尚慶毅，梁偉(.連云港市贛榆區(qū)人民醫(yī)院檢驗科，江蘇連云港 00；. 連云港市第二人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗科，江蘇連云港 03)

趨化因子誘餌受體2[Chemokine (C-C motif) receptor-like 2，CCRL2]是一種跨膜G蛋白偶聯(lián)受體，廣泛分布于人體組織和器官中，在腫瘤的相關(guān)炎癥浸潤與免疫應(yīng)答中發(fā)揮了重要作用[1]。微小RNA(microRNA，miRNA)與腫瘤發(fā)生發(fā)展、耐藥性和預(yù)后有關(guān)，在腫瘤細胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[2-3]。微小RNA-211-5p(miR-211-5p)在膀胱癌、三陰乳腺癌等多種腫瘤組織中表達下調(diào)，發(fā)揮類似抑癌基因的作用[4-5]。然而，目前國內(nèi)尚未見CCRL2、miR-211-5p在食管鱗癌中的研究報道。本研究通過檢測CCRL2與miR-211-5p在食管鱗癌組織中的表達情況，探討CCRL2和miR-211-5p在食管鱗癌中的表達水平及臨床意義，報道如下。

1 材料和方法

1.1研究對象 選擇2015年6月至2017年10月在連云港市贛榆區(qū)人民醫(yī)院行手術(shù)治療的83例食管鱗癌患者作為研究對象。男55例，女28例，年齡(59.7±12.5)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者經(jīng)術(shù)后病理組織學(xué)檢查確診為食管鱗癌；(2)具備完整的病歷資料；(3)術(shù)前均未行放、化療等抗腫瘤治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他系統(tǒng)的惡性腫瘤者；(2)合并嚴(yán)重心、肝、肺、腎功能不全；(3)臨床資料不全者。TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期40例，Ⅲ～Ⅳ期43例；浸潤程度：黏膜下層/黏膜層者28例，肌層者32例，漿膜層者23例；腫瘤直徑<5 cm者39例，≥5 cm者44例；分化程度：低分化35例，中、高分化48例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者36例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者47例。以患者術(shù)后出院為起點，對所有患者進行電話或門診隨訪，隨訪日期截至2020年10月，所有患者均完成隨訪。本研究經(jīng)過連云港市贛榆區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號：No.2015051)，患者或其監(jiān)護人均知情同意。

1.2主要試劑與儀器 TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和qPCR試劑盒購自美國Thermo Fisher公司，免疫組化試劑盒、DAB顯示試劑購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司，兔抗人CCRL2多克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗購自美國Abcam公司。CCRL2、miR-211-5p及內(nèi)參基因β-actin、U6引物由廣州銳博生物技術(shù)公司設(shè)計與合成。Evolution 200分光光度計(美國Thermofisher Scientific公司)。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本采集與保存 收集83例患者手術(shù)過程中的食管鱗癌組織及癌旁組織(距離癌組織>5 cm，且經(jīng)病理組織學(xué)證實無食管鱗癌細胞)標(biāo)本，部分樣本石蠟包埋，另一部分標(biāo)本經(jīng)生理鹽水沖洗后，立即置于-80 ℃保存。

1.3.2RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 取上述組織標(biāo)本50 mg，經(jīng)研磨后使用TRIzol試劑提取總RNA，采用分光光度計檢測RNA的濃度和純度，取吸光度(A260/280 nm)為1.8～2.0的樣本，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，樣本置于-20 ℃保存。

1.3.3實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR) 采用qRT-PCR檢測食管鱗癌組織中CCRL2、miR-211-5p的表達。根據(jù)NCBI參考序列CCRL2、miR-211-5p的序列號(NM_001130910、NC_000015.10)，由廣州銳博生物技術(shù)公司使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計與合成。CCRL2上游引物序列：5′-AGGATCCCCACCATGGTCTACACCCGTTTCTTAAAAGG-3′，下游引物序列：5′-AGGATCCCCACCATGGCCAATTACACGCTG-3′，產(chǎn)物片段大小156 bp，退火溫度 61 ℃；miR-211-5p上游引物序列：5′-GCGCTTGTCATCCTTCGCCT-3′，下游引物序列：5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′，產(chǎn)物片段大小232 bp，退火溫度63 ℃；β-actin上游引物序列：5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′，下游引物序列：5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′，產(chǎn)物片段大小60 bp，退火溫度60 ℃；U6上游引物序列：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物序列：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′，產(chǎn)物片段大小255 bp，退火溫度61 ℃。PCR反應(yīng)體系為15 μL，包括：primeSTAY 2 μL，2.5×dNTP Mix 5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，ddH2O25 μL，cDNA樣本1 μL。循環(huán)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性60 s；95 ℃ 30 s，60 ℃ 75 s，72 ℃ 15 s，38個循環(huán)。使用StepOneTM軟件于62 ℃時采集熒光信號并進行熔解曲線分析。CCRL2以β-actin為內(nèi)參照，miR-211-5p以U6為內(nèi)參照，采用2-△△Ct法進行計算相對表達量，ΔΔCt=(實驗組Ct目的基因-實驗組Ct內(nèi)參基因)-(對照組Ct目的基因-對照組Ct內(nèi)參基因)。每個樣品設(shè)置3個復(fù)孔，取平均值。

1.3.4免疫組織化學(xué)染色 將石蠟標(biāo)本切成4 μm切片后，經(jīng)過脫蠟、抗原修復(fù)和去除內(nèi)源性過氧化物酶活性后，用10%山羊血清封閉，加入CCRL2兔抗人多克隆抗體(工作濃度1∶200稀釋)4 ℃過夜，PBS洗滌后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(工作濃度1∶500稀釋)，室溫溫育1 h，PBS洗滌，DAB染色，蒸餾水漂洗，蘇木精復(fù)染細胞核，梯度乙醇浸泡5 min，二甲苯透明化后封片，顯微鏡觀察。染色結(jié)果判斷：根據(jù)陽性細胞數(shù)：0%～5%，記為0分；6%～25%，記為1分；26%～50%記為2分；51%～75%，記為3分；>75%，記為4分；根據(jù)細胞染色強度評分：無染色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將兩項積分的乘積作為評判標(biāo)準(zhǔn)：得分0～1分為陰性(-)，2分以上為陽性，2～4分記為+，4～6分記為++，6分以上記為+++。

2 結(jié)果

2.1組織中CCRL2mRNA及miR-211-5p表達水平的比較 與癌旁組織相比，食管鱗癌組織中CCRL2mRNA(1.05±0.21 vs 2.68±0.52)的表達水平顯著升高(t=26.480，P<0.001)，而miR-211-5p(1.01±0.18 vs 0.61±0.15)的表達水平顯著降低(t=15.553，P<0.001)。

2.2組織中CCRL2蛋白表達水平的比較 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，CCRL2蛋白主要定位于細胞質(zhì)和細胞膜。與癌旁組織CCRL2蛋白陽性表達率(24.10%)比較，食管鱗癌組織中CCRL2蛋白陽性表達率(62.65%)顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=25.116，P<0.05)。見圖1。

注；A，CCRL2在癌旁組織中陰性表達；B，CCRL2在癌組織中陽性表達。

2.3食管鱗癌組織中CCRL2mRNA和miR-211-5p的相關(guān)性 Pearson相關(guān)分析結(jié)果表明，食管鱗癌組織中CCRL2和miR-211-5p呈負相關(guān)(r=-0.713，P<0.01)。

2.4CCRL2和miR-211-5p的表達與食管鱗癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 根據(jù)食管鱗癌組織中CCRL2蛋白免疫組織化學(xué)染色結(jié)果，將食管鱗癌患者分為CCRL2陽性表達組(染色結(jié)果為+、++和+++)和CCRL2陰性表達組(染色結(jié)果為-)。以食管鱗癌組織中miR-211-5p表達水平的均值(0.61)為界，將食管鱗癌患者分為miR-211-5p高表達組(≥0.61，n=41)和miR-211-5p低表達組(<0.61,n=42)，結(jié)果表明，CCRL2、miR-211-5p的表達水平與患者性別、年齡、腫瘤直徑、浸潤程度無關(guān)(P>0.05)，而與腫瘤分化程度、TNM分期和淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)。見表1。

表1 CCRL2和miR-211-5p表達水平與食管鱗癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系[n(%)]

2.5CCRL2、miR-211-5p表達與食管鱗癌患者生存率的關(guān)系 通過Kaplan-Meier生存分析可知，CCRL2陽性表達組食管鱗癌患者3年累積生存率顯著低于CCRL2陰性表達組患者(30.84% vs 54.98%，χ2=6.407，P=0.011)。miR-211-5p高表達組食管鱗癌患者3年累積生存率顯著高于miR-211-5p低表達組患者(58.72% vs 24.31%，χ2=10.99，P<0.001)。見圖2。

注：A，CCRL2表達與食管鱗癌患者生存率的關(guān)系；B，miR-211-5p表達與食管鱗癌患者生存率的關(guān)系。

3 討論

CCRL2作為一種趨化因子受體，在單核細胞、中性粒細胞、巨噬細胞、T細胞內(nèi)均有表達，通過調(diào)控機體穩(wěn)態(tài)平衡、血管生成、免疫監(jiān)視及炎癥反應(yīng)等在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移的不同階段發(fā)揮重要作用[6]。本研究結(jié)果顯示，在食管鱗癌組織中CCRL2的表達水平顯著高于癌旁組織，且CCRL2表達與食管鱗癌分化程度、TNM分期和淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示CCRL2高表達與食管鱗癌的發(fā)生有關(guān)。研究表明，CCRL2在多種腫瘤組織或細胞中異常表達，如在前列腺癌細胞中表達水平升高，可影響腫瘤細胞增殖、侵襲和遷移[7]。另有研究結(jié)果表明，CCRL2在肝癌、乳腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等腫瘤的惡性進展過程中發(fā)揮作用，如參與調(diào)節(jié)細胞生長、遷移，血管發(fā)生和調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)等[8]。提示CCRL2在食管鱗癌組織中的表達水平升高，可能在食管鱗癌進展過程中調(diào)控腫瘤細胞增殖、侵襲，促進腫瘤的發(fā)展與淋巴轉(zhuǎn)移，但其在食管鱗癌中作用還需要進一步的實驗支持。

miR-211-5p在腫瘤細胞增殖、分化、遷移及腫瘤耐藥等過程中發(fā)揮重要作用，其表達異常與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，且主要發(fā)揮抑癌作用[3,9]。本研究檢測了miR-211-5p在食管鱗癌組織中表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與癌旁組織比較，食管鱗癌組織中miR-211-5p表達水平顯著降低，提示miR-211-5p與食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。Qin等[10]研究表明，與正常組織相比，在肝細胞癌(HCC)組織和細胞系中miR-211-5p相對表達量顯著下調(diào)；進一步行Kaplan-Meier分析表明，miR-211-5p低表達HCC患者的總生存期較差，而體外上調(diào)miR-211-5p的表達，可抑制細胞增殖、遷移與侵襲。另有研究證實[11]，miR-211-5p在腎細胞癌(RCC)組織與細胞中表達下調(diào)，miR-211-5p的表達下調(diào)促進了RCC細胞的增殖、遷移和侵襲。Wang等[12]研究證實，miR-211-5p在甲狀腺癌中表達下調(diào)，過表達miR-211-5p可通過調(diào)控性別決定區(qū)Y框蛋白11的表達水平，影響甲狀腺癌細胞的增殖與侵襲。進一步分析結(jié)果顯示，miR-211-5p表達與患者性別、年齡、腫瘤直徑、浸潤程度無關(guān)，而與腫瘤分化程度、TNM分期和淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示miR-211-5p與食管鱗癌的發(fā)展相關(guān)。故而筆者推測，miR-211-5p可能通過某種機制調(diào)控食管鱗癌細胞增殖、遷移與侵襲。但其具體作用機制仍需進行實驗驗證。

本研究進一步行Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，在食管鱗癌組織中，CCRL2低表達、miR-211-5p高表達，且二者呈負相關(guān)，表明二者可能存在負向調(diào)控關(guān)系。提示CCRL2可能通過靶向miR-211-5p調(diào)控食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展。Kaplan-Meier生存分析顯示，CCRL2陽性表達組食管鱗癌患者的3年累積生存率顯著低于CCRL2陰性表達組患者，miR-211-5p高表達組食管鱗癌患者的3年累積生存率顯著高于miR-211-5p低表達組患者，提示CCRL2、miR-211-5p可能通過調(diào)控腫瘤發(fā)展影響患者預(yù)后情況。

綜上所述，CCRL2在食管鱗癌組織中高表達，而miR-211-5p低表達，且二者與食管鱗癌分化程度、淋巴轉(zhuǎn)移及生存情況有關(guān)，可能作為食管鱗癌患者預(yù)后評估的分子標(biāo)志物。然而二者具體作用機制尚不完全清楚，仍需進行進一步研究。