陸 飛，史維俊，溫賀新，吳華彰，劉牧林

（1.蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院胃腸外科；2.蚌埠醫(yī)學院生命科學學院 癌癥轉(zhuǎn)化醫(yī)學安徽省重點實驗室，安徽 蚌埠 233030）

結(jié)直腸癌是全球第2 大致死癌癥和第3 大常見惡性腫瘤。2018年，結(jié)直腸癌新增病例180萬，報告死亡病例88.1萬人，占全球新增癌癥病例和死亡人數(shù)的近10%［1］。盡管在治療上有顯著改善，但晚期患者死亡率仍然較高［2］，局部復發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移是結(jié)直腸癌患者死亡的主要原因［3］。因此，研究結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展及預后相關(guān)機制及探索新的關(guān)鍵分子可以改善結(jié)直腸癌的預防、診斷和治療。

與正常細胞相比，在不同氧濃度下，癌細胞將攝取更多的葡萄糖，大部分葡萄糖被分解成乳酸，這種現(xiàn)象被稱作為“Warburg effect”或稱“有氧糖酵解”［4］。癌細胞代謝需要更多的葡萄糖，相比正常細胞卻產(chǎn)生了較少的ATP，抑制癌細胞有氧糖酵解成為治療癌癥的一種新策略。癌細胞有許多特性，包括高增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和生存［5］，與這些特性相關(guān)的癌癥信號通路可能會被“Warburg effect”增強［6］。例如，PGAM1 受miR3614-5p 調(diào)控，通過激活轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）信號通路，在非小細胞肺癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮癌基因的作用［7］。

Glypican-1（GPC1）是磷脂酰肌醇家族（GPC1-6）的成員，也是一種硫酸乙酰肝素糖蛋白，通過與糖基磷脂酰醇的C 末端結(jié)合而錨定在細胞外膜上［8］。其在診斷早期胰腺癌中的特異性和敏感性達到100%，表明它是理想的胰腺癌早期標志物，且有研究表明它在其他類型的腫瘤中表達上調(diào)［9-11］。本研究通過TCGA數(shù)據(jù)庫，利用GSEA富集糖酵解相關(guān)通路，獲得GPC1在COAD中的表達信息及與臨床數(shù)據(jù)的相關(guān)性，并應用R 軟件分析GPC1 與結(jié)直腸癌臨床進展的相關(guān)性及其對患者生存預后的影響。最后進一步通過KEGG通路富集，研究GPC1在調(diào)控結(jié)直腸癌中的機制，為研究結(jié)直腸癌分子機制提供新思路。

1 材料與方法

1.1 基 因 芯 片 數(shù) 據(jù)從 TCGA（https：//cancergenome.nih.gov）數(shù)據(jù)庫中下載完整的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和臨床病理信息數(shù)據(jù)［12］，其中有473 個結(jié)腸腺癌（Colon adenocarcinoma，COAD）樣本和41 個相鄰的非癌組織樣本。

1.2 糖酵解相關(guān)通路基因富集及識別差異基因利用Perl 軟件提取TCGA 數(shù)據(jù)庫中的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，下載安裝GSEA（http：//software.broad-institute.org/gsea）。通過GSEA 軟件進行糖酵解相關(guān)通路富集，將富集得到的基因通過R 軟件的limma 包篩選出糖酵解相關(guān)差異表達基因［13］。

1.3 差異表達基因的生存分析及生存與臨床病理信息的相關(guān)性分析從TCGA 數(shù)據(jù)庫中提取相應的臨床病理信息，包括年齡、性別、生存狀態(tài)、生存時間、臨床病理分期等。除去臨床信息缺失的患者，利用單因素Cox 回歸分析差異基因與COAD 患者總體生存相關(guān)的糖酵解相關(guān)基因，進一步利用多因素Cox 回歸分析進行篩選。然后依據(jù)多因素Cox 回歸分析得到的回歸系數(shù)加權(quán)，通過風險評分中位值將COAD 患者分為低風險組和高風險組。通過Kaplan-Meier 曲線分析高低風險組的預后，且對數(shù)秩檢驗評估差異。最后進行生存與臨床病理信息的相關(guān)性分析［14］。

1.4 預后相關(guān)基因的獨立預后分析及驗證通過Perl 軟件將預后相關(guān)基因與臨床病理信息進行整合，再利用R 軟件進行單因素及多因素Cox 回歸分析并對結(jié)果做森林圖。將TCGA 轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)重新分組，形成內(nèi)部驗證集，驗證預后相關(guān)基因的可靠性。

1.5 預后相關(guān)基因與臨床病理信息的相關(guān)性分析通過Perl 軟件將預后相關(guān)基因表達數(shù)據(jù)與COAD 患者的年齡、性別、病理分級、TNM 分期及生存時間整合。并進一步利用R軟件對臨床病理特征進行Wilcox 秩和檢驗并作箱式圖［15］。

1.6 目標基因臨床病理特征的獨立預后分析通過Perl 軟件將目標基因與臨床病理信息進行整合，再利用R 軟件進行單因素及多因素Cox 回歸分析并對結(jié)果做森林圖。

1.7 目標基因的KEGG 富集分析通過Perl 軟件將TCGA 轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)組按照目標基因表達量分為高低兩組，通過GSEA 軟件進行KEGG 主要癌癥信號通路富集分析，結(jié)果利用R軟件進行可視化。

1.8 目標基因與潛在靶基因的相關(guān)性分析通過Perl軟件獲取目標基因相關(guān)信號通路分子的表達數(shù)據(jù)［16］，然后通過R軟件分析目標基因與其的相關(guān)性。結(jié)果以線性相關(guān)系數(shù)（R）及P 值表示，0.1≤|R|≤1 時表示目標基因與潛在靶基因具有相關(guān)性。

1.9 統(tǒng)計學處理本研究所有統(tǒng)計分析皆使用R 4.0.1（www.r-project.org）［17］，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 篩選差異基因通過Perl 軟件提取TCGA 數(shù)據(jù)庫中的473 例COAD 患者樣本基因表達量，并利用GSEA 軟件進行5 個糖酵解相關(guān)通路富集（表1），其中HALLMARK_GLYCOLYSIS 和REACTOME_GLYCOLYSIS 通路有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖1A和圖1B），基因集中共含294 個基因（圖1C），其中256 個基因差異表達（FDR＜0.05，|log2FC|＞0），145個基因表達上調(diào)和111 個基因下調(diào)（圖1D）。以上結(jié)果說明大多數(shù)糖酵解相關(guān)基因在COAD組織中表達差異。

表1 在473例COAD樣本中糖酵解相關(guān)通路富集的基因集

圖1 TCGA數(shù)據(jù)庫中糖酵解相關(guān)基因在COAD的差異表達分析

2.2 篩選預后相關(guān)基因及驗證利用單因素及多因素Cox 回歸分析（P＜0.05，|log2FC|＞0），篩選出基 因ANKZF1、ENO3、G6PC2、GPC1、PPARGC1 和STC2 與患者預后相關(guān)，依據(jù)6 個預后相關(guān)基因構(gòu)建風險評分系統(tǒng)，并進行Kaplan-Meier 檢驗（P＜0.001）（圖2A）及ROC 曲線（圖2B）驗證其準確性（AUC=0.712）；獨立預后分析結(jié)果顯示6 個預后相關(guān)基因構(gòu)建的風險評分系統(tǒng)可以作為影響患者預后的獨立因素（P＜0.001）（圖2C 和圖2D）；生存與臨床病理信息相關(guān)性分析結(jié)果顯示，患者的性別與預后無相關(guān)性（圖2C 和圖2D），進而通過性別分組驗證評分系統(tǒng)的準確性。通過將患者的基因表達量依照性別分成2 組構(gòu)建驗證集，結(jié)果顯示男性組低風險組患者預后好于高風險組（P＜0.001）（圖2E），女性組低風險組患者預后好于高風險組（P=0.027）（圖2F）。以上結(jié)果說明ANKZF1、ENO3、G6PC2、GPC1、PPARGC1 和STC2 與患者預后相關(guān)，且與驗證結(jié)果一致。

圖2 預后相關(guān)基因的篩選及驗證

2.3 預后相關(guān)基因與臨床病理信息相關(guān)性分析預后相關(guān)基因與臨床病理信息相關(guān)性分析結(jié)果顯示（表2），GPC1 與患者（TCGA 數(shù)據(jù)庫來源，除去部分信息缺失的患者）的腫瘤分級、TNM 分期均具有相關(guān)性（P 均＜0.05）。推測GPC1 可能是參與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵糖酵解相關(guān)基因。

表2 預后相關(guān)基因的生存分析及臨床病理特征相關(guān)性

2.4 基因GPC1 在結(jié)直腸癌中差異表達情況進一步研究基因GPC1在TCGA數(shù)據(jù)庫中的表達，分析發(fā)現(xiàn)GPC1 在COAD 組織中高表達（P=1.216e?05）（圖3A）；分析GPC1 在TCGA 數(shù)據(jù)庫中82 例（41 例癌組織，41 例癌旁組織）配對COAD 癌組織及癌旁組織中的表達，發(fā)現(xiàn)GPC1在COAD癌組織中也顯著的高表達（P=1.792e?05）（圖3B）。推測GPC1 可能參與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展。

圖3 GPC1在COAD中的表達差異分析

2.5 基因GPC1 與臨床病理信息的相關(guān)性分析基因GPC1 與臨床病理信息相關(guān)性分析結(jié)果顯示，GPC1與腫瘤分級和N分期具有極顯著相關(guān)性（圖4C和圖4E），與T 分期、M 分期具有顯著相關(guān)性（圖4D和圖4F），與年齡和性別無相關(guān)性（圖4A和圖4B）。

2.6 GPC1 生存分析及其與臨床病理信息獨立預后分析基因GPC1 的生存KM 分析結(jié)果顯示基因GPC1 高表達與患者患者不良預后相關(guān)（P=0.018）（圖5A），即GPC1 高表達縮短COAD 患者的生存時間；單因素及多因素Cox 回歸分析獨立預后結(jié)果顯示（圖5B 和圖5C），GPC1 不是患者的獨立預后影響因子。以上結(jié)果提示，基因GPC1 可能參與患者不良預后的生物學過程。

2.7 基因GPC1 的KEGG 通路富集分析KEGG通路富集結(jié)果是以主要癌癥相關(guān)信號通路為篩選條件，按照P 值從小到大的順序排列，基因GPC1 主要 影 響NOTCH、WNT、MAPK、VEGF、TGF- β、MTOR、ERBB和P53信號通路（表3，圖6）。

2.8 基因GPC1 與潛在靶基因的相關(guān)性分析通過皮爾森檢驗基因GPC1 與各信號通路主要分子的相關(guān)性（圖7），基因GPC1 與TGF 信號通路和VEGF信號通路中關(guān)鍵分子比爾森檢驗成中等程度相關(guān)（圖7A 和圖7B）。推測GPC1 可能通過TGF 信號通路和VEGF 信號通路影響結(jié)直腸癌細胞的增殖、侵襲及結(jié)直腸癌的預后。

圖4 GPC1與臨床病理信息的相關(guān)性分析

圖5 GPC1基因表達與生存及臨床病理信息的相關(guān)性分析

表3 基因GPC1單基因GSEA通路富集結(jié)果

圖6 GPC1在主要癌癥相關(guān)信號通路中的富集分析

圖7 GPC1基因表達量與主要癌癥信號中的關(guān)鍵分子皮爾森檢驗

3 討 論

葡萄糖是細胞的主要能源物質(zhì)之一，細胞依靠葡萄糖的能量代謝進行細胞的生長和分裂。癌細胞比正常細胞消耗更多的葡萄糖，即使在有足夠的氧氣情況下，它們也會將大多數(shù)葡萄糖代謝為乳酸，此過程被稱作為“Warburg effect”或稱“有氧糖酵解”［4］，這種行為確實為癌細胞提供了一些明顯的優(yōu)勢。首先，有氧糖酵解與氧化磷酸化相比實現(xiàn)了更高的ATP 產(chǎn)生率［18］。其次，通過有氧糖酵解途徑可以提供大量生物合成所需的中間體。第三，有氧糖酵解在維持氧化還原平衡和調(diào)節(jié)染色質(zhì)狀態(tài)中起重要作用。第四，細胞的有氧糖酵解過程給細胞帶來了低免疫力的微環(huán)境，并增強癌細胞的侵襲［19］。癌細胞的糖代謝異常越來越受到了人們的關(guān)注，大量的研究發(fā)現(xiàn)，癌基因通過糖酵解途徑驅(qū)動癌細胞的發(fā)生發(fā)展［20-22］。然而，糖酵解相關(guān)基因在結(jié)直腸癌中的研究較少，因此，探索糖酵解相關(guān)基因在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的機制可能是治療結(jié)直腸癌的新途徑。

本研究利用生物信息學方法，分析糖酵解相關(guān)基因在TCGA 數(shù)據(jù)庫結(jié)直腸癌樣本中表達差異，并通過生存分析獲得預后相關(guān)基因，最后利用臨床病理信息相關(guān)性分析得到基因GPC1?；騁PC1 是硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的編碼基因，在多種癌癥中表達上調(diào)［23-25］，參與多種重要細胞信號通路［26］。GPC1 是參與多種重要細胞信號通路的多功能表面蛋白聚糖［27］，例如生長因子（FGF2），病毒蛋白，細胞因子和多胺［28］，在人類的神經(jīng)膠質(zhì)瘤，胰腺癌和乳腺癌中GPC1 表達上調(diào)［29-30］。目前，關(guān)于GPC1 通過糖酵解途徑影響結(jié)直腸癌的功能和機制缺乏相關(guān)的研究，且除糖酵解途徑外GPC1 如何影響結(jié)直腸癌腫瘤發(fā)生發(fā)展機制也未清楚。本研究根據(jù)TCGA樣本分析發(fā)現(xiàn)，基因GPC1 在COAD 中高表達，且與患者的預后不良相關(guān)。進一步分析發(fā)現(xiàn)GPC1 與COAD 生物學行為有關(guān)，例如GPC1表達量與患者腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)。有研究報道，GPC1 在結(jié)直腸癌腫瘤組織中高表達［31］，miR-96-5p 和miR-149 的過表達抑制HT-29 和HCT-116 細胞中的GPC1 表達導致促進細胞凋亡并抑制細胞增殖［32］。為探索GPC1 在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的具體分子機制，本研究按照GPC1在腫瘤中表達水平分中位值為界限，分為高、低表達兩組進行GSEA 癌癥主要相關(guān)信號通路富集。結(jié)果顯示，基因GPC1在TGF信號通路和VEGF信號通路中富集（P＜0.05），且GPC1 與TGF 信號通路和VEGF 信號通路中的關(guān)鍵基因TGF-β1、VEGFB 皮爾森檢驗呈中等程度相關(guān)關(guān)系。TGF-β1（轉(zhuǎn)化生長因子β1）在癌癥中的增殖、分化和凋亡中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用［33-34］。它的上調(diào)抑制了腫瘤的早期生長，但促進了腫瘤的晚期生長，從而增強了腫瘤的惡性表 型［33-34］。VEGFB 屬 于VEGF 蛋 白 家 族 成 員 之一［35］，與VEGFR1 結(jié)合［35］。VEGF mRNA 在大多數(shù)人類腫瘤中過表達，且與浸潤性、血管密度、轉(zhuǎn)移、復發(fā)和預后相關(guān)［36］?；谝陨辖Y(jié)果推測基因GPC1可能通過TGF-β1增強TGF 信號通路，通過VEGFB增強VEGF信號通路在癌癥中的作用。

在本研究中，通過TCGA 數(shù)據(jù)庫中的COAD 樣本分析，發(fā)現(xiàn)糖酵解相關(guān)基因在腫瘤組織與正常組織中表達差異，利用單因素及多因素Cox 回歸分析得到預后相關(guān)基因，并進一步分析預后相關(guān)基因與臨床病理信息的相關(guān)性，進而得到目的基因GPC1。最后通過GSEA 富集分析及皮爾森檢驗得到GPC1在結(jié)直腸癌作用的可能分子通路。本研究通過生物信息學方法對基因GPC1 進行深入的研究，在結(jié)直腸癌中的生物學行為及分子作用機制未得到實驗驗證。本研究的分析結(jié)果可能會對在結(jié)直腸癌的細胞糖酵解實驗研究提供理論方向，也可能會成為治療結(jié)直腸癌的新策略。