余 平，谷麗麗，李 欽，葛淑瑜，樓婷婷

(1浙江省立同德醫(yī)院·浙江 杭州 310012；2杭州醫(yī)學(xué)院·浙江 杭州 310013)

近年來隨著中藥新劑型不斷發(fā)展，除傳統(tǒng)飲片煎劑外，還出現(xiàn)了中藥配方顆粒等新劑型。中藥配方顆粒是用符合炮制規(guī)范的單味中藥飲片為原料，利用現(xiàn)代化的生產(chǎn)工藝和技術(shù)，將單味飲片的全成分經(jīng)提取、濃縮、干燥、制粒、包裝而成，統(tǒng)一規(guī)格、劑量，用于中醫(yī)臨床調(diào)劑使用的新型劑型。與傳統(tǒng)飲片相比較，中藥配方顆粒具有使用方便、衛(wèi)生、調(diào)劑準(zhǔn)確、安全有效且易于攜帶等眾多優(yōu)點，但是配方顆粒作為一種中藥新劑型，其藥效與傳統(tǒng)飲片煎劑是否存在差異，是配方顆粒能否被社會接受的關(guān)鍵[1-2]。加強(qiáng)對有確切療效的經(jīng)典方劑的中藥配方顆粒與飲片煎劑的等效性研究[3-4]，對推進(jìn)中藥配方顆粒的臨床應(yīng)用，具有理論與實際意義。

四逆湯是漢代張仲景《傷寒論》中用于治療少陰虛寒證的主方，由附子、干姜、炙甘草組成。具有溫中祛寒、回陽救逆之效[5]，臨床應(yīng)用廣泛，現(xiàn)代臨床研究顯示四逆湯對改善心肌缺血再灌注造成的損傷、治療心力衰竭、對抗急性缺血性心肌梗死、增強(qiáng)心肌收縮力以及治療冠心病、心絞痛方面具有良好的療效[6]。本文通過心肌細(xì)胞缺氧損傷模型和大鼠離體心臟缺血再灌注(I/R)模型比較四逆湯配方顆粒與飲片煎劑之間藥效學(xué)方面的一致性。

1 材料

1.1 實驗藥物 四逆湯傳統(tǒng)飲片煎劑(附子∶干姜∶炙甘草=3∶2∶3)，濃度以附子飲片量計，每毫升含3 g附子飲片量，由浙江景岳堂藥業(yè)有限公司制備提供；四逆湯配方顆粒由浙江景岳堂藥業(yè)有限公司提供產(chǎn)品，附子顆粒劑1 g相當(dāng)于附子飲片6 g，干姜顆粒劑1 g相當(dāng)于干姜飲片6 g，炙甘草顆粒劑1 g相當(dāng)于甘草飲片3 g。顆粒劑組方按照飲片藥量比例換算，即附子∶干姜∶炙甘草=1.5∶1∶3。取附子顆粒劑1.5 g，干姜顆粒劑1 g，炙甘草顆粒劑3 g(相當(dāng)于附子飲片9 g、干姜6 g、炙甘草9 g)，溶解于45 mL蒸餾水，濃度以附子飲片量計，即為本實驗中顆粒組母液200 g·L-1。

細(xì)胞實驗時，配方顆粒母液和飲片煎劑經(jīng)0.22 μm膜過濾除菌，臨用時采用細(xì)胞培養(yǎng)基分別稀釋成濃度1.25、2.5、5.0、10.0 g·L-1。大鼠離體心臟缺血再灌注實驗時，四逆湯配方顆粒和飲片用Ringer-Locke液配成0.5、2.0、4.0 g·L-1含藥灌流液。

1.2 細(xì)胞與動物 大鼠乳鼠心肌細(xì)胞株(H9c2)購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。將H9c2細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液中，在37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。SPF級SD大鼠80只，雌雄兼用，體質(zhì)量(250±50)g，均由浙江省實驗動物中心提供，許可證號SCXK(浙)2014-0001。常規(guī)顆粒飼料喂養(yǎng)，自由飲水，12 h晝夜節(jié)律。

1.3 主要試劑 胎牛血清：杭州四季青公司，批號：19110501；DMEM高糖培養(yǎng)基：美國Hyclone公司，批號：AE29449068；MTT[3-(4，5-二甲基-2-噻唑)-2，5-四氮唑溴鹽]、二甲基亞砜(DMSO)、活性氧(ROS)、乳酸脫氫酶(LDH)和脂質(zhì)過氧化(MDA)試劑盒：上海碧云天生物公司，批號分別為：ST316、ST038、S0033、C0016和S0131；過氧化氫(H2O2)(3%)：廣東恒建制藥有限公司。批號：181002

1.4 實驗儀器 3111型CO2培養(yǎng)箱：美國Thermo 公司；SW-CJ-1F型超凈工作臺：蘇凈安泰公司；AEL-200電子天平：日本島津公司；Microfuge16離心機(jī)：美國貝克曼公司；Synergy-2 SLFPA全波長多功能酶標(biāo)儀：美國伯騰公司；DMI3000B熒光倒置顯微鏡：Leica公司；ZH-LGF離體心臟灌流裝置：淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司；SC-15數(shù)控超級恒溫槽：寧波天恒儀器廠；MP150十六道生理記錄儀：美國 BIOPAC公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞存活率檢測 MTT法。以DMEM高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)H9c2細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104個/mL，100 μL/孔接種于96孔板中，每組設(shè)6個復(fù)孔，設(shè)調(diào)零孔(只加入等量培養(yǎng)基，不含細(xì)胞)，并按如下分組：1)空白對照組，1.25、2.5、5.0、10.0 g·L-1四逆湯配方顆粒和飲片煎劑組，作用24 h。2)正常對照組、H2O2組(模型組)，配方顆粒組(H2O2與配方顆粒2.5、5.0、10.0 g·L-1共處理)、飲片煎劑組(H2O2與飲片煎劑2.5、5.0、10.0 g·L-1共處理)，除正常組外，其余組均采用250 μmol·L-1H2O2作用3 h。配方顆粒組和飲片煎劑組加入含藥物培養(yǎng)基100 μL預(yù)處理24 h，再加入H2O2。其后，每孔加入MTT(5 g·L-1)20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸棄上清，每孔加入150 μL DMSO，于酶標(biāo)儀490 nm測定吸光度(A)值，計算細(xì)胞存活率和半數(shù)抑制濃度(IC50)。存活率(%)=(A樣品-A空白)/(A對照-A空白)×100。

2.2 細(xì)胞內(nèi)ROS和MDA水平檢測 調(diào)整H9c2細(xì)胞密度為5×105個/mL，2 mL/孔接種于6孔板中，設(shè)立正常對照組、H2O2組、H2O2與四逆湯配方顆粒2.5、5.0 g·L-1共處理組，H2O2與飲片煎劑2.5、5.0 g·L-1共處理組。藥物處理完畢后，按ROS試劑盒說明操作，每孔加入1 mL 無血清培養(yǎng)液稀釋的DCFH-DA。37 oC細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，之后洗滌細(xì)胞3次，采用熒光顯微鏡觀察，拍照,每組選取3張熒光圖片，采用Image J軟件分析計算熒光強(qiáng)度值。另按上述分組，藥物處理完畢之后裂解細(xì)胞，離心按MDA試劑盒說明操作并計算MDA含量。

2.3 細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH釋放檢測 調(diào)整H9c2細(xì)胞密度為5×104個/mL，100 μL/孔接種于96孔板中，設(shè)立背景空白組、正常對照組、LDH最大釋放組、H2O2組，H2O2與四逆湯配方顆粒2.5、5.0 g·L-1共處理組，H2O2與飲片煎劑2.5、5.0 g·L-1共處理組。收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液，按LDH試劑盒說明操作，LDH釋放率(%)=(A藥物處理-A正常對照孔)/(A細(xì)胞最大酶活性-A正常對照孔)×100。

2.4 大鼠離體心臟缺血再灌注損傷保護(hù)作用實驗 SD大鼠隨機(jī)分為正常對照組、I/R組、四逆湯配方顆粒和飲片煎劑0.5、2.0、4.0 g·L-1劑量組，每組10只。離體大鼠心肌I/R模型的制備參考文獻(xiàn)[7]。10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠，迅速將心臟固定于Langendorff離體心臟灌流裝置上，用95%O2與5%CO2的飽和Ringer-Locke液進(jìn)行灌流，灌流液溫度維持在(37.0±0.5)℃。將一球囊導(dǎo)管經(jīng)房室瓣插入左心室，通過張力換能器連接生物信號采集處理系統(tǒng)。心臟穩(wěn)定30 min，待心率及心肌收縮力恢復(fù)正常，調(diào)節(jié)冠脈流量約為10 mL/min；停灌30 min，然后各給藥組在停灌后加入不同濃度(0.5、2.0、4.0 g·L-1)的含藥灌注液，并持續(xù)整個再灌注過程；除正常對照組外，所有離體心臟均停灌30 min，再灌注30 min造成缺血再灌注損傷模型。通過系統(tǒng)軟件記錄左心室舒張末壓(LVEDP)、心率(HR)和室內(nèi)壓最大上升速率(+dp/dtmax)及室內(nèi)壓最大下降速率(-dp/dtmax)，觀察記錄給藥前及給藥后各值變化情況。

3 結(jié)果

3.1 四逆湯配方顆粒及其傳統(tǒng)飲片煎劑對正常H9c2細(xì)胞存活率的影響 將H9c2細(xì)胞分別于1.25、2.5、5.0和10.0 g·L-1四逆湯配方顆粒及其傳統(tǒng)飲片煎劑培養(yǎng)24 h，與正常組相比，2.5、5.0、10.0 g·L-1四逆湯配方顆粒及其傳統(tǒng)飲片煎劑均具有促進(jìn)細(xì)胞增殖作用(P<0.01，P<0.05)，故采用2.5、5.0、1.0 g·L-1四逆湯配方顆粒和飲片煎劑進(jìn)行下一步研究。2.5、5.0 g·L-1四逆湯飲片煎劑促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖作用優(yōu)于顆粒劑，但二者無統(tǒng)計學(xué)差異。見表1。

表1 四逆湯配方顆粒和飲片對正常H9c2細(xì)胞存活率的影響

3.2 四逆湯配方顆粒及其傳統(tǒng)飲片煎劑對氧化損傷H9c2細(xì)胞存活率的影響 將2.5、5.0、10.0 g· L-1四逆湯配方顆粒和傳統(tǒng)飲片煎劑分別預(yù)處理H9c2細(xì)胞24 h，再進(jìn)行250 μmol· L-1H2O2作用3 h，模型組細(xì)胞細(xì)胞存活率明顯降低(P<0.01)，四逆湯配方顆粒2.5、5.0、10.0 g·L-1和飲片煎劑2.5、5.0 g·L-1組較之模型組細(xì)胞存活率均顯著提高(P<0.01，P<0.05)。四逆湯配方顆粒效果略高于飲片煎劑組。但兩組間無統(tǒng)計學(xué)差異。由于飲片煎劑10 g·L-1預(yù)處理較之正常組細(xì)胞存活率下降(P<0.05)，且與H2O2組無差異，故后續(xù)指標(biāo)檢測僅采用2.5、5.0 g·L-1兩個劑量。見表2。

表2 四逆湯配方顆粒和飲片對H2O2誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞存活率的影響

3.3 四逆湯配方顆粒及其傳統(tǒng)飲片煎劑對氧化損傷H9c2細(xì)胞ROS水平的影響 本實驗采用熒光探針DCFH-DA進(jìn)行ROS檢測，細(xì)胞內(nèi)的ROS可以氧化無熒光的DCFH生成有熒光的DCF，見圖1和表3。當(dāng)H2O2處理后，細(xì)胞內(nèi)DCF熒光增強(qiáng)，即ROS水平明顯高于正常對照組(P<0.01)，而2.5、5.0 g·L-1四逆湯顆粒劑和飲片煎劑預(yù)處理后均可抑制H2O2引起ROS水平的升高(P<0.01)，但相同濃度下兩組間無統(tǒng)計學(xué)差異。

圖1 四逆湯配方顆粒和飲片對H2O2誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響(×200)

3.4 四逆湯配方顆粒及其傳統(tǒng)飲片煎劑對氧化損傷H9c2細(xì)胞LDH釋放和MDA含量的影響

細(xì)胞凋亡或壞死而造成的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破壞會導(dǎo)致細(xì)胞漿內(nèi)的LDH酶釋放到培養(yǎng)液里，將正常組的LDH釋放率視為0%。如表3所示，當(dāng)H2O2處理后，細(xì)胞LDH釋放率達(dá)(40.0±1.8)%，而四逆湯顆粒劑和飲片煎劑干預(yù)后，LDH釋放率降低，較之模型組均有顯著性差異(P<0.01)，四逆湯顆粒劑與飲片煎劑各組對于減少LDH釋放無明顯差別。正常組MDA含量達(dá)(2.28±0.75)μmol·g-1，當(dāng)H2O2處理后，細(xì)胞內(nèi)MDA含量升高至(9.81±1.38)μmol·g-1，而四逆湯顆粒劑和飲片煎劑干預(yù)后，MDA水平均出現(xiàn)下降(P<0.01)，兩組間無明顯差別。

表3 四逆湯配方顆粒和飲片對H2O2誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞LDH釋放和MDA含量的影響

3.5 四逆湯配方顆粒及其傳統(tǒng)飲片對大鼠離體心臟I/R損傷保護(hù)作用比較 見圖2。

圖2 四逆湯配方顆粒及其傳統(tǒng)飲片對大鼠離體心臟血流動力學(xué)指標(biāo)的影響

如圖2A所示，大鼠離體心臟停灌30 min后再灌注可致HR減慢，復(fù)灌后I/R組HR與空白組比較有顯著性差異(P<0.05)。四逆湯配方顆粒及傳統(tǒng)飲片各劑量組與I/R組比較，均能促進(jìn)復(fù)灌后HR的恢復(fù)，而同劑量配方顆粒和飲片各組間均無顯著性差異。如圖2B所示，離體心臟停灌30 min后再灌注，I/R組LVEDP較之正常組顯著增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；四逆湯配方顆粒及四逆湯傳統(tǒng)飲片各劑量組與I/R組比較，均能促進(jìn)復(fù)灌后LVEDP的恢復(fù)，同劑量配方顆粒和飲片各組間均無顯著性差異。如圖2C和D所示,大鼠離體心臟停灌30 min后再灌注，與空白組比較，I/R組±dp/dtmax下降，可見再灌注引起心肌細(xì)胞收縮能力的減弱。四逆湯顆粒及飲片各劑量組均能促進(jìn)±dp/dtmax恢復(fù)，提示配方顆粒和飲片各組改善 I/R 過程心肌收縮能力及心肌順應(yīng)性，同劑量組間均無顯著性差異。

4 討論

《傷寒論》傳承至今，四逆湯作為其中的經(jīng)典名方，由附子、干姜、炙甘草組成，具有溫中祛寒，回陽救逆之功效，研究表明，四逆湯具有強(qiáng)心升壓、保護(hù)缺血心肌等作用，常用于治療多種心血管疾病，如冠心病、心力衰竭、心律失常等，均取得了較好的臨床效果[8]。然而，不同制劑工藝對四逆湯藥效的影響，尤其是中藥配方顆粒與傳統(tǒng)煎劑之間的療效的等效性方面仍有待研究。本實驗以藥理效應(yīng)為指標(biāo)進(jìn)行藥效學(xué)等效性研究。

H9c2細(xì)胞來源于胚胎期BD1X大鼠心臟組織的亞克隆細(xì)胞系，由于來源于心臟，常用于心肌疾病的研究。氧化應(yīng)激是體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞炎性浸潤，蛋白酶分泌增加，產(chǎn)生大量自由基；其中應(yīng)用最廣泛的是H2O2氧化損傷模型[9]，H2O2極易透過細(xì)胞膜，與細(xì)胞內(nèi)鐵離子通過FENTON反應(yīng)形成高活性的自由基，導(dǎo)致一系列反應(yīng)。本實驗首先觀察不同劑量下四逆湯配方顆粒或其傳統(tǒng)飲片煎劑對正常心肌細(xì)胞存活率的影響，發(fā)現(xiàn)四逆湯配方顆?；蚱鋫鹘y(tǒng)飲片煎劑在2.5、5.0、10.0 g·L-1劑量下對正常心肌細(xì)胞生長沒有抑制作用，并且可明顯促進(jìn)細(xì)胞增殖，故將這3個劑量用于后續(xù)抗氧化損傷比較實驗。H2O2誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷實驗結(jié)果顯示2.5、5.0、10.0 g·L-1四逆湯配方顆粒預(yù)處理后均提高H2O2引起的心肌細(xì)胞存活率下降，同2.5、5.0 g·L-1飲片煎劑作用的結(jié)果，且同劑量下組間無統(tǒng)計學(xué)差異；另外飲片煎劑10.0 g·L-1預(yù)處理較之模型組無統(tǒng)計學(xué)差異，推測從本試驗條件下飲片煎劑濃度大于10.0 g·L-1對抗氧化損傷作用效果減弱。LDH釋放率是評價細(xì)胞膜損傷的關(guān)鍵因素，而ROS和MDA含量常作為分析氧化損傷的關(guān)鍵指標(biāo)[10-11]。與模型組相比，在2.5、5.0 g·L-1劑量下四逆湯配方顆粒和飲片煎劑均降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平，減少MDA含量以及LDH釋放率，同劑量下兩者之間亦無統(tǒng)計學(xué)差異。

I/R損傷是急性心肌梗死后各種心肌再灌注治療常見的病理生理改變，常影響再灌注治療的效果，使心功能改善不明顯，甚至出現(xiàn)心律失常、心肌能量代謝障礙、心肌頓抑等嚴(yán)重并發(fā)癥。心功能是反應(yīng)缺血再灌注損傷嚴(yán)重程度的指標(biāo)，包含HR、LVEDP、dp/dtmax、dp/dtmin。HR能夠反應(yīng)心臟的整體功能。LVEDP能夠反映舒張期左室內(nèi)壓變化；+dp/dtmax反映心肌收縮程度，是心室收縮功能的最敏感指標(biāo)。-dp/dtmin反映心肌舒張功能，二者是評價心肌收縮性能和舒張性能的敏感指標(biāo)[12-13]。本實驗結(jié)果表明：0.5、2.0、4.0 g·L-1劑量下四逆湯配方顆粒和傳統(tǒng)飲片均可改善I/R所致的LVEDP、HR和±dp/dtmax下降，在一定程度上能促進(jìn)心率恢復(fù)，減輕心肌收縮和舒張功能障礙。提示四逆湯配方顆粒及傳統(tǒng)飲片處理后對心肌缺血再灌注后的損傷有一定的保護(hù)作用，兩者之間無統(tǒng)計學(xué)差異。

綜上所述，相同劑量下四逆湯配方顆粒及其傳統(tǒng)飲片煎劑均可以提高心肌細(xì)胞抗氧化能力，對抗H2O2活性氧自由基對心肌細(xì)胞的損傷以及改善心肌缺血再灌注損傷。兩種劑型在本實驗中初步表明藥效學(xué)效果無明顯差異，四逆湯配方顆粒劑使用較飲片煎劑更為便捷、衛(wèi)生, 臨床應(yīng)用推廣價值高。本項目組下一步將從藥物化學(xué)成分含量，生物利用度等角度，以進(jìn)一步考察四逆湯配方顆粒及其傳統(tǒng)飲片的等效性，為顆粒劑替代飲片在臨床應(yīng)用提供依據(jù)。