岳 麗，王 卉，再吐尼古麗·庫爾班，茆 軍，涂振東，山其米克

(新疆農(nóng)業(yè)科學院生物質能源研究所，新疆 烏魯木齊 830091)

我國是農(nóng)業(yè)大國，各類農(nóng)作物秸稈資源十分豐富，秸稈中含有豐富的粗纖維、氮、磷、鉀、鈣、鎂等營養(yǎng)物質，可作為反芻動物的粗飼料來源[1]；但秸稈的細胞壁結構復雜，直接作為飼料，適口性差、利用率低，在瘤胃中的降解率也較低[2-3]。目前已篩選出可降解纖維素和木質素的菌群和酶[4]，單獨加入酶或菌時降解效果不理想。為了能高效的利用秸稈，必須消除木質纖維結構對酶解過程的阻礙,故將微生物發(fā)酵和酶解技術相結合[5-6]。劉輝[7]以玉米秸稈為原料，對酶菌協(xié)同發(fā)酵與單獨纖維素酶發(fā)酵生產(chǎn)生物蛋白質飼料的工藝進行了比較，結果表明酶菌協(xié)同發(fā)酵生產(chǎn)的粗蛋白質含量優(yōu)于單獨纖維素酶發(fā)酵。吳立坡[8]等利用菌酶復合制劑發(fā)酵玉米秸稈，發(fā)酵后干物質、粗蛋白質含量顯著高于未發(fā)酵秸稈。王田田[9]研究了菌酶協(xié)同發(fā)酵對辣木莖葉粉的營養(yǎng)價值及抗氧化活性的影響，結果表明菌酶協(xié)同發(fā)酵更有利于辣木營養(yǎng)品質的提升以及抗氧化活性成分的提高。

甜高粱作為飼用及糖料作物營養(yǎng)豐富、生物產(chǎn)量高、用途廣泛、對生長的環(huán)境條件要求不嚴格，是降低畜牧養(yǎng)殖成本的最佳飼料[10-11]。目前已有關于高粱秸稈經(jīng)酶菌制劑單獨處理的研究報道，但是對酶菌制劑復合處理高粱秸稈的報道甚少。為了提高秸稈飼料的利用效率，有效發(fā)揮反芻動物的生長潛能，有必要對復合生物制劑(酶菌)處理后的高粱秸稈飼料的營養(yǎng)價值進行評定[12]。本研究擬利用酶菌共同發(fā)酵甜高粱秸稈，研究不同發(fā)酵因素對發(fā)酵后飼料中粗蛋白質含量的影響，優(yōu)化酶菌協(xié)同發(fā)酵的條件，以期為高效利用甜高粱秸稈提供參考。

1 材料與方法

1.1 原料

甜高粱品種：新高粱3號，新高粱9號種植于新疆昌吉；甜高粱秸稈原料：甜高粱整株粉碎后加入酵母固態(tài)發(fā)酵，蒸餾乙醇后所得的殘渣，晾干后粉碎得到粉末。

1.2 菌株

產(chǎn)朊假絲酵母(R)購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；黑曲霉(H)為所在實驗室保存。

1.3 主要試劑

檸檬酸、檸檬酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等試劑均為分析純；木聚糖酶、纖維素酶為試劑級，酵母培養(yǎng)基、馬鈴薯培養(yǎng)基，購自北京奧博星生物技術有限責任公司。

1.4 主要儀器與設備

SL3001電子天平，上海民僑精密科學儀器有限公司；ZWY-2102C恒溫培養(yǎng)振蕩器；上海申安LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌器。

1.5 試驗與方法

1.5.1指標測定方法

粗蛋白質的測定參照GB/T 6432—2018;粗纖維的測定參照GB/T 6434—2006。

1.5.2固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)

1.5.2.1培養(yǎng)基配制

酵母培養(yǎng)基：稱取酵母膏1 g，蛋白胨2 g，葡萄糖2 g，瓊脂1.5 g，補充蒸餾水至錐形瓶100 ml處，121℃滅菌20 min。

馬鈴薯培養(yǎng)基：按照培養(yǎng)基說明書稱取，加水，滅菌。

1.5.2.2菌種活化

將產(chǎn)朊假絲酵母劃線轉接到酵母培養(yǎng)基上，30℃活化培養(yǎng)24 h；黑曲霉劃線轉接到馬鈴薯培養(yǎng)基斜面上，28℃活化培養(yǎng)24 h，連續(xù)活化三代。

1.5.2.3最佳發(fā)酵劑確定

稱取100 g秸稈粉末裝入三角瓶中,按照料液比1∶4加入pH 4.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液400 ml,121℃滅菌20 min，然后冷卻。將酶用雙蒸水溶解，然后使用0.22 μm濾膜過濾除菌，按照表1加入酶，酶解24 h，然后按照100 g發(fā)酵培養(yǎng)基接入10 ml菌種(濃度1×108CFU/ml-1)，于31℃培養(yǎng)6 d，發(fā)酵結束后65℃烘干、粉碎后供分析測定用。

1.5.3酶菌協(xié)同發(fā)酵甜高粱秸稈的單因素試驗

1.5.3.1發(fā)酵時間

在發(fā)酵溫度30℃、料液比1∶4、pH 4.0、酶菌比例1∶2條件下，研究不同發(fā)酵時間(2、3、4、5、6 d)對發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白質含量的影響。

1.5.3.2酶菌比例

在發(fā)酵時間5 d、溫度30℃、pH 4.0、料液比為1∶4條件下，研究不同酶菌復配比例(3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3)對發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白質含量的影響。

1.5.3.3pH值

在發(fā)酵時間5 d、溫度30℃、酶菌比1∶2條件下，研究不同pH值(3.5、4.5、5.5、6.5、7.5)對發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白質含量的影響。

1.5.3.4發(fā)酵溫度

在發(fā)酵時間5 d、料液比1∶4、pH 5.5、酶菌比例1∶2條件下，研究不同溫度(25、30、35、40、45℃)對發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白質含量的影響。

1.5.4酶菌協(xié)同發(fā)酵的正交試驗

根據(jù)單因素試驗的結果，以粗蛋白質含量為指標，考察發(fā)酵時間、酶菌比例、料液比和發(fā)酵溫度4個因素，每個因素選3個水平，采用L9(34)正交試驗，因素及水平設計見表2。

表2 正交試驗因素水平

2 結果與討論

2.1 秸稈發(fā)酵最佳發(fā)酵酶的確定

以甜高粱秸稈粉末為原料，設置對照組和3個處理組(纖維素酶、木聚糖酶、纖維素酶+木聚糖酶)于31℃培養(yǎng)箱中酶解24 h，然后加入黑曲霉和產(chǎn)朊假絲酵母菌的復合菌，發(fā)酵6 d，最后測定發(fā)酵樣品中的粗蛋白質含量見圖1。

圖1 酶種類對粗蛋白質含量的影響

由圖1可知，纖維素酶組、木聚糖酶組以及纖維素酶+木聚糖酶組蛋白質含量均高于對照組，其中利用纖維素酶+木聚糖酶處理后蛋白質含量最高，達到12.51%，比對照組提高了8.4%，因此選取纖維素酶+木聚糖酶的復合酶為協(xié)同發(fā)酵高粱秸稈酶組合。

2.2 高粱秸稈發(fā)酵單因素試驗結果

2.2.1發(fā)酵時間

發(fā)酵時間是影響發(fā)酵后秸稈中蛋白質含量的重要因素之一。一般情況下，發(fā)酵時間過短會使微生物的活菌數(shù)和有益代謝產(chǎn)物積累不足；而當發(fā)酵時間過長時，則會增加發(fā)酵成本，并且容易感染其他雜菌[13]。圖2為不同發(fā)酵時間發(fā)酵后產(chǎn)物中粗蛋白質含量測定結果。

圖2 發(fā)酵時間對粗蛋白質含量的影響

由圖2可知，發(fā)酵時間為2 d時，發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白質含量最低，為12.29%，隨著發(fā)酵時間的增加，粗蛋白質含量逐漸升高，5 d以后呈降低趨勢。發(fā)酵時間5 d時，粗蛋白質含量最高，為13.26%。因此，確定最佳發(fā)酵時間為5 d。

2.2.2酶菌比例

由于菌體本身就是一種蛋白質，所以發(fā)酵過程中菌種接種量的大小對發(fā)酵結果的影響較大。當接種量過小時，菌體適應期相對較長，積累至一定量所需時間延長，并且會增加感染其他菌的概率；而當接種量過大時，溶氧供應不足，使發(fā)酵產(chǎn)物溫度迅速升高，同時還消耗大量的營養(yǎng)對微生物后期生長造成不利。圖3為酶菌比例對發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白質含量的影響結果。

圖3 酶菌比例對粗蛋白質含量的影響

由圖3可知，當酶菌的復配比例為3∶1時，粗蛋白質含量最低，為12.3%。當酶菌復配比例為1∶2時，發(fā)酵飼料中的粗蛋白質含量最高，為14.21%。因此，最佳酶菌復配比例為1∶2。

2.2.3pH值

酶只有在最適宜的pH值條件下才能發(fā)揮最大活性，過高或過低的pH值都會使酶的活性降低，影響微生物細胞內(nèi)的生物化學過程[14]。pH值對發(fā)酵產(chǎn)物中蛋白質含量的影響見圖4。

圖4 pH值對粗蛋白質含量的影響

由圖4可知，當pH值小于5.5時，隨著pH值的增加發(fā)酵產(chǎn)物的粗蛋白質含量呈上升趨勢，當發(fā)酵基質的pH值為5.5時，發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白質含量達到最高，為14.57%，繼續(xù)提高基質的pH值，粗蛋白質含量反而降低。這可能是由于pH值的大小改變底物分子和酶分子的帶電狀態(tài)，從而影響酶與底物的結合[14]。因此選擇pH 5.5作為復合酶的最適發(fā)酵pH值。

2.2.4發(fā)酵溫度

發(fā)酵溫度不僅影響微生物的生長代謝，還會對微生物分泌的酶活性產(chǎn)生影響。發(fā)酵溫度過高會使細胞內(nèi)蛋白質、核酸等物質變性，也會影響細胞膜的流動性和酶的活性；若溫度太低則會使菌體生長緩慢，酶的活性減弱[15-16]。圖5反映了不同發(fā)酵溫度下產(chǎn)物中蛋白質含量的變化情況。

圖5 發(fā)酵溫度對粗蛋白質含量的影響

由圖5可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白質含量呈先增加后降低的趨勢，當發(fā)酵基質溫度為35℃時，發(fā)酵產(chǎn)品中粗蛋白質含量達到最高，為13.3%，這可能是由于此溫度有利于高粱秸稈中碳水化合物轉化為糖然后被黑曲霉和產(chǎn)朊假絲酵母作為碳源利用，促進菌體蛋白的增加。因此，最適宜的發(fā)酵溫度為35℃。

2.3 高粱秸稈發(fā)酵正交試驗結果與分析

根據(jù)單因素試驗結果，綜合研究發(fā)酵時間(A)、酶菌比例(B)、pH值(C)和發(fā)酵溫度(D)4個因素對甜高粱秸稈粗蛋白質含量的影響，設計L9(34)正交試驗設計，見表3。

由表3分析結果可知，各因素對高粱秸稈發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白質含量的影響順序由大到小為C>D>A>B，即pH值>發(fā)酵溫度>發(fā)酵時間>酶菌比例，最佳組合方式為A2B3C1D3，即發(fā)酵時間5 d，酶菌混合比例為1∶3，pH 4.5，發(fā)酵溫度40℃。由表4方差分析的結果可知，pH值、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間對發(fā)酵飼料中粗蛋白質含量影響達顯著水平，而酶菌比例的影響不顯著。按優(yōu)化后工藝條件進行驗證試驗，經(jīng)過3次平行試驗，得到甜高粱秸稈發(fā)酵后蛋白質平均含量為15.51%。

3 討論

采用菌酶協(xié)同發(fā)酵法處理飼料，可以提高發(fā)酵過程中微生物對飼料中大分子物質的利用效率，如纖維素酶分解秸稈中的纖維素和半纖維素生成單糖能為酵母菌合成菌體蛋白提供能量，同時也可以克服單獨利用微生物發(fā)酵產(chǎn)酶不足的問題，進而提高飼料品質[17-18]。張倩茹[19]研究了固態(tài)發(fā)酵玉米芯制備木聚糖的最佳菌酶組合條件，枯草芽孢桿菌與酵母菌比例為1∶9，發(fā)酵時添加纖維素酶量為1 000 U/g飼料。在此條件下，木聚糖含量可達1.421 mg/g，與對照組相比提高了257%。李新社等[20]利用纖維素酶和康寧木霉菌共同處理玉米秸稈將其轉化為可發(fā)酵糖，并從玉米秸稈降解物中獲得了4.852 g/L的還原糖。何香凝[21]研究發(fā)現(xiàn)菌酶協(xié)同發(fā)酵玉米芯提取木聚糖的產(chǎn)量最高，達11.48%。發(fā)酵后玉米芯結構疏松、孔洞較大。從形態(tài)結構上說明了菌酶協(xié)同發(fā)酵玉米芯能夠更好地破壞纖維素、半纖維素和木質素,使木聚糖得以更好地釋放。

4 結論

本試驗酶菌協(xié)同發(fā)酵后的甜高梁秸稈的粗蛋白質含量高于單獨混菌發(fā)酵。酶菌協(xié)同發(fā)酵的最佳工藝條件為：發(fā)酵時間5 d，混酶和混菌混合比例1∶3，pH4.5，培養(yǎng)溫度40℃。在此條件下，發(fā)酵產(chǎn)品的粗蛋白質質量分數(shù)為15.51%。