左依凡 陳兵

1 多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)概述

MM是一種多發(fā)于>60歲人群的漿細胞惡性腫瘤，約占血液系統(tǒng)惡性腫瘤10%～15%[1]，是血液系統(tǒng)第二大常見惡性腫瘤。典型特征是在骨髓(bone morrow，BM)內(nèi)漿細胞的惡性增殖[2]，伴或不伴有外周血和(或)其他髓外組織，如骨、軟組織或皮膚的浸潤[3]。已有研究表明,意義未明的單克隆丙種球蛋白病(monoclonal gammopathy of undetermined significance，MGUS)是MM的前體階段[4]。MGUS是最常見的漿細胞腫瘤，每年約有1%的MGUS病人發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化[4]。MM病人也可能發(fā)展為最具侵襲性的漿細胞腫瘤亞型，即漿細胞白血病(plasma cell leukemia, PCL)，其特征是血液中循環(huán)漿細胞(circulating plasma cell, CPC)>2×109/L。在這種情況下，惡性漿細胞不再依賴于骨髓基質(zhì)而是在外周血中循環(huán)。

目前，MM仍不可治愈。在過去的十年中，隨著蛋白酶體抑制劑(proteasome inhibitors, PIs)、免疫調(diào)節(jié)劑(immunomodulatory drugs, IMiDs)及單克隆抗體等新藥的臨床應(yīng)用，MM病人的總體生存率明顯提高，但生存率存在顯著差異。因此，我們需要重視和加強對疾病的監(jiān)測與管理。傳統(tǒng)的外周血/尿免疫球蛋白、游離輕鏈、骨髓異常漿細胞、影像學檢查等檢測手段已難以滿足MM復(fù)雜的預(yù)后判斷。新的檢測項目和方法，對MM預(yù)后因素和危險分層的評估、確定治療策略、治療效果以及預(yù)后預(yù)測具有重要意義。本文將對CPC在MM中的意義和檢測現(xiàn)狀做一綜述。

2 CPC

在實體瘤和大多數(shù)血液惡性腫瘤(包括漿細胞腫瘤)中，腫瘤擴散和遠處轉(zhuǎn)移最常見的方式是釋放腫瘤細胞進入血液循環(huán)。循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cell，CTC)是指從原發(fā)腫瘤或轉(zhuǎn)移腫瘤部位釋放到循環(huán)中的細胞，其也在漿細胞腫瘤中被發(fā)現(xiàn), 流式細胞術(shù)可通過其表面標記物對其檢測。CPC很早就在PCL病人的血液中被檢測到，也在相當一部分MM病人中被檢測到，在MGUS病人中檢測到的較少[5]。惡性漿細胞會離開BM，通過循環(huán)進入外周血，然后再特異性歸巢到BM壁龕或其他某些器官或組織，形成局部微轉(zhuǎn)移灶，以一種“轉(zhuǎn)移/擴散”方式將疾病擴散到整個BM及髓外組織[6]。

1962年，Ginsberg 研究團隊首次證實CPC在MM病人中存在[7]，此后大量相關(guān)研究陸續(xù)開展。2013年P(guān)aiva等[8]進一步研究了CPC表型、細胞遺傳學和功能特征以及晝夜分布。結(jié)果表明，CPC代表了BM克隆漿細胞的一個獨特亞群，其特征是整合素(CD11a/CD11c/CD29/CD49d/CD49e)、黏附(CD33/CD56/CD117/CD138)和激活分子(CD28/CD38/CD81)的下調(diào)。此外，將CPC與BM基質(zhì)細胞共培養(yǎng)時，其大多處于靜止狀態(tài)，且具有較高的克隆發(fā)生潛能。MM病人每日外周血中CPC絕對數(shù)量有顯著波動，在凌晨4:00～12:00達到峰值，下午16:00～24:00達到最低點。這表明在MM病人中，CPC 在休息期間可能會流出至外周血以定植/轉(zhuǎn)移至除BM的其他部位。

3 CPC與MM關(guān)系

CPC的存在在單克隆免疫球蛋白疾病的各階段都是高危標志，其對疾病進展風險具有預(yù)測作用。研究顯示，外周血中CPC的存在與MGUS[9]和冒煙型骨髓瘤(smoldering multiple myeloma, SMM)[10]惡性轉(zhuǎn)化為有癥狀MM的風險增加相關(guān)。Kumar等[9]對325例診斷為MGUS病人的外周血CPC進行了分析，結(jié)果顯示與無CPC病人相比，有CPC病人進展為另一種漿細胞疾病(最常見的是MM)的可能性是前者2倍(OR=2.1,P=0.03)。Bianchi等[10]使用免疫熒光法對91例SMM病人外周血CPC進行檢測，結(jié)果表明，伴有高水平CPC(定義為外周血漿細胞>5%)SMM病人在診斷后2～3年內(nèi)進展風險增高。Gonsalves等[11]也對100例SMM病人外周血CPC通過流式細胞術(shù)進行評估，結(jié)果顯示CPC的存在與更短的進展時間(time to progression，TTP)相關(guān)[10個月vs未達到(P<0.001)]。有研究表明，血液中CPC的數(shù)量從MGUS(CPC中位數(shù)為0.008/μL)到SMM(中位數(shù)為0.16/μL)和MM(中位數(shù)為1.9/μL)逐漸增加[12]。王晶等[13]對17例MM病人[髓外漿細胞瘤(extramedullary plasmacytoma,EMP)陰性者8例，EMP陽性者9例]采用流式細胞術(shù)對CPC進行檢測，結(jié)果顯示EMP陽性組CPC陽性率明顯高于EMP陰性組(88.9%比25.0%，P=0.008)，這對病人是否有髓外轉(zhuǎn)移具有重要的提示作用。

外周血中CPC可能與侵襲性生物學(較高的增殖率、較高的細胞遺傳異常發(fā)生率和血管生成增加)相關(guān)[14]。CPC被認為是干細胞樣腫瘤漿細胞，血液中CPC數(shù)量的增加可能會導(dǎo)致腫瘤更快、更廣泛地擴散到整個BM及髓外部位，這就可以解釋血液中較高的CPC計數(shù)與該病侵襲性特征之間的關(guān)聯(lián)[12]。Nowakowski等[15]的研究也證實了上述觀點。然而，Gonsalves等[16]認為CPC可能與腫瘤負荷存在正相關(guān)性。無論采用形態(tài)學還是流式細胞術(shù)方法，血液中CPC水平高的MM病人BM漿細胞比例都較高。未來還需要更大樣本進一步驗證CPC與腫瘤負荷確切的相關(guān)性。

3.1 新診斷多發(fā)性骨髓瘤(newly diagnosed multiple myeloma，NDMM) 在NDMM病人中，約75%的病人外周血中檢測到CPC，CPC的數(shù)量被證明是整體生存的獨立預(yù)測因子[15]。即使流式細胞術(shù)或免疫熒光檢測到非常少的CPC，對于NDMM病人，其預(yù)后也較差[14]。Nowakowski等[15]研究結(jié)果表明，CPC>10個的病人中位總生存期(overall survival，OS)明顯少于CPC<10個的病人(37.3個月比58.7個月,P=0.001)。在新藥治療時代，Gonsalves等[16]對157例NDMM病人(96%病人采用PIs/IMiDs為主的新藥誘導(dǎo)治療)的外周血CPC采用流式細胞術(shù)進行評估結(jié)果顯示，CPC≥400個組和CPC<400個組病人的中位至下次治療時間(time to next treatment，TTNT)分別為14個月和26個月(P<0.001)，2組對應(yīng)的中位OS分別為32個月和未達到(P<0.001),且CPC≥400個組病人的國際分期系統(tǒng)(international staging system,ISS)分期、肌酐水平、漿細胞標記指數(shù)、骨髓漿細胞百分比、存在熒光原位雜交法(FISH)高危因素病人比例均高于CPC<400個組病人。在多變量分析中，CPC≥400個對OS及TTNT的負面影響均具有統(tǒng)計學意義。在新藥時代，CPC的檢測不僅可以評估NDMM病人預(yù)后，也可以預(yù)測自體造血干細胞移植(autologous stem cell transplantation，ASCT)后的早期復(fù)發(fā)[14]。Chakraborty等[17]分析了247例新藥誘導(dǎo)治療后早期行ASCT的NDMM病人，分別在診斷時和移植前用流式細胞術(shù)對其CPC進行評估。結(jié)果顯示，診斷時CPC陽性的病人中，誘導(dǎo)治療后CPC轉(zhuǎn)陰與移植后無進展生存期(progression-free survival，PFS)和OS的顯著改善有關(guān)。然而，與在診斷時和ASCT前沒有檢測到CPC的病人相比，他們的生存率仍然較低。移植后嚴格意義的完全緩解(stringent complete response，sCR)在CPC-/-組為32%，在CPC+/-組為30%，在CPC+/+或-/+組為12%(P=0.018)。ASCT后3組的中位PFS分別為30、24和14個月，5年總生存率分別為83%、70%和43%(P<0.001)。 Gonsalves等[18]的另一項研究對556例NDMM病人外周血CPC進行分析，將那些≥5 CPCs/μL且修訂的國際分期系統(tǒng)(Revised International Staging System, R-ISS)Ⅰ期或Ⅱ期的病人重新分類為R-ISS ⅡB期。在診斷時，有、無CPC的病人中位TTNT和OS分別為25個月比43個月(P<0.001)和54個月比89個月(P<0.001)。診斷時≥5 CPCs/μL的病人，其TTNT和OS如下：R-ISS Ⅰ期為40個月和未達到； R-ISSⅡ期為30個月和72個月；R-ISSⅡB期為21個月和45個月，R-ISS Ⅲ為20個月和47個月。可見R-ISS ⅡB期的病人TNNT和OS與R-ISS Ⅲ期相似。由此表明，將CPC數(shù)量納入目前R-ISS分期系統(tǒng)能使NDMM病人的預(yù)后評估更準確。

3.2 復(fù)發(fā)難治性多發(fā)性骨髓瘤(relapsed or refractory multiple myeloma，RRMM) 對于RRMM病人，復(fù)發(fā)后需要重新分層指導(dǎo)治療。RRMM的不良預(yù)后包括初診已經(jīng)存在或新近獲得的高危細胞遺傳學異常、高β2微球蛋白和(或)低血清白蛋白(即ISS Ⅲ期)、異常乳酸脫氫酶、輕鏈或IgA型、腎功能不全和髓外疾病[19]。緩解時間短、進展快、既往治療較多也是不良預(yù)后的預(yù)測因素[20]。Gonsalves等[21]將上述因素納入647例接受連續(xù)治療的RRMM病人中進行研究，采用流式細胞術(shù)對其外周血CPC進行評估。結(jié)果顯示，CPC在完全緩解(complete response，CR)病人中均陰性。在疾病穩(wěn)定(stable disease，SD)病人中，CPC的存在預(yù)示中位生存期較差(22個月比未達到;P=0.004)，在疾病進展(progressive disease, PD)病人中，CPC≥100個(流式細胞儀收集150 000個細胞時)預(yù)示生存期較差(12個月比33個月;P<0.001)。該研究強調(diào)CPC檢測在疾病處于CR或SD病人中的重要性。Rawstron等[22]報道了治療后CPC數(shù)量下降的趨勢，RRMM的早期CPC狀態(tài)可能具有預(yù)后價值，并有助于識別最終對挽救治療有反應(yīng)或失敗的病人。RRMM病人在第一個治療周期后CPC不降低可能有助于早期識別對該治療有耐藥性的病人[23]。目前對RRMM病人CPC的研究較少。

4 CPC作為新生標志物

CPC的臨床意義及其隨時可及性為疾病的診斷和評估帶來了新視角，有望將CPC納入新的危險分層標準，評估病情、指導(dǎo)治療。Abe等[24]研究了PET-CT結(jié)合定量CPC對MM病人的預(yù)后價值。結(jié)果表明，除了腫瘤負荷外，這2個參數(shù)可能反映骨髓瘤略微不同的生物學特征，并且它們作為預(yù)后標記可能相互補充。PET-CT結(jié)合定量CPC系統(tǒng)的預(yù)后表現(xiàn)獨立于高危的細胞遺傳異常狀態(tài)(CAs)或R-ISS(這是已知最強大的預(yù)后因素)，提示該系統(tǒng)可以用來補充和改進已建立的分層策略。未來對更多病人的CPC及其對應(yīng)的骨髓漿細胞的橫向、縱向基因組和免疫表型研究將進一步闡明其發(fā)病機制和在疾病進展中的作用。

由于CPC在MM病人外周血中數(shù)量較少，因此其檢測一直是一個挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)細胞學是檢測MM病人血液中存在大量CPC的一種簡便、快速的方法，但由于評估的有核細胞數(shù)量有限和它們的形態(tài)相似性，通常不能準確地將其從正常/反應(yīng)漿細胞中區(qū)分出來，特別是在CPC數(shù)量較低的病人中。因此，免疫熒光顯微技術(shù)隨后被采用。它可以更靈敏、準確地評估MM病人血液中的CPC[9]。這項技術(shù)可以檢測10 000個單核細胞中的1個克隆漿細胞(靈敏度為10-4)，從而提高了傳統(tǒng)細胞學的靈敏度。但該技術(shù)存在靈敏度相對有限、費時費力、CPC純度低等局限性，阻礙了其在許多實驗室的常規(guī)應(yīng)用[25]。流式細胞術(shù)作為一種簡單、快速(<4 h)、經(jīng)濟和通用的方法，已被廣泛用于鑒定、表征和計數(shù)MM病人血液中的CPC[25]。通過流式細胞儀可以識別出50%～75%NDMM病人中的CPC，具體取決于標記物和使用的特異性抗體組的數(shù)量，分析的細胞數(shù)以及樣品制備方案[26]。但目前缺乏標準化的方案(抗體選擇及每個樣品分析的細胞數(shù)量的異質(zhì)性)，檢測CPC的靈敏度水平不穩(wěn)定，以及對新鮮樣品(<24～48 h)的需求也限制了結(jié)果的可重復(fù)性，也因此限制了其更廣泛的用途和適用性。下一代流式細胞術(shù)(next-generation flow cytometry, NGF)與傳統(tǒng)的流式細胞術(shù)(8～10色)相比，靈敏度和可重復(fù)性更高[27]。最近NGF也被用于檢測MM病人血液中CPC[12]。近年來，Allele-specific oligonucleotide定量聚合酶鏈反應(yīng)(ASO-qPCR)和下一代測序(next generation sequencing，NGS)等分子技術(shù)也應(yīng)運而生。它們是用于檢測和定量CPC的高特異性和靈敏性(<10-5～10-6)的分子方法[28]。與ASO-qPCR相比，NGS是一種更靈敏、適用度更廣的分子技術(shù)。ASO-qPCR和NGS等分子技術(shù)不需要新鮮樣品，因為它們可以使用存儲的血液衍生核酸來評估CPC[29]。但其檢測周期較長，無法及時反映CPC狀態(tài)，且其對CPC及MM病人的相關(guān)性仍需進行大量研究。綜上，流式細胞術(shù)是目前在臨床及科研領(lǐng)域應(yīng)用檢測 CPC的最佳方法。

5 存在問題及展望

綜上所述，CPC作為一個新的預(yù)后生物標志物，其存在與疾病進展、不良的細胞遺傳學、較低的總生存率和較高的復(fù)發(fā)率有關(guān)，同時可預(yù)測侵襲性疾病進展，在評估NDMM和RRMM病人的預(yù)后中發(fā)揮著重要作用。有關(guān)CPC的生物學特征和病理生理機制有待進一步研究。