于紅梅，袁華招，關(guān) 玲，陳曉東，唐山遠(yuǎn)，王慶蓮，趙密珍

（1江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所，江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京210014；2句容市白兔草莓研究院，江蘇鎮(zhèn)江212403）

0 引言

草莓(Fragaria ananassaDuch)屬薔薇科草莓屬多年生草本植物，其色澤艷麗，風(fēng)味獨(dú)特，營(yíng)養(yǎng)豐富，素有“水果皇后”之美譽(yù)[1]。因其種植周期短、見效快、經(jīng)濟(jì)效益高、適應(yīng)性強(qiáng)，已成為中國(guó)一些農(nóng)村地區(qū)的經(jīng)濟(jì)支柱。據(jù)中國(guó)園藝學(xué)會(huì)草莓分會(huì)統(tǒng)計(jì)，2018年中國(guó)草莓總面積超17萬(wàn)hm2，總產(chǎn)量500萬(wàn)t，在所有農(nóng)作物中草莓的增幅位居前茅，已成為世界第一草莓生產(chǎn)大國(guó)和第一消費(fèi)大國(guó)，占世界總產(chǎn)量的50%以上[2-4]?！靶〔葺?，大產(chǎn)業(yè)”，隨著草莓鮮果產(chǎn)業(yè)不斷蓬勃發(fā)展壯大，育苗產(chǎn)業(yè)的快速興起，市場(chǎng)對(duì)草莓鮮果和種苗提出了耐儲(chǔ)運(yùn)、損耗小、質(zhì)量更優(yōu)的新要求。

“見苗三分收”，種苗質(zhì)量是草莓安全優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)的基礎(chǔ)，而運(yùn)輸種苗對(duì)整個(gè)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展也是至關(guān)重要的。最近幾年，隨著物流運(yùn)輸業(yè)的快速發(fā)展和草莓經(jīng)濟(jì)效益的穩(wěn)定提高，專業(yè)化異地育苗加速了進(jìn)程，并呈快速擴(kuò)大態(tài)勢(shì)。專業(yè)苗圃向云貴川和東北等夏季冷涼地區(qū)轉(zhuǎn)移，育苗環(huán)境得到了改善，種苗質(zhì)量得到了保證，但長(zhǎng)距離運(yùn)輸帶來(lái)了種苗發(fā)熱、脫水等生理脅迫問題。另外，草莓設(shè)施栽培定植時(shí)間比較集中，在8月下旬到9月中旬市場(chǎng)對(duì)種苗需求量大，短時(shí)間供需難以平衡，也制約草莓育苗產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[5-6]。為緩解種苗供需不平衡和運(yùn)輸途中技術(shù)障礙，目前在草莓苗貯藏技術(shù)方面開展了對(duì)草莓生長(zhǎng)發(fā)育及果實(shí)性狀的穴盤苗變溫補(bǔ)光、低溫保濕等應(yīng)用研究[7-8]，及低溫脅迫對(duì)種苗生理指標(biāo)變化的保護(hù)機(jī)制[9-10]，但未能將低溫貯藏期生理變化對(duì)種苗質(zhì)量、定植移栽后物候期以及產(chǎn)量的影響有機(jī)結(jié)合。本試驗(yàn)探索草莓裸根苗低溫貯藏的生理變化以及經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間冷藏后對(duì)后期生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)量的影響，旨在為草莓裸根苗冷藏和運(yùn)輸技術(shù)提供參考，利于建立草莓種苗冷藏和運(yùn)輸體系。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料與設(shè)計(jì)

1.1.1 供試材料 試驗(yàn)于2017年8月下旬—12月下旬在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院溧水植物基地和江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。供試草莓品種為‘寧玉’，采用大田土壤繁殖的匍匐莖子苗，去掉子苗根部的泥土，篩選出長(zhǎng)勢(shì)一致、大小相近的子苗作為供試驗(yàn)種苗。

1.1.2 材料處理 將篩選出的600株種苗分成3組，于起苗當(dāng)天將根部泥水保濕置于泡沫盒密封，并于5℃低溫冷庫(kù)貯藏。

1.1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)Ⅰ：低溫貯藏條件下草莓裸根苗的生理變化。分別于貯藏后1、3、8、14、21天取10株草莓種苗的根和葉，用液氮處理置-80℃保存，重復(fù)3次，測(cè)定根和葉的生理和激素指標(biāo)。

試驗(yàn)Ⅱ：低溫貯藏后對(duì)草莓裸根苗的物候期以及生長(zhǎng)發(fā)育的影響。分別于貯藏后1、3、8、14、21天取20株草莓種苗移栽定植大棚，重復(fù)3次，調(diào)查物候期和統(tǒng)計(jì)產(chǎn)量。

1.1.4 栽培管理 每條高架定植試驗(yàn)草莓種苗2行，行距20 cm、株距15 cm。栽種時(shí)選用生長(zhǎng)一致3葉以上的種苗，定植后連續(xù)微噴保濕促活。試驗(yàn)高架管理方法與其他高架一致。

1.2 指標(biāo)測(cè)定

1.2.1 生理生化指標(biāo) 種苗生理生化指標(biāo)試驗(yàn)總超氧化物歧化酶(SOD)和過(guò)氧化物酶(POD)活性以及可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸、丙二醛(MDA)和葉綠素含量均采用紫外分光光度法測(cè)定[11-13]。每生物學(xué)重復(fù)均稱取草莓待測(cè)組織約0.5 g放于研缽中研磨，具體提取方法及酶活力的測(cè)定方法參照南京建成生物工程研究所(www.njjcbio.com)生產(chǎn)的保護(hù)酶活力測(cè)定試劑盒說(shuō)明書。

1.2.2 內(nèi)源激素測(cè)定 稱取液氮中研磨待測(cè)組織約0.1 g于5 mL離心管，加入1 mL提取液（2-丙醇：H2O:HCL=2:1:0.002），4℃條件下，震蕩提取30 min，再加入2 mL二氯甲烷震蕩提萃取30 min，然后13000 r/min離心5 min。取下清液2 mL到棕色玻璃管中，氮?dú)獯担ú煌耆蹈桑缓笥?00μL甲醇溶解，0.22μm過(guò)濾，采用Agilent Technologies LC-MS 6490型檢測(cè)。液相條件：色譜柱型號(hào)Agilent Poroshell 120 EC-C18，流動(dòng)相為超純水(H2O)和乙腈(MeOH)，洗脫梯度如表1所示，進(jìn)樣量5μL，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，外標(biāo)法；質(zhì)譜條件：正離子模式，補(bǔ)償電壓為4 kV，氣壓為45 psi，溫度為350℃，透鏡電壓為135 V。

表1 HPLC洗脫梯度

1.2.3 物候期及產(chǎn)量 根據(jù)《草莓種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》調(diào)查物候期，并統(tǒng)計(jì)各處理草莓產(chǎn)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫貯藏條件下草莓裸根苗根和葉的生理變化

2.1.1 對(duì)草莓種苗葉綠素含量的影響 葉綠素是植物光合作用的重要場(chǎng)所，檢測(cè)葉綠素含量的多少可從側(cè)面說(shuō)明低溫、無(wú)光環(huán)境是否適宜貯藏草莓裸根苗。由圖1可知，在同樣低溫條件下，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，‘寧玉’草莓葉片葉綠素a，葉綠素b含量以及葉綠素a/b比值均呈現(xiàn)降低趨勢(shì)。葉綠素a前8天含量下降緩慢，幅度0.09 mg/g，8天后下降速度有所加快，幅度0.28 mg/g；葉綠素b始終緩慢下降，前后速度變化不大，幅度只有0.10 mg/g；而葉綠素a/b比值雖有下降趨勢(shì)，但比值始終在2以上。說(shuō)明5℃低溫、無(wú)光的環(huán)境一方面降低種苗呼吸，減少能耗，也可能激發(fā)生理活性保護(hù)種苗從而延長(zhǎng)種苗保存時(shí)間。

圖1 低溫貯藏時(shí)間對(duì)草莓種苗葉綠素的影響

2.1.2 對(duì)草莓種苗保護(hù)酶活性的影響 抗氧化系統(tǒng)SOD和POD是植物防御系統(tǒng)重要的保護(hù)酶，反映植物氧化代謝水平的高低，其酶的活性高有利于保持植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性，可以提高細(xì)胞對(duì)不良環(huán)境抗性的作用。低溫貯藏后草莓植株葉片和根系總SOD活性總體表現(xiàn)為下降（圖2A、B），POD活性表現(xiàn)為上升（圖2D）；而在相同貯藏時(shí)間下表現(xiàn)出葉片中總SOD明顯低于根系（圖2C），而POD截然相反，表現(xiàn)為根系明顯低于葉片（圖2D）；從貯藏到結(jié)束，葉片中總SOD下降46.52%，其中8天下降幅度最大18.08%，POD上升幅度40.13%，8天后上升幅度明顯緩慢；根系中總SOD下降14.68%，POD上升428.73%。以上結(jié)果說(shuō)明低溫貯藏脅迫草莓植株，體內(nèi)SOD和POD活性應(yīng)急改變以提高抵御低溫逆境的能力。

圖2 低溫貯藏時(shí)間對(duì)草莓種苗保護(hù)酶活性的影響

2.1.3 對(duì)草莓種苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)及丙二醛含量的影響MDA是膜脂過(guò)氧化的主要最終產(chǎn)物，常被作為判斷膜脂過(guò)氧化作用的一個(gè)主要指標(biāo)，其含量的高低反映了膜系統(tǒng)受害的水平。低溫貯藏后草莓植株MDA含量的影響由圖3，A可知，葉片的MDA含量始終高于根系，且隨著低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，表現(xiàn)先降低后升高波動(dòng)趨勢(shì)，1～3天短時(shí)間低溫貯藏，MDA明顯下降18.45%，之后MDA有所升高，8天再次出現(xiàn)峰值達(dá)89.82%，在整個(gè)低溫貯藏過(guò)程中，葉片的MDA始終是降低的，21天貯藏結(jié)束降至88.85%。而根系的MDA含量表現(xiàn)為先升高后降低，變化趨勢(shì)與葉片基本一致，但反應(yīng)滯后于葉片，說(shuō)明MDA在低溫貯藏過(guò)程中抵御脅迫，發(fā)揮保護(hù)作用。

圖3 低溫貯藏時(shí)間對(duì)草莓種苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)及丙二醛(MDA)的影響

圖3B顯示，在低溫貯藏過(guò)程中草莓植株根系的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)脯氨酸、可溶性糖含量均發(fā)生不同程度的變化。脯氨酸表現(xiàn)為先升高后下降，3天出現(xiàn)峰值達(dá)到250.12%，在下降的過(guò)程中，3～8天下降幅度較大104.57%，8天后平穩(wěn)下降至結(jié)束，21天脯氨酸含量117.57%。在受到低溫脅迫后，可溶性糖含量前期隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，結(jié)束時(shí)有所反彈。以上結(jié)果說(shuō)明在低溫貯藏的脅迫下，脯氨酸積極發(fā)揮調(diào)節(jié)胞質(zhì)和液泡之間的滲透液的平衡功能，前期快速積累保護(hù)可溶糖等滲透脅迫的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，穩(wěn)定細(xì)胞膜完整性，提高植株抗逆能力。

2.2 低溫貯藏條件下草莓裸根苗短縮莖的內(nèi)源激素變化

內(nèi)源激素是植物體內(nèi)產(chǎn)生的一些微量而能調(diào)節(jié)自身生理過(guò)程的有機(jī)化合物，如IAA、ABA、GA3對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育有重要的調(diào)控作用。圖4A結(jié)果顯示IAA先降低在升高，1～3天急速下降，8天出現(xiàn)峰谷，下降了60.1%；ABA結(jié)果顯示低溫貯藏變化趨勢(shì)與IAA剛好相反（圖4B），3天急速上升，8天出現(xiàn)峰值，增加了11.63倍；觀察圖4C發(fā)現(xiàn)GA3變化與IAA前期表現(xiàn)一致，不同的是前期下降速度緩慢，3～14天之間變化幅度較大，且隨著低溫貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)后期又下降。以上結(jié)果說(shuō)明植株在受到低溫脅迫時(shí)，啟動(dòng)IAA、ABA、GA3抗寒物質(zhì)生成，調(diào)節(jié)代謝對(duì)抗低溫，維持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)功能，使種苗安全休眠。

圖4 低溫貯藏時(shí)間對(duì)草莓內(nèi)源激素IAA、ABA和GA3的影響

2.3 低溫貯藏后對(duì)草莓裸根苗物候期生長(zhǎng)發(fā)育的影響

2.3.1 低溫貯藏后對(duì)草莓物候期的影響 從表2可以看出，與低溫貯藏1天相比，3天對(duì)草莓物候沒有影響，但定植期可以晚2天；貯藏8天定植期推遲7天，顯蕾期推遲3天，盛花期推遲1天，始熟期推遲4天，說(shuō)明從定植到顯蕾期縮短了4天、盛花期縮短了6天，始熟期提早了3天；而低溫貯藏14～21天則表現(xiàn)為，從定植到顯蕾期縮短了5～9天、盛花期縮短了0～3天，始熟期推遲了4～6天。以上結(jié)果表明，低溫貯藏不同程度地促進(jìn)草莓花芽分化進(jìn)程，明顯縮短定植到盛花期的間隔時(shí)間，且低溫處理小于8天始熟期可以提早，大于14天始熟期推遲。

表2 低溫貯藏時(shí)間對(duì)草莓物候的影響

2.3.2 低溫貯藏后對(duì)草莓產(chǎn)量的影響 從表3可知，低溫貯藏前1～8天各處理單株總產(chǎn)量差異不大，14～21天各處理也沒有明顯差異，但8天前后2個(gè)階段的總產(chǎn)量存在顯著差異，其中冷藏3天總產(chǎn)量最高331.25 g，14天總產(chǎn)量最低269.79 g。觀察各個(gè)單月產(chǎn)量發(fā)現(xiàn)，12月份之前，處理1天的產(chǎn)量顯著高于其他處理，且低溫處理時(shí)間短有單株產(chǎn)量高的趨勢(shì)；1—2月份單月產(chǎn)量表現(xiàn)為先升高降低再升高的趨勢(shì)，低溫處理8天出現(xiàn)峰值后，21天產(chǎn)量再次峰值；再統(tǒng)計(jì)比較發(fā)現(xiàn)，3月份之前低溫處理8天產(chǎn)量最高，合計(jì)231.36 g，與處理小于3天相差35.09～37.16 g，說(shuō)明8天低溫利于提高草莓早期產(chǎn)量。

表3 低溫貯藏時(shí)間對(duì)草莓產(chǎn)量的影響

3 討論

不同貯藏條件是影響草莓苗儲(chǔ)存質(zhì)量最重要的環(huán)境因子，直接影響著草莓苗植株體內(nèi)一切生理變化，也是影響草莓移栽定植、生長(zhǎng)發(fā)育等最基本的要素[14-17]。低溫是抑制草莓苗呼吸生長(zhǎng)采用的常規(guī)技術(shù)手段，也是促進(jìn)草莓花芽分化技術(shù)措施之一[18-19]。在自然狀態(tài)下，生產(chǎn)上莓農(nóng)通常就近起苗及時(shí)定植，或者12℃短時(shí)間預(yù)冷，加冰塊裝箱遠(yuǎn)距離運(yùn)輸發(fā)苗，時(shí)間控制在48 h之內(nèi)。本研究在低溫5℃無(wú)光照情況下，研究貯藏期間草莓苗的生理變化以及經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間冷藏后對(duì)后期生長(zhǎng)發(fā)育等指標(biāo)，擬建立草莓種苗冷藏和運(yùn)輸體系。試驗(yàn)結(jié)果表明‘寧玉’草莓葉片葉綠素a，葉綠素b含量以及葉綠素a/b比值均呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，而葉綠素a/b比值始終在2以上，初步說(shuō)明5℃低溫，無(wú)光照環(huán)境可以安全貯藏草莓苗，本試驗(yàn)雖然沒有直接得出在低溫5℃下光照強(qiáng)弱對(duì)葉綠素影響不大的結(jié)論，但驗(yàn)證了2009年張廣華[20]研究的結(jié)論，進(jìn)一步明確溫度在低溫貯藏過(guò)程中的主導(dǎo)作用，同時(shí)引起其他生理指標(biāo)發(fā)生變化。低溫貯藏后草莓苗葉片和根系的SOD和POD活性發(fā)生了變化，SOD活性總體下降，POD活性總體上升，與2015年何雨溈[21]研究在4℃低溫條件下結(jié)果一致；本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)低溫貯藏前8天SOD和POD活性變化幅度較大，筆者沒有查到相關(guān)文獻(xiàn)，推測(cè)草莓根系泥水保濕8天，前期抵御外界脅迫依靠自身儲(chǔ)存的能量，后期植株根系開始萌動(dòng)參與抵御低溫脅迫；另外葉片、根系中的SOD和POD活性含量不同，一方面保護(hù)酶自身是對(duì)溫度敏感性不同，另一方面植株不同部位細(xì)胞結(jié)構(gòu)存在區(qū)別。比如，MDA也是葉片中含量始終高于根系，在整個(gè)低溫貯藏過(guò)程中，葉片中的丙二醛始終降低，變化趨勢(shì)表現(xiàn)先降低后升高，第8天出現(xiàn)峰值達(dá)89.82%，21天貯藏結(jié)束降至88.85%；而根系中的MDA變化趨勢(shì)表現(xiàn)為先升高，14天降低至峰谷，本研究得出二者變化趨勢(shì)基本一致結(jié)論是基于根系低溫接觸面小于葉片，機(jī)制反應(yīng)滯后所致；在抵御低溫脅迫的過(guò)程中丙二醛變化趨勢(shì)有波動(dòng)，說(shuō)明MDA作為判斷膜脂過(guò)氧化作用的主要指標(biāo)，影響脯氨酸、可溶性糖等滲透物質(zhì)的代謝反應(yīng)。2015年林建忠[9]研究結(jié)果表明低溫脅迫可溶性糖在8 h峰值后開始下降；2019年白春雷[22]研究利用低溫鍛煉的方式對(duì)草莓進(jìn)行處理，結(jié)果表明可溶性糖在24 h峰值后下降，但含量始終是增加的結(jié)論一致；與此同時(shí)，白春雷研究還表明脯氨酸也在24 h呈現(xiàn)出降低的態(tài)勢(shì)，但總體含量升高。本文以第1天貯藏指標(biāo)為參照，結(jié)果表明根系中的可溶性糖含量表現(xiàn)下降趨勢(shì)至14天達(dá)峰谷，后期有所反彈；而脯氨酸表現(xiàn)為先升高，3天后達(dá)到峰值后下降，分析數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)丙二醛與可溶性糖同時(shí)在14天處于峰谷，驗(yàn)證了丙二醛將體內(nèi)儲(chǔ)存的淀粉轉(zhuǎn)化為糖相關(guān)性；脯氨酸是植物蛋白質(zhì)的組分之一，廣泛存在于植物體中，與可溶性糖等滲透物質(zhì)等聯(lián)合發(fā)揮調(diào)節(jié)胞質(zhì)和液泡之間的滲透液的平衡功能，穩(wěn)定細(xì)胞膜完整性，提高植株抗逆能力。

植物休眠一般認(rèn)為受控于赤霉素、生長(zhǎng)素類促進(jìn)物質(zhì)與脫落酸類抑制物質(zhì)相互作用，也是對(duì)草莓低溫脅迫起應(yīng)答反應(yīng)，其內(nèi)源激素IAA、GA3和ABA也會(huì)發(fā)生變化[10,15]。一方面，細(xì)胞中IAA、GA3含量降低，抑制草莓植株生長(zhǎng)，促進(jìn)氣孔關(guān)閉，降低蒸騰和呼吸作用，并維持較高的葉綠素、可溶性糖和脯氨酸含量等以適應(yīng)環(huán)境；另一方面，細(xì)胞中ABA迅速積累減弱草莓植株體內(nèi)滲透物質(zhì)的合成，并調(diào)節(jié)ABA、GA3、IAA平衡以發(fā)揮抵御低溫的調(diào)節(jié)效應(yīng)。本研究中，前8天促進(jìn)物質(zhì)類赤霉素GA3、生長(zhǎng)素IAA明顯降低，抑制物質(zhì)類脫落酸ABA迅速上升，這與前人對(duì)草莓內(nèi)源激素[10,15]應(yīng)答低溫相應(yīng)研究結(jié)果一致；而8天后內(nèi)源激素變化可能與草莓植株體內(nèi)后期生理代謝調(diào)節(jié)物質(zhì)控制密切相關(guān)。

低溫貯藏不同時(shí)間引起草莓裸根苗的生理、內(nèi)源激素發(fā)生變化，也會(huì)間接影響物候和產(chǎn)量。本研究結(jié)果表明低溫貯藏不同程度地可以促進(jìn)草莓花芽分化進(jìn)程，縮短定植到盛花期的間隔時(shí)間，且低溫處理小于8天始熟期可以提早，單株總產(chǎn)量差異不大，而低溫處理大于14天始熟期推遲，總產(chǎn)量顯著下降。如果同時(shí)定植不同冷藏時(shí)間的草莓種苗，是否得到相同結(jié)論有待進(jìn)一步研究。筆者分析處理8天，定植時(shí)間是9月7日，外界自然溫度適合草莓生長(zhǎng)發(fā)育，利于花芽順利分化；而低溫貯藏14天，隨著外界溫度降低，定植時(shí)間的延后，草莓生長(zhǎng)發(fā)育開始緩慢，期物候間隔拉長(zhǎng)、成熟期推遲，同時(shí)期的產(chǎn)量也顯著降低。

4 結(jié)論

筆者認(rèn)為種苗體內(nèi)生理指標(biāo)和內(nèi)源激素IAA、GA3、ABA相互協(xié)作，在低溫脅迫過(guò)程中都起著重要的調(diào)控作用。雖然作用機(jī)理十分復(fù)雜，但都調(diào)節(jié)自身含量應(yīng)對(duì)低溫脅迫從而提高適應(yīng)能力。本研究結(jié)果表明5℃低溫可以安全貯藏草莓裸根苗。冷藏小于8天可以促進(jìn)花芽分化，縮短物候之間時(shí)間，減少果實(shí)發(fā)育天數(shù)，4月之前單株總產(chǎn)量高于322.74 g，顯著高于大于14天處理。建議生產(chǎn)上根據(jù)最佳定植時(shí)間，種苗低溫貯藏運(yùn)輸時(shí)間控制在8天以內(nèi)較為安全。