阮祥燕 楊 瑜 盧 丹 杜 娟 程姣姣 谷牧青 李揚(yáng)璐 金鳳羽 段 微 代蔭梅 鞠 蕊 許 新 Matthias Korell Alfred O. Mueck,5

(1. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院內(nèi)分泌科， 北京 100026； 2. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院婦科， 北京 100026； 3. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院婦科腫瘤科， 北京 100026； 4. 德國諾伊斯約翰娜艾蒂安醫(yī)院， 諾伊斯 41462, 德國； 5. 德國圖賓根大學(xué)婦產(chǎn)醫(yī)院婦女健康部與婦女健康研究中心，圖賓根 D-72076， 德國)

乳腺癌是全球女性最常見的惡性腫瘤，全球每年約有超過100萬人診斷為乳腺癌，中國約占11.2%，僅次于美國(占13.9%)[1]。在我國，年輕乳腺癌患者比例較高，62.9%為絕經(jīng)前乳腺癌患者[2]。在<40歲的乳腺癌患者中，超過50%的患者會關(guān)注乳腺癌治療后的生育能力并有生育需求，但其妊娠率卻不到5%[3]。隨著診斷技術(shù)與治療的進(jìn)步，女性乳腺癌的5年生存率已超過90%[4]，但化學(xué)藥物治療(以下簡稱化療)、放射治療(以下簡稱放療)與內(nèi)分泌治療等會對性腺造成損傷從而導(dǎo)致早發(fā)性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency，POI)的發(fā)生。POI不僅嚴(yán)重影響乳腺癌幸存患者的生育力，還使得各類慢性疾病如心血管疾病、骨質(zhì)疏松等疾病發(fā)生提前、發(fā)病率增加，死亡風(fēng)險也增加[5]，嚴(yán)重影響腫瘤患者的生活質(zhì)量。對于乳腺癌幸存患者，如何提高其腫瘤治療后的生活質(zhì)量，保護(hù)年輕乳腺癌患者的生育能力是臨床醫(yī)生需要重視的問題。

卵巢組織凍存與移植技術(shù)利用低溫生物學(xué)原理使卵巢組織處于休眠狀態(tài)[6]，待患者腫瘤治療完成后，再將凍存的卵巢組織復(fù)蘇移植回體內(nèi)，從而避免了醫(yī)源性因素對于卵巢功能的破壞。本文報道1例在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院進(jìn)行卵巢組織凍存并移植成功的乳腺癌病例，這是我國首例乳腺癌患者的凍存卵巢組織成功移植。

1 臨床資料與方法

1.1 乳腺癌的診斷及手術(shù)治療

患者，女，35歲，孕6產(chǎn)1。2016年9月12日在某醫(yī)院體檢時發(fā)現(xiàn)右乳腫物，于北京協(xié)和醫(yī)院進(jìn)一步診治，2016年10月8日局部麻醉下行右乳腫物切除活檢，術(shù)中冰凍病理：(右)乳腺浸潤性導(dǎo)管癌，低分化，可見脈管內(nèi)癌栓；免疫組織化學(xué)：雌激素受體α(estogen receptor α，ERα)(-)，孕激素受體(progestone receptor，PR)(-)，Her-2(3+)，ki-67(index 70%)。遂轉(zhuǎn)全身麻醉后行右乳腺癌改良根治術(shù)，病理顯示：右乳腺組織內(nèi)可見高級別導(dǎo)管內(nèi)癌殘留，累及乳頭下大導(dǎo)管，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌(腋窩5/25，外側(cè)0/1，第3站0/0，胸肌間0/0)。最后診斷為乳腺浸潤性導(dǎo)管癌T1CN2M0期。后續(xù)擬行放療、化療及靶向治療。患者無乳腺癌及卵巢癌家族史，未行BRCA-1、BRCA-2基因相關(guān)檢測。

1.2 卵巢組織取材、轉(zhuǎn)運(yùn)與凍存

考慮到患者后續(xù)擬行化療，為預(yù)防醫(yī)源性POI并保留生育能力，2016年11月4日患者于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院內(nèi)分泌科咨詢卵巢組織凍存，抽血結(jié)果示(月經(jīng)第10天)：雌二醇(estradiol，E2)為155.12 pg/mL，孕酮(progesterone，P)為 0.20 ng/mL，卵泡刺激素(follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH)為5.93 IU/L，黃體生成素(luteinizing hormone，LH) 為6.23 IU/L，抗苗勒管激素(anti-Müllerian hormone，AMH) 為1.26 ng/mL，提示卵巢儲備功能尚好，遂決定進(jìn)行卵巢組織凍存。

2016年11月9日于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院行腹腔鏡下“雙側(cè)卵巢部分切除+雙卵巢成型術(shù)”。術(shù)中用冷刀進(jìn)行雙側(cè)卵巢組織取材，卵巢組織切除后立即放入4～8 ℃轉(zhuǎn)移液并在轉(zhuǎn)運(yùn)箱中保持4～8 ℃恒溫，于2 h內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)至首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院的卵巢組織凍存庫。此后，對卵巢組織進(jìn)行如下處理：于4 ℃超凈工作臺上去除卵巢髓質(zhì)，將卵巢皮質(zhì)處理成4 mm×8 mm×1 mm的皮質(zhì)片，經(jīng)處理后該患者共凍存卵巢皮質(zhì)13片。凍存前取直徑3 mm 的新鮮卵巢組織行卵泡活性檢測：該組織樣本中普通光學(xué)顯微鏡下卵泡計數(shù)為1個(圖1)。另外單獨(dú)留存兩片直徑為3 mm的圓形皮質(zhì)片用于復(fù)蘇后移植前的卵泡活性檢測；另留取相同體積的新鮮皮質(zhì)片用于病理檢測。采用慢速程序化冷凍，具體的冷凍方案、冷凍保護(hù)劑參考文獻(xiàn)[7]。

1.3 卵巢凍存后的乳腺癌治療

患者進(jìn)行卵巢組織凍存后，于2016年11月15日至2017年3月18日進(jìn)行了化療?；煼桨溉缦拢篸dAC方案(dd:劑量密集型;A:多柔比星;C:環(huán)磷酰胺)每2周1次，共4次，吉賽欣支持；后續(xù)赫賽汀等治療1年。2017年4月10日至2017年5月12日進(jìn)行放療：常規(guī)外照射放療，用6MV-X線及7、10 Mev-E照射右側(cè)鎖骨上下淋巴引流區(qū)及右側(cè)胸壁區(qū)；Dt 50Gy/25次(常規(guī)分割，2 Gy/次，5次/周)。

1.4 卵巢組織復(fù)蘇與移植

2018年3月26日，患者1年無月經(jīng)來潮，絕經(jīng)癥狀明顯，卵巢功能評估：FSH 101.83 IU/L、LH 53.90 IU/L、E2 47.78 pg/mL，AMH<0.06 ng/mL。提示體內(nèi)留存的卵巢功能徹底衰退。經(jīng)乳腺腫瘤專家評估后，已處于無瘤存活狀態(tài)，考慮進(jìn)行卵巢組織移植。

患者于2018年4月16日，乳腺癌治療結(jié)束1年，在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院行腹腔鏡下凍存卵巢組織移植術(shù)。術(shù)前2 d復(fù)蘇2塊3 mm直徑卵巢組織塊進(jìn)行卵泡數(shù)活性檢測，每3 mm卵巢組織平均卵泡數(shù)9個(圖1)，卵泡及組織整體活性很好，可以進(jìn)行凍存卵巢組織移植。移植日，復(fù)蘇了6片凍存卵巢組織片，進(jìn)行了盆腔腹膜袋原位移植。具體復(fù)蘇過程同文獻(xiàn)[7]。移植手術(shù)：于右側(cè)骶韌帶與右側(cè)輸尿管間剪開后腹膜，擴(kuò)大切口至直徑約3.5 cm，腹膜下組織血運(yùn)良好。將復(fù)蘇的6片卵巢皮質(zhì)均勻鋪貼于腹膜下創(chuàng)面內(nèi)，1/0可吸收縫合線8字縫合1針閉合后腹膜創(chuàng)面。

圖1 卵巢組織卵泡活性 Fig.1 Follicular activity in ovarian tissue(scale bar=100 μm)A： fresh ovarian tissue under flat-light microscope； B： fresh ovarian tissue under fluorescence microscope； C： frozen-thawed ovarian tissue under flat-light microscope； D： frozen-thawed ovarian tissue under fluorescence microscope; Black arrows represent follicles.

2 治療結(jié)果

2.1 性激素濃度

凍存前患者卵巢功能：FSH 5.93 IU/L、LH 6.23 IU/L、E2 155.12 pg/mL、P 0.20 ng/mL、AMH 1.26 ng/mL，提示卵巢儲備功能尚好，遂決定凍存。在結(jié)束放療6個月后復(fù)查：FSH升至44.59 IU/L，E2 71.39 pg/mL，AMH<0.06 ng/mL，提示卵巢功能已經(jīng)衰退，且FSH進(jìn)一步上升，放療結(jié)束11個月后FSH升至101.83 IU/L。移植后1個月，F(xiàn)SH較移植前下降，為46.53 IU/L；移植后2個月后復(fù)查，絕經(jīng)癥狀消失，F(xiàn)SH 7.29 IU/L、LH 7.48 IU/L、E2 121.02 pg/mL、P 0.11 ng/mL；移植3個月，患者恢復(fù)排卵，月經(jīng)自然來潮，提示卵巢功能完全恢復(fù)正常?，F(xiàn)患者已移植近3年，卵巢功能依然正常，且2020年6月3日復(fù)查(移植后25個月)提示有排卵：FSH 7.57 IU/L、LH 5.47 IU/L、E2 172.19 pg/mL、P 5.01 ng/mL?；颊呋熐爸烈浦埠?年的性激素變化見圖2。

圖2 FSH、E2濃度變化Fig.2 Changes in FSH and E2 levelsFSH：follicle stimulating hormone； E2: estradiol; OTT: ovarian tissue transplantation.

2.2 經(jīng)陰道超聲

2018年3月26日(放化療結(jié)束后，卵巢組織移植前)，患者經(jīng)陰道超聲顯示子宮及雙側(cè)卵巢呈萎縮狀態(tài)(圖3)；2018年7月13日(移植后3個月)，右側(cè)移植卵巢組織 3.68 cm×2.04 cm，且可見數(shù)個小卵泡(圖4A)，表明移植的卵巢有卵泡發(fā)育；2018年10月10日(移植后6個月)，B超下可見右側(cè)移植卵巢有一1.96 cm×1.56 cm的卵泡，子宮內(nèi)膜厚度1.21 cm(圖4B)，且當(dāng)天激素濃度提示患者處于排卵前: FSH22.26 IU/L、LH 27.81 IU/L、E2 324.28 pg/mL、P 0.97 ng/mL；2020年6月3日(移植后25個月)B超顯示：右側(cè)移植卵巢有一1.84 cm×1.40 cm的黃體(圖4C)。當(dāng)天性激素檢測提示患者已排卵：FSH 7.57 IU/L、LH 5.47 IU/L、E2 172.19 pg/mL、P 5.01 ng/mL。表明該患者移植的卵巢中卵泡可以發(fā)育成熟并自行排卵。

圖3 放化療結(jié)束后，卵巢組織移植前子宮及卵巢B超圖像Fig.3 Photographs of uterus and ovary after chemoradiotherapy and before OTTOTT： ovarian tissue transplantation.

圖4 卵巢組織移植后B超下卵巢與卵泡圖像Fig.4 Photographs of ovaries and follicles under ultrasound after OTTA: several small follicles after 3 months of OTT；B: a 1.96 cm×1.56 cm follicle after 6 months of OTT； C: a 1.84 cm×1.40 cm corpus luteum after 25 months of OTT; OTT： ovarian tissue transplantation.

3 討論

3.1 乳腺癌治療對卵巢功能的影響

乳腺癌的治療除手術(shù)切除腫瘤組織外，常常還需要進(jìn)行放療、化療或內(nèi)分泌治療。乳腺癌常用的化療藥物包括環(huán)磷酰胺、多柔比星、氟尿嘧啶、紫杉醇等[8]，都對卵巢有一定的毒性，尤以環(huán)磷酰胺對卵巢的損傷最大，屬于高風(fēng)險類化療藥物[9]。本例患者應(yīng)用了環(huán)磷酰胺、多柔比星進(jìn)行化療，導(dǎo)致了POI的發(fā)生：FSH化療前為5.93 IU/L，化療后FSH最高達(dá)到了101.83 IU/L，AMH也降至0.06 ng/mL以下。對于雌激素受體或者孕激素受體陽性的乳腺癌患者，還需進(jìn)行5～10年的內(nèi)分泌治療，即便內(nèi)分泌治療的藥物沒有生殖毒性，患者的卵巢功能也會隨著時間逐漸衰退[10]。故有必要對年輕乳腺癌患者進(jìn)行POI的防治。本例患者由于雌孕激素受體陰性，未進(jìn)行內(nèi)分泌治療，故在乳腺癌結(jié)束后1年進(jìn)行了凍存卵巢組織移植。

3.2 乳腺癌患者現(xiàn)有的生育力保護(hù)技術(shù)

NICE[11]指南建議：因腫瘤治療或疾病存在生育力損傷風(fēng)險時，通過胚胎凍存或卵母細(xì)胞凍存以保護(hù)生育力。雖然這兩項技術(shù)目前已成熟，但乳腺癌屬于激素依賴性腫瘤，促排卵引起高雌激素濃度會引起體內(nèi)殘留腫瘤細(xì)胞快速增生[12]，且促排卵會使腫瘤治療至少推遲2周[13]。

卵巢組織凍存技術(shù)，卵巢組織取材前不需要促排卵，不會導(dǎo)致超生理劑量的雌激素產(chǎn)生[14-16]，因而不會有刺激腫瘤增生的風(fēng)險?？稍谠陆?jīng)周期任何時間進(jìn)行，不延誤乳腺癌的治療。本例患者從卵巢組織取材到乳腺癌化療，期間僅間隔5 d，未耽誤腫瘤的化療。由于凍存的是卵巢皮質(zhì)，而非單個卵子，所以卵巢組織凍存為患者保留了巨大的生育潛力的同時還保留了卵巢的內(nèi)分泌功能[5]。該患者移植前FSH最高達(dá)到了101.83 IU/L。移植后1個月FSH便降至46.53 IU/L，移植后2個月卵巢內(nèi)分泌功能恢復(fù)正常：FSH 7.29 IU/L、LH 7.48 IU/L、E2 121.02 pg/mL、P 0.11 ng/mL。從安全性及時間的角度考慮，卵巢組織凍存是乳腺癌患者保護(hù)生育力最合適的選擇，且只有卵巢組織凍存移植技術(shù)可以防治醫(yī)源性POI。在歐洲，凍存卵巢組織的患者中乳腺癌患者最多，占總體凍存患者的24%[16]。

3.3 移植時機(jī)及隨訪

對于卵巢組織移植的時機(jī)，需要待患者原發(fā)疾病緩解，發(fā)生POI或者有強(qiáng)烈生育要求，距放化療結(jié)束至少3～6個月[5]。對于生育要求的患者，夫妻雙方應(yīng)在移植前排除其他導(dǎo)致不孕的因素[16]。移植后，應(yīng)對患者進(jìn)行每月隨訪，了解其絕經(jīng)相關(guān)癥狀、月經(jīng)情況(保留子宮的患者)、實(shí)驗室內(nèi)分泌指標(biāo)(FSH、LH、E2、P、AMH)及B超監(jiān)測卵泡的發(fā)育情況。當(dāng)卵巢功能恢復(fù)正常(絕經(jīng)相關(guān)癥狀緩解或消失，F(xiàn)SH<25 IU/L)后，可每3～6個月隨訪1次[5]。研究[16]顯示，80%～95%的患者移植后可重新恢復(fù)卵巢功能(FSH下降，E2上升)。首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院目前已移植10例，移植后卵巢內(nèi)分泌功能全部恢復(fù)正常[5]。卵巢內(nèi)分泌功能的恢復(fù)大約需要2～6個月，每次移植卵巢功能平均可維持4～7年，最長可達(dá)10年。維持時間的長短與卵泡密度、移植的皮質(zhì)片數(shù)量、移植部位等有關(guān)。凍存的卵巢組織多者(20片以上)，可以多次移植，總體讓卵巢功能維持10～20年以上是可以預(yù)期的。

隨著乳腺癌患者5年存活率的提高與生育力保護(hù)技術(shù)的不斷進(jìn)步，傳統(tǒng)腫瘤治療中先保命的理念需要更新，卵巢組織凍存與移植技術(shù)在不延誤腫瘤治療的同時也能保留患者的卵巢內(nèi)分泌功能與生育力，是乳腺癌患者生育力與卵巢功能保護(hù)保存的有效方法。