王娟 王竹瑤 倪燕 曹小飛 丁正年

內(nèi)皮細胞增殖是血管新生的必需前提。血管新生對缺血性損傷組織修復至關(guān)重要；然而，某些病理因素引起的異常血管增生則是疾病發(fā)生發(fā)展的病理基礎(chǔ)，例如糖尿病視網(wǎng)膜病變、動脈粥樣硬化斑塊、惡性腫瘤等[1-2]。因此，從調(diào)控血管內(nèi)皮細胞增殖的角度控制血管新生，對許多疾病的治療具有積極意義。

α硫辛酸(α-lipoic acid, LA)天然存在于人類食物中[1]，一些歐洲國家已經(jīng)批準LA用于臨床治療糖尿病并發(fā)癥包括糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病腎病、疼痛等[2-4]，但作用機制尚不明確。本研究采用體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)模型，發(fā)現(xiàn)LA顯著抑制HUVECs增殖，提示LA除可應(yīng)用于糖尿病視網(wǎng)膜病變等并發(fā)癥外，還可能對其他血管異常增生的疾病如惡性腫瘤具有潛在治療作用。

1 資料和方法

1.1 試劑 胰酶、堿性成纖維生長因子(fibroblast growth factor-basic, bFGF)(Sigma-Aldrich公司)，M199 培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)(GIBCO公司)，Hoechst33342試劑(Invitrogen公司)，二甲基噻唑-二苯基溴化四唑(MTT)試劑(Bio Besic 公司)，Cell-LightTMEdU Apollo 567 In Vitro Kit(RibBio技術(shù)公司)，Trizol reagent(美國生命技術(shù)公司)，乳酸脫氫酶(LDH)活性測定試劑盒(南京建成生物技術(shù)公司)，SYBR Green Master(羅氏公司)。

1.2 HUVECs分離和培養(yǎng) 按照文獻方法[5]，HUVECs從人臍靜脈中分離得到，本研究得到南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會核準(#2012-SR-153)。分離過程簡要概括如下：首先，以0.25%胰酶消化臍靜脈，分離得到內(nèi)皮細胞，然后將內(nèi)皮細胞生長于含有10% FBS、100 U/mL青霉素-鏈霉素、0.5 ng/mL bFGF的M199培養(yǎng)基中, 在含有5% CO2的孵箱中37°C培養(yǎng)，每2～3 d換1次培養(yǎng)基。實驗采用2～5代的細胞。

1.3 MTT實驗 生長在24孔板中的HUVECs與相應(yīng)濃度LA作用相應(yīng)時間后，按此前報道的方法[6]，進行MTT測定。簡要方法為，培養(yǎng)體系中加入40μL5 mg/mL MTT孵育4 h，將形成的甲臜以300μL二甲基亞砜進行溶解，然后以分光光度計(Synergy HT, Bio-Tek, USA)在570 nm波長處讀取吸光值(OD)。

1.4 RNA提取和定量PCR實驗 與LA (500μmol/L) 孵育48 h后，收集HUVECs，按此前報道方法[7]，以Trizol reagent提取細胞總RNA，溶劑處理組被設(shè)為對照組。2μg RNA 以oligo (dT) 為引物逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后采用以SYBR Green為標記的定量PCR分析C-myc、Cyclin-D1 mRNA表達水平,β-actin被設(shè)為內(nèi)參照。用于實驗的C-myc引物為： GGCTCCTGGCAAAAGGTCA (正向)、CTGCGTAGTTGTGCTGATGT (反向)，Cyclin-D1引物為GCTGCGAAGTGGAAACCATC (正向)、 CCTCCTTCTGCA-CACATTTGAA (反向),β-actin引物為TGTTACCAACTGGGACGACA (正向)、 TCTCAGCTGTGGTGGTGAAG (反向)。

1.5 EdU摻入實驗 本實驗按照試劑說明書進行。與LA (500μmol/L) 孵育48 h后，生長于24孔板中的HUVECs與EdU孵育2 h，然后以Hoechst 33342染色細胞核。數(shù)據(jù)以EdU陽性細胞核的比例表示。

1.6 LDH滲漏實驗 與LA (500μmol/L) 孵育48 h后，收集HUVECs細胞培養(yǎng)上清，按照LDH活性測定試劑盒說明書測定培養(yǎng)上清中的LDH活性。LDH滲漏以其在上清中的活性占總LDH活性的比例表示，總LDH活性=(LDH在培養(yǎng)上清中的活性)+(0.2 % Tween 20裂解細胞液中的LDH 活性)。

1.7 核固縮分析 與LA (500μmol/L) 孵育48 h后，收集HUVECs，按此前報道方法[8]，以Hoechst 33342對細胞核染色，觀察核固縮情況。首先，將生長于24孔板中的HUVECs 進行固定(50%甲醇 + 50% 丙酮)10 min，然后與Hoechst 33342 (0.4 g/mL) 常溫孵育 5 min，封片后以熒光顯微鏡觀察、拍照 (Axiovert 200，Zeiss)，在200倍放大的視野下，隨機選取3個視野進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 LA降低HUVECs活力

2.1.1 LA對HUVECs活力影響的劑量-效應(yīng)關(guān)系：用不同劑量的LA (300、500、1000μmol/L)刺激HUVECs 48 h，以0μmol/L LA為對照組，MTT結(jié)果如圖1a 所示。與對照組相比，300μmol/L的LA未顯著降低細胞活力，但500、1000μmol/L 的LA分別使HUVECs活力顯著降低了12.7%和33.2% (P<0.05或P<0.01)。因此，500μmol/L被選擇為下列實驗的LA濃度。

2.1.2 LA對HUVECs活力影響的時間-效應(yīng)關(guān)系：用500μmol/L LA刺激HUVECs不同時間 (12、24、48和72 h)，以0 h為對照組,MTT結(jié)果如圖1b 所示。與對照組相比，LA刺激 12、24 h后，細胞活力無顯著變化；但當刺激時間延長至48、72 h后, HUVECs活力分別顯著降低了17.2%和31.9% (P<0.05或P<<0.01)，提示LA呈時間依賴性抑制HUVECs活力。據(jù)此，48 h被選擇為LA對HUVECs的刺激時間。

2.2 LA抑制HUVECs增殖 如圖2所示，與未經(jīng)LA作用的對照組相比，LA (500μmol/L) 刺激48 h后，EdU-陽性細胞數(shù)顯著減少了55.7% (P<0.01)。這些數(shù)據(jù)提示，LA顯著抑制HUVECs增殖。

注：圖1a：與0 μmol/L比較，* P<0.05，** P<0.01；圖1b：與0 h 比較，*P<0.05，**P<0.01圖1 LA降低細胞活力(n=3)

注：標尺=100 μm圖2 LA抑制細胞增殖(n=3)

2.3 LA抑制增殖相關(guān)基因表達 如圖3a、3b所示，與對照組比較，LA (500μmol/L) 刺激48 h后,C-mycmRNA 水平顯著降低了20.0% (P< 0.05)，而CyclinD1 mRNA 水平無顯著改變。Western blot結(jié)果顯示，LA降低C-Myc蛋白質(zhì)表達，而對Cyclin-D1蛋白質(zhì)表達無影響，見圖3c、3d。

注：圖3a:與對照組比較，*P<0.05；圖3c：與對照組比較，*P<0.05圖3 LA抑制細胞增殖相關(guān)基因表達(n=3)

2.4 LA不引起細胞死亡 由于HUVECs活力在LA刺激后顯著降低，并發(fā)現(xiàn)LA顯著抑制HUVECs增殖。為了進一步排除LA降低細胞活力與細胞死亡有關(guān)，本研究進行了如下2個實驗。

2.4.1 LDH測定：LDH在細胞培養(yǎng)上清中的活性常用于細胞損傷，特別是細胞壞死和細胞凋亡評價，因此本研究進行了LDH滲漏實驗。與對照組相比，LA (500μmol/L)刺激48 h的HUVECs培養(yǎng)上清LDH活性無顯著變化。見圖4a。

注：圖4a：LDH滲漏情況比較；圖4b：核固縮情況比較圖4 LA不引起HUVECs細胞死亡(n=3)

2.4.2 細胞核固縮分析：如圖4b所示，LA處理組與對照組之間的細胞核固縮情況無顯著差異。

3 討論

內(nèi)皮細胞增殖是血管新生起始階段的關(guān)鍵過程，也是某些因素如血管內(nèi)檢查或治療引起血管內(nèi)皮損傷以后的修復所必需。然而血管新生是一把雙刃劍，可促進某些疾病的修復，也可促進某些疾病的病情進展。例如，血管新生可促進缺血性心肌損傷、缺血性腦損傷的修復；然而，血管新生也可促進腫瘤、糖尿病視網(wǎng)膜病變等疾病的進展。因此，抑制血管生成在臨床治療中可改善腫瘤病人的生存時間[9]。由此可見，根據(jù)病情需要進行血管新生的靶向調(diào)節(jié)至關(guān)重要，而內(nèi)皮細胞增殖的調(diào)節(jié)則是相關(guān)調(diào)節(jié)的關(guān)鍵。

LA是人類食物中天然存在的一種化合物，可以作為代謝酶的輔助因子，具有抗氧化特性。研究顯示，某些抗氧化物質(zhì)如乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine)和epigallocatechin-3-gallate (綠茶的主要成分)具有顯著抑制血管新生的生物學作用[10-11]。值得關(guān)注的是，除了作為食物補充，LA 已經(jīng)成功地應(yīng)用于外周神經(jīng)病變、視網(wǎng)膜病變、疼痛、心臟自主神經(jīng)病變以及其他糖尿病并發(fā)癥的臨床治療，至今已有20多年歷史[12-13]。不僅如此，孕婦使用LA未見明顯不良反應(yīng)，顯示了LA的安全性[14]。然而，LA對上述疾病的治療作用是否與內(nèi)皮細胞相關(guān)機制有關(guān)尚不清楚。近期臨床證據(jù)表明，LA作為食物補充劑在防治代謝相關(guān)性疾病如糖尿病高血糖、糖尿病血管病變、多發(fā)性硬化癥、AD、癡呆、女性子宮內(nèi)膜異位相關(guān)性骨盆疼痛中有積極作用。動物實驗證據(jù)也提示，LA在創(chuàng)傷性面癱、缺血-再灌注損傷、神經(jīng)退變、衰老、射線損傷、潰瘍性結(jié)腸炎、某些藥物毒性中也具有保護作用，這些作用可能與LA的抗氧化作用有關(guān)，但確切機制尚有待進一步闡明[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn)LA對內(nèi)皮細胞增殖有顯著抑制作用，提示LA可能作為人類疾病抗血管新生的潛在治療藥物。

為探尋LA是如何抑制內(nèi)皮細胞增殖的，筆者分析了LA對C-Myc和Cyclin-D1表達水平的影響。C-Myc是一個多功能的核轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控多種生物學過程如發(fā)育、增殖和分化等[17]。Cyclin-D1 可促進細胞周期，在G1-S 轉(zhuǎn)變中起關(guān)鍵作用，在細胞增殖、生長調(diào)控、線粒體活性調(diào)節(jié)、DNA修復等生物過程中具有重要作用[18]。本研究發(fā)現(xiàn)LA顯著降低C-MycmRNA 水平,但對Cyclin-D1 mRNA 水平無顯著影響，提示下調(diào)C-Myc表達可能參與了LA對內(nèi)皮細胞增殖的抑制作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，LA對內(nèi)皮細胞增殖具有抑制作用，提示除了在某些糖尿病并發(fā)癥的臨床治療外，LA可能對需要抑制血管新生的疾病如腫瘤等也具有潛在治療作用，與此相反，LA對需要血管新生進行修復的疾病如心肌梗死等則是有害的。本研究結(jié)果對進一步完善LA臨床治療的適應(yīng)證、禁忌證提供了新的實驗依據(jù)。