黃劍強，魏雯璐 ，鐘如卓，張家煒，楊創(chuàng)業(yè) ,2，王慶恒 ,2

（1廣東海洋大學水產學院，廣東湛江524088；2廣東省海水養(yǎng)殖生物育種工程實驗室，廣東湛江524088）

0 引言

Ritossa[1]首次發(fā)現短暫的熱休克能誘導果蠅唾液腺染色體在3個區(qū)域出現膨突，該區(qū)帶轉錄加強，這一現象被稱為“熱休克反應(Heat shock response,Hsr)”。1974年，有研究工作者[2]在對果蠅唾液腺細胞進行熱休克處理后，分離出一種特殊蛋白質，并證實該蛋白的合成能引起果蠅幼蟲染色體蓬松的現象，這種在熱刺激下產生的蛋白質，被稱為熱休克蛋白(Heat shock proteins,Hsp)。熱休克蛋白70(Heat shock proteins 70,Hsp70)家族，普遍存在于原核及真核生物中，是一類高度保守性的蛋白質[3]。其結構主要分為多肽結合區(qū)、ATP酶區(qū)和功能不明區(qū)三部分[4]，參與蛋白質正確折疊、環(huán)境抗逆、細胞凋亡和免疫反應等許多重要生理活動[5]。Hsp70家族可分為4個主要的成員：（1）誘導型 Hsp70(72 kDa)；（2）組成型 Hsc70(73 kDa)；（3）位于內質網的葡萄糖調節(jié)蛋白（GRP78或Bip，78 kDa）；（4）位于線粒體的Mtp70(75 kDa)[6-7]。其中Hsc70在正常生理和環(huán)境下具有較為穩(wěn)定的表達，參與了蛋白質的成熟[8]、蛋白質向細胞器的轉運[9]、胞吞作用[10]以及調節(jié)細胞凋亡[11]等重要過程。在卵母細胞中，Hsc70 mRNA的沉默會導致燈刷染色體轉錄可逆性的抑制[12]。此外，Hsc70還參與類固醇受體的成熟和信號傳導[13]。這些研究均表明Hsc70對性腺乃至卵母細胞的發(fā)育具有重要的作用。

光裸星蟲(Sipunculus nudus)俗稱沙蟲，味道鮮美，營養(yǎng)豐富[14]，廣泛分布于沿海暖水性潮間帶，為中國華南地區(qū)重要的珍貴海產品之一，具有較高的經濟價值[15]。近年來，由于近岸環(huán)境的污染以及破壞式采捕行為，光裸星蟲的自然資源量明顯下降，這促使廣東湛江、廣西北海、海南儋州等地沿海地區(qū)逐漸開展了光裸星蟲的繁殖生物學研究[16-17]和人工養(yǎng)殖試驗[18]。然而，目前光裸星蟲苗種的質量和產量處于很不穩(wěn)定的狀態(tài)，苗種人工繁殖主要受到了光裸星蟲精卵發(fā)生的不同步性制約[19]，且光裸星蟲繁殖生物學的研究主要集中在形態(tài)學上[16,20]，對于分子機制上研究較少。

本研究通過RACE技術獲得光裸星蟲Sn-hsc70的cDNA全長，并對其進行生物信息學及表達分析，探討Sn-hsc70在光裸星蟲卵母細胞發(fā)育過程中的作用。研究結果為深入認識光裸星蟲卵母細胞發(fā)育的分子機制積累基礎資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用材料來自湛江市下六鎮(zhèn)，均為有活力、無損傷、規(guī)格基本一致(12.92±1.68 g)的光裸星蟲。

用無菌海水沖洗光裸星蟲體表的泥沙，雌雄分開，隨機選取30尾雌蟲，使用2.5 mL無菌注射器抽取體腔液，分離不同時期的卵母細胞，具體方法參考王慶恒等[16]和張家煒[21]，使用100目、150目、300目、500目的細胞篩將卵母細胞按照直徑大小分為O1-O4四個時期（O1：＜48 μm，卵黃形成初期；O2：48～108 μm，卵黃旺盛合成前期；O3：108～150 μm，卵黃旺盛合成后期；O4：＞150 μm，成熟期），收集到腎管中的卵母細胞為O5時期樣品，從腎管中自然排放體外的卵母細胞為O6時期樣品。試驗在廣東海洋大學水產學院實驗室，于2018年6月份進行。

1.2 Sn-hsc70基因全長cDNA克隆

按照Trizol法提取上述實驗樣品的總RNA，NanoDrop 1000微量紫外/可見分光光度計檢測所提取RNA的濃度和質量，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA是否有降解、污染等。選擇經過上述步驟確認合格的RNA樣品依據Reverse Transcriptase M-MLV(NaseH)說明書進行反轉錄合成cDNA。反轉錄產物置于-20℃保存，備用。利用引物設計軟件Primer Premier 6.0，按照引物設計原則設計Sn-hsc70的引物，見表1。

表1 Sn-hsc70基因克隆及熒光定量的引物序列

1.3 Sn-hsc70序列分析

將測序結果導入DNAMAN 8軟件并對其進行拼接，得到Sn-hsc70序列全長；通過在線分析工具ORF Finder預測Sn-hsc70的開放閱讀框(Open Reading Frame,ORF)和并翻譯出氨基酸序列；ProtParam進行蛋白質的理化性質和二級結構預測；ProtScale預測蛋白親水性；NCBI Blast進行氨基酸序列的同源性分析；Phyer2預測蛋白質的三級結構；Pfam進行保守結構域預測；使用Mega X軟件構建生物系統進化樹。在線工具的網址為：ORF Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder)；ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）；NCBI Blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)；Phyer2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/～phyre2/html/page.cgi?id=index)； Smart (http://smart.embl-heidelberg.de/)；MEME (http://memesuite.org/index.html)；ProtScale (https://web.expasy.org/protscale/)。

1.4 Sn-hsc70差異表達分析

以60S-L7作為內參基因[19]，通過實時熒光定量PCR(real-time PCR)技術在Roche LightCycler?96在系統上檢測Sn-hsc70基因在光裸星蟲卵子發(fā)生各個階段的差異表達。實驗設置3組重復，具體PCR流程參照張家煒等[19]。分析熒光定量PCR結果，SPSS軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，顯著性水平P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 Sn-hsc70基因序列特征分析

Sn-hsc70基因cDNA全長2516 bp，其中5'UTR為 114 bp；3'UTR 為 429 bp，ORF為 1971 bp，編碼656個氨基酸。推導的Sn-Hsc70蛋白除了具有3個Hsp70蛋白家族的3個特征序列(IDLGTTYS、IFDLGGGTFDVSIL、IVLVGGSTRIPKIQK)外，還具Hsc70蛋白特有的連續(xù)重復的四肽序列(GGXP)；此外Sn-Hsc70蛋白具有2個核定位序列(DAKRL、KRKYKKDISDNKRAVRR)以及羧基端（C端）的胞質定位序列（EEVD）（圖1）。

圖1 Sn-hsc70 cDNA序列全長及推導的氨基酸序列

2.2 Sn-Hsc70蛋白序列分析

蛋白理化性質預測表明Sn-Hsc70蛋白分子量為71.65 kDa；親水性氨基酸比例遠高于疏水性氨基酸（圖2），總平均親水性(grand averageofhydropathy,GRAVY)為-0.46，屬于親水性蛋白。信號肽及跨膜結構域預測顯示Sn-Hsc70蛋白無信號肽和跨膜結構。蛋白功能位點預測發(fā)現，Sn-Hsc70蛋白具有5個N-糖基化位點、1個cAMP和cGMP依賴的蛋白激酶磷酸化位點、5個蛋白激酶C磷酸化位點、16個酪蛋白激酶II磷酸化位點、1個酪氨酸激酶磷酸化位點、20個N-肉豆蔻酰化位點、1個酰胺化和1個ATP/GTP結合位點。Sn-Hsc70蛋白二級結構預測發(fā)現α螺旋、β轉角、延伸鏈和無規(guī)卷曲分別占整體的40.70%、7.77%、18.14%和33.38%。

圖2 Sn-Hsc70蛋白殘基親水性分布圖

2.3 Hsc70同源蛋白多序列比對

對Sn-Hsc70以及武昌魚(Megalobrama amblycephala,ACC93993.2)、鰱魚(Hypophthalmichthys molitrix,EU816594.1)、草魚(Ctenopharyngodon idella,EU816595.1)、智人 (Homo sapiens,CAA68445.1)、萊桑池蛙(Pelophylax lessonae,ACY69995.1)、非洲爪蟾(Xenopuslaevis,AAH41201.1)、紫海膽(Strongylocentrotus purpuratus,XP_802129.1)、長牡蠣(Crassostrea gigas,AJ305315.1)的同源Hsc70蛋白進行多序列比對，發(fā)現同源Hsc70蛋白之間共有的3個Hsp70家族特征序列高度保守。羧基端（C端）具有連續(xù)多次重復的四肽序列(GGXP)以及胞質定位序列(EEVD)（圖3）。

圖3 Hsc70同源蛋白多序列比對

2.4 Sn-Hsc70蛋白三級結構分析

分別對光裸星蟲、雙齒圍沙蠶(Perinereis aibuhitensis,ADR66514.1)和櫛孔扇貝(Azumapecten farreri,AAO38780.1)的Hsc70進行蛋白三級結構的預測分析。結果顯示3個Hsc70同源蛋白三級結構高度保守（圖4）。

圖4 光裸星蟲(a)、雙齒圍沙蠶(b)和櫛孔扇貝(c)的Hsc70蛋白三級結構

2.5 Sn-Hsc70系統發(fā)育和結構域分析

對13條Hsc70同源蛋白序列進行系統發(fā)育樹構建和結構域預測。結果表明Hsc70蛋白系統發(fā)育樹分為無脊椎動物和脊椎動物兩大支，在無脊椎動物中又細分為兩支，一支屬于棘皮動物，另一支包括了軟體動物、星蟲動物以及環(huán)節(jié)動物。光裸星蟲先與雙齒圍沙蠶聚為一支，再與可口革囊星蟲聚為一支（圖5）。13條Hsc70同源蛋白均具有一個Hsp70蛋白家族結構域，除了長牡蠣結構域較短外，其余12條Hsc70同源蛋白的位置及長度較為一致。

圖5 同源Hsc70的系統發(fā)育樹及結構域

2.6 Sn-hsc70表達模式分析

利用qRT-PCR檢測了Sn-hsc70在卵母細胞6個發(fā)育時期的表達情況。結果顯示，Sn-hsc70在光裸星蟲卵母細胞發(fā)育的各個時期均有表達，整體表達模式呈單峰型。在體腔液發(fā)育時期(O1-O4)表達量呈上升趨勢，其中O3和O4時期Sn-hsc70表達量顯著高于其他時期(P＜0.05)。進入腎管后(O5)Sn-hsc70表達量迅速下降，直到卵母細胞的外排后(O6)Sn-hsc70的表達維持在較低的水平，O5和O6無顯著性差異(P＞0.05)。

3 討論

Hsp70家族蛋白包含4個主要成員，其中誘導型的Hsp70與組成型的Hsc70兩者在序列和功能上具有較高的相似性[22]。研究表明，Hsc70與Hsp70均具有Hsp70蛋白家族的3個特征序列(IDLGTTYS、IFDLGGGTFDVSIL、IVLVGGSTRIPKIQK)，不同的是Hsc70蛋白C端具有多個連續(xù)重復的四肽序列(GGXP)，而Hsp70在大多數情況下僅有一個GGXP序列[23-24]。本研究發(fā)現Sn-Hsc70蛋白具有Hsp70家族的3個特征序列，C端具有4個連續(xù)重復的GGXP序列，這些證據表明本研究所克隆獲得的cDNA序列為hsc70基因。

生物信息學分析發(fā)現Sn-Hsc70屬于親水性蛋白，在功能位點的搜索中發(fā)現了多個蛋白質磷酸化位點及糖基化位點。研究表明蛋白質磷酸化在信號轉導和調控中起著至關重要的作用，糖基化在蛋白質折疊，寡聚化，質量控制，分類和運輸中具有重要的功能[25]。這與Hsc70蛋白參與了類固醇受體的成熟與信號傳導以及蛋白質的折疊、組裝和運輸等過程相吻合[26-27]。

圖6 Sn-hsc70在卵母細胞各發(fā)育時期的相對表達量

在正常條件下，Hsc70存在于細胞核及細胞質中，它有助于胞質蛋白（如細胞周期蛋白D1）的入核轉運，因此Hsc70蛋白被認為能在細胞質和細胞核之間移動[28-30]。本研究對包括Sn-Hsc70在內的9條Hsc70同源蛋白進行多序列比對發(fā)現所有Hsc70同源蛋白均具有胞質定位序列(EEVD)和兩個核定位序列；這與Hsc70介導胞質蛋白入核轉運功能相吻合。Sn-Hsc70同時具有胞質及細胞核定位序列，推測Sn-Hsc70可能介導了卵母細胞質中一些胞質蛋白的入核轉運。此外，EEVD通過靜電相互作用介導熱休克蛋白組織蛋白(Hsp-organizing protein,Hop)與Hsc70和Hsp90的結合，有助于轉錄因子、激酶以及類固醇激素等底物的組裝和成熟[31]。Sn-Hsc70末端的EEVD序列可能通過與分子伴侶的結合參與某些蛋白的組裝與成熟過程。

研究表明hsc70在人卵巢和胚胎中具有豐富表達，其表達水平遠超肌動蛋白和微管蛋白[32]，這暗示了hsc70對性腺和胚胎發(fā)育具有重要的作用。光裸星蟲生殖方式較為特別，無肉眼可見的性腺，卵母細胞游離于體腔液中發(fā)育，當營養(yǎng)物質積累完成后，卵母細胞被腎管收集，進行短暫的儲存后由腎口排放于海水中[29]。本研究檢測了Sn-hsc70在卵母細胞6個不同發(fā)育時期的表達量，結果表明在體腔液發(fā)育過程中(O1-O4)Sn-hsc70的表達逐漸上升，其中從卵黃合成初期進入卵黃旺盛合成期時(O2-O3)表達量顯著上調。研究表明光裸星蟲卵母細胞在體腔液發(fā)育過程中可能經歷了G1-P I期（減數分裂間期的G1、S、G2和第一次減數分裂前期P I）[21]，而該減數分裂過程是在一些性激素的調控下啟動的[33]。有研究表明hsc70會響應雌激素和孕激素的刺激而表達量上升[34]。這暗示了體腔液中性激素的刺激可能是導致Sn-hsc70在O1-O4時期表達量上升的原因之一。

一般來說卵母細胞發(fā)育過程一般會經歷1～2次停滯過程；第一次停滯發(fā)生在PI期，此時形成燈刷染色體(lampbrush chromosome)，并進行旺盛的轉錄翻譯過程，為后期胚胎發(fā)育積累充足的營養(yǎng)物質、卵源mRNA以及酶等的物質[35]。有研究表明hsc70參與了卵母細胞燈刷染色體的轉錄活動[12]以及新生蛋白的折疊、組裝、轉移等過程[12]。在光裸星蟲卵母細胞體腔液發(fā)育過程中，卵黃等營養(yǎng)物質的大量積累[16]，這可能與Sn-hsc70在O3和O4時期的大量表達有關，說明Snhsc70可能對卵黃形成具有重要作用，而與燈刷染色體之間的關系還有待深入研究。

光裸星蟲脫離體腔液后，卵母細胞失去了體腔液營養(yǎng)物質的供應，蛋白的合成減弱；此時卵母細胞停滯在第一次減數分裂的中期，燈刷染色體凝縮，轉錄也減弱。本研究發(fā)現，光裸星蟲卵母細胞脫離體腔液后(O5-O6)Sn-hsc70的表達大幅下降，且表達量顯著低于其他時期(P＜0.05)。這可能與卵母細胞脫離體腔液環(huán)境、轉錄與蛋白質合成減弱等過程有關。

4 結論

Sn-hsc70基因全長2516 bp，具有3個Hsp70家族特征序列，2個核定位序列，1個胞質定位序列，以及4次連續(xù)重復的GGXP序列。胞質定位序列與核定位序列與Hsc70在細胞質和細胞核之間穿梭的功能相吻合；連續(xù)重復的GGXP以及3個Hsp70特征序列是鑒定Hsc70蛋白的重要依據。Sn-hsc70在體腔液發(fā)育時期的快速上升可能對卵黃積累具有重要作用；脫離體腔液后，Sn-hsc70表達量顯著下調可能與卵母細胞轉錄與蛋白質合成減弱等有關。