形態(tài)改變來(lái)探討黃連對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠胰島形態(tài)的保護(hù)作用。光鏡觀察發(fā)現(xiàn)黃連組小鼠的胰島數(shù)量減少，體積縮??；表明黃連對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠胰島形態(tài)具有一定保護(hù)作用。免疫組化結(jié)果顯示黃連組胰島中Insulin陽(yáng)性信號(hào)明顯降低。空腹血糖及血清胰島素水平結(jié)果也提示，與模型組相比，黃連組有效降低高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠的血糖和胰島素水平。

綜上所述，本研究通過(guò)空腹血糖、血清胰島素、胰島HE染色及免疫組化方法觀察了黃連對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠的治療作用, 證明黃連能夠降低血糖、改善胰島素抵抗，對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠胰島具有一定的保護(hù)作用，對(duì)未來(lái)糖尿病預(yù)防與治療有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。