尹 國(guó)，路正營(yíng)，孫 璐，張彥波，李世云

（邯鄲市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，河北邯鄲056001）

0 引言

陸地棉，屬錦葵科、棉屬一年生草本植物，是一種國(guó)家重要戰(zhàn)略物資。棉鈴蟲(chóng)曾在中國(guó)各大棉區(qū)大面積發(fā)生，轉(zhuǎn)Bt抗蟲(chóng)棉的種植，已基本控制了棉鈴蟲(chóng)的發(fā)生。然而，蚜蟲(chóng)和紅蜘蛛等次生害蟲(chóng)逐漸成為危害棉花生長(zhǎng)的主要害蟲(chóng)，嚴(yán)重影響棉花產(chǎn)量和品質(zhì)[1]。目前生產(chǎn)上主要依靠農(nóng)藥控制蚜蟲(chóng)和紅蜘蛛，一方面增加了植棉成本，另一方面容易造成環(huán)境污染。因此，培育抗蚜蟲(chóng)和紅蜘蛛的棉花新品種，利用作物自身的抗性防治蚜蟲(chóng)和紅蜘蛛成為育種家急需攻克的一個(gè)難題。

金花葵(Abelmoschus manihot)，又名菜芙蓉、野芙蓉，是屬錦葵科、秋葵屬的一年生草本植物，和棉花一樣具有無(wú)限開(kāi)花結(jié)果習(xí)性。其對(duì)蚜蟲(chóng)和紅蜘蛛具有一定程度上天然的抗性，可在葉柄和葉背面分泌一種鹽晶狀顆粒物，但其對(duì)棉鈴蟲(chóng)不具有抗性。二者同屬錦葵科作物，親緣關(guān)系較近，具有相似的花器官和結(jié)構(gòu)。相較于陸地棉，金花葵的果實(shí)較為早熟。前人從不同方面，例如遠(yuǎn)緣雜交的方法、幼胚拯救、雜交種農(nóng)藝性狀變異、果實(shí)成分變化、雜交種純度和真實(shí)性等方面對(duì)遠(yuǎn)緣雜交進(jìn)行了深入的研究，獲得了大量數(shù)據(jù)，利用遠(yuǎn)緣雜交創(chuàng)制新的種質(zhì)資源并獲得成功的案例已有大量報(bào)道，徐鳳等[2]研究了22常綠杜鵑遠(yuǎn)緣雜交種子萌發(fā)特性，證實(shí)雖然杜鵑花屬種間雜交可以獲得種子，但是很多組合產(chǎn)生的種子不具有活力。鄭本川等[3]的研究結(jié)果顯示遠(yuǎn)緣雜交后代單株產(chǎn)量和農(nóng)藝性狀與親本存在較大差異。劉國(guó)彬等[4]板栗和錐栗之間可以進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交，并獲得了結(jié)實(shí)率較高的組合。楊利平等[5]對(duì)百合科作物進(jìn)行了遠(yuǎn)緣雜交并對(duì)雜交種的純度進(jìn)行了鑒定。王學(xué)芳等[6]利用甘藍(lán)型油菜與白菜，通過(guò)種間雜交創(chuàng)造出了早熟油菜新種質(zhì)。但是，目前關(guān)于金花葵的研究成果相對(duì)較少，其染色體倍性和條數(shù)以及以金花葵和陸地棉為親本的遠(yuǎn)緣雜交未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，對(duì)其遺傳特性和親和力知之甚少。因此，本研究利用遠(yuǎn)緣雜交技術(shù)將金花葵gDNA導(dǎo)入陸地棉，希望在其后代中找到有價(jià)值的符合育種目標(biāo)性狀的種質(zhì)資源，這一研究也是培育抗蚜蟲(chóng)和紅蜘蛛的早熟陸地棉新品種的有益嘗試。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料‘金花葵3號(hào)’和陸地棉種子‘邯818’，均為邯鄲市農(nóng)業(yè)科學(xué)院自育品種。如圖1所示兩種植物主要不同器官之間的差異。

圖1 ‘金花葵3號(hào)’和‘邯818’主要器官差異

1.2 方法

1.2.1 ‘金花葵3號(hào)’根尖染色體壓片鏡檢 利用沙培法培養(yǎng)‘金花葵3號(hào)’，當(dāng)根尖長(zhǎng)至1～1.5 cm時(shí)剪取根尖進(jìn)行試驗(yàn)，采用任文娟[7]、李心[8]、丁海燕[9]和李曉玲等[10]提供的方法壓片鏡檢，用0.002 mol/L 8-羥基喹啉及4℃低溫處理根尖[11]，預(yù)處理5 h?？ㄖZ固定液固定24 h并利用蒸餾水充分清洗后，用1 mol/L HCl 60℃解離6～10 min，改良的卡寶品紅染液染色，壓片鏡檢[12]。挑選染色體形態(tài)完整、分散性較好的中期壓片拍照[13]。

1.2.2 遠(yuǎn)緣雜交

（1）培育幼苗，用500 mg/L濃度的縮節(jié)胺溶液分別處理金‘花葵3號(hào)’和‘邯818’各18 h。采用常規(guī)沙培法培育幼苗，‘邯818’于4月18日播種，‘金花葵3號(hào)’于4月30日播種，二者錯(cuò)期播種育苗，以利于二者于7月中上旬實(shí)現(xiàn)花期相遇。設(shè)置溫度為30℃，光照和黑暗環(huán)境培養(yǎng)各12 h，直至幼苗長(zhǎng)出。

（2）幼苗長(zhǎng)出后，待幼苗長(zhǎng)至3 cm高時(shí)，噴灑300 mg/L濃度的縮節(jié)胺2～3次，對(duì)幼苗進(jìn)行化控，防止出現(xiàn)高腳苗，促進(jìn)幼苗主莖變粗壯，為接下來(lái)二者的嫁接做好準(zhǔn)備。

（3）待二者的主莖達(dá)到2.5～3.0 mm時(shí)，以陸地棉幼苗為砧木，以金花葵幼苗為接穗將二者進(jìn)行嫁接，促進(jìn)兩種作物營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和遺傳物質(zhì)的交流，提高二者開(kāi)花期做雜交時(shí)的親和性。同時(shí)，留下部分‘金花葵3號(hào)’和‘邯818’幼苗自然生長(zhǎng)。

（4）待嫁接苗完全成活后，轉(zhuǎn)移至室內(nèi)靠近窗戶(hù)的地方，在通風(fēng)弱光的環(huán)境中進(jìn)行煉苗，3～5天后待嫁接苗足夠強(qiáng)壯時(shí)，將嫁接苗一分為二，移栽至編號(hào)為Z和z的兩個(gè)防蟲(chóng)網(wǎng)大棚中；同樣，將‘邯818’一分為二，移栽至編號(hào)為M和m的兩個(gè)防蟲(chóng)網(wǎng)大棚中，‘金花葵3號(hào)’幼苗移栽至編號(hào)為J的防蟲(chóng)網(wǎng)大棚中，防止開(kāi)花期做雜交時(shí)蜜蜂和昆蟲(chóng)傳粉，形成假雜交鈴。

（5）待嫁接苗和‘邯818’均開(kāi)花時(shí)，于每天下午17:00—19:00時(shí)之間，將當(dāng)天Z和M棚中的嫁接苗和‘邯818’的花蕾全部剝開(kāi)去雄，記錄去雄數(shù)量。用手將花冠從基部撕下，保留花萼，用刀片將花絲和花藥全部從花柱上自上而下輕輕刮下，不要損傷花柱和柱頭。將吊牌懸掛于去雄花蕾花柄的基部并記錄去雄日期。仔細(xì)檢查每一棵嫁接苗，確保無(wú)遺漏花蕾（如圖2所示）。

圖2 ‘金花葵3號(hào)’去雄后的花蕾

（6）于第二天上午10時(shí)左右，待z、m棚的嫁接苗和‘邯818’花粉散開(kāi)后，取下花朵，撕下花冠和花萼，分別將z棚中嫁接苗的花粉均勻涂抹M棚中‘邯818’已去雄的柱頭上；同理，將m棚中邯818的花粉均勻涂抹Z棚中嫁接苗已去雄的柱頭上，然后將配制的用于提高遠(yuǎn)緣雜交結(jié)實(shí)率的營(yíng)養(yǎng)液（見(jiàn)表1）用微型注射器在雌蕊的基部各注射3個(gè)點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)5～8 μL，同時(shí)設(shè)置對(duì)照。將嫁接苗和‘邯818’的花冠用剪刀剪成2 cm×2 cm大小的方塊，分別將‘邯818’和嫁接苗的花粉均勻涂抹于方塊上，最后用此方塊將嫁接苗和‘邯818’的柱頭包裹，用紅繩連同柱頭、涂抹方塊和花萼一起捆扎（如圖3所示），避免離體花粉直接暴露在太陽(yáng)紫外線中而過(guò)早失去活力。連續(xù)去雄和授粉10～15天，確保去雄和授粉雜交鈴數(shù)量在200個(gè)以上。

表1 提高遠(yuǎn)緣雜交結(jié)實(shí)率營(yíng)養(yǎng)液成分含量表(1 L)

圖3 遠(yuǎn)緣雜交授粉后苞葉柱頭捆扎方法

（7）每日記錄雜交鈴的生長(zhǎng)發(fā)育情況，包括正常發(fā)育和脫落雜交鈴的數(shù)量等相關(guān)信息。

1.2.3 種子收集 約35天后，待嫁接苗雜交鈴由綠色變?yōu)楹谏磳⒄亚埃瑢⒚總€(gè)雜交鈴連同吊牌一起單獨(dú)裝入一個(gè)網(wǎng)沙袋中，放置太陽(yáng)光下晾曬直至雜交鈴自然開(kāi)裂，將外殼去除，收集雜交鈴種子待用。

1.2.4 發(fā)芽率檢測(cè)將嫁接苗上得到的雜交種，‘金花葵3號(hào)’和‘邯818’種子各50粒，單粒播種在育苗盤(pán)中，放置光照培養(yǎng)箱中，設(shè)置溫度為30℃，光照和黑暗環(huán)境各12 h，記錄雜交種子出苗日期和發(fā)芽率。

1.2.5 雜交種真實(shí)性SSR擴(kuò)增檢測(cè) 待雜交種、‘金花葵3號(hào)’和‘邯818’長(zhǎng)出真葉后，利用宋國(guó)立等[14]、葉磊等[15]、和王沛政等[16]提供的DNA提取方法，同時(shí)提取‘金花葵3號(hào)’、‘邯818’以及雜交種的嫩葉的gDNA，利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)[17-19]篩選出‘金花葵3號(hào)’和‘邯818’特異性引物J-3和H818，引物序列見(jiàn)表2。

表2 引物名稱(chēng)及序列

1.2.6 雜交種根尖染色體壓片鏡檢 方法同1.2.4。

2 結(jié)果與分析

2.1 ‘金花葵3號(hào)’及雜交種根尖染色體壓片鏡檢

通過(guò)‘金花葵3號(hào)’根尖鏡檢結(jié)果得知，‘金花葵3號(hào)’含有66條染色體，核型公式為K(2n)=2x=66，由此可知‘金花葵3號(hào)’為二倍體植物，其花粉和母細(xì)胞應(yīng)含有33條染色體?！?18’為含有52條染色體的異源四倍體陸地棉品種，其花粉含有26條染色體。因此二者的雜交種F1（‘金花葵3號(hào)’為母本）應(yīng)為含有59條染色體的異源三倍體，根尖鏡檢結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了該結(jié)論（圖4）。由于該雜交種為異源三倍體，因此無(wú)法完成有絲分裂，雜交種F1發(fā)芽試驗(yàn)完成后繼續(xù)培養(yǎng)幼苗，花粉全部敗育，并未得到F2。

圖4 ‘金花葵3號(hào)’和雜交種F1根尖染色體鏡檢結(jié)果

2.2 不同授粉處理方法成鈴率比較

由表3可知，以陸地棉‘邯818’為母本的雜交組合，無(wú)論是直接雜交還是注射營(yíng)養(yǎng)液，均未得到正常發(fā)育的雜交鈴，幼鈴一般在授粉后2～5天即脫落。而以‘金花葵3號(hào)’為母本的雜交組合，直接授粉雜交后的207個(gè)雜交鈴，雖然得到了7個(gè)正常發(fā)育的雜交鈴，但是雜交鈴內(nèi)部并未得到正常發(fā)育的雜交種F1（如圖5所示），而授粉后注射營(yíng)養(yǎng)液的210個(gè)雜交鈴，得到了32個(gè)雜交鈴，成鈴率提高了11.8%，且雜交鈴內(nèi)部得到了與自然授粉一樣正常發(fā)育的雜交種F1（如圖6、圖7所示），且發(fā)芽率與‘金花葵3號(hào)’和‘邯818’無(wú)顯著性差異（如表4所示）。

表3 不同雜交方法對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響

表4 不同作物發(fā)芽率統(tǒng)計(jì)

圖5 ‘金花葵3號(hào)’、‘邯818’和雜交種F1gDNA特異性引物PCR檢測(cè)結(jié)果

圖6 嫁接苗雜交后正常發(fā)育但敗育的的金花葵鈴

圖7 嫁接苗雜交注射營(yíng)養(yǎng)液后發(fā)育成的金花葵鈴

2.3 雜交種F1真實(shí)性SSR擴(kuò)增檢測(cè)

利用‘金花葵3號(hào)’和‘邯818’特異性引物分別PCR擴(kuò)增雙方gDNA，分別得到了一條約900 bp和1300 bp清晰的特異性條帶；雙重PCR擴(kuò)增雜交種F1的gDNA，得到了包含900 bp和1300 bp的兩條特異性條帶（如圖5所示），與2.1鏡檢結(jié)果相互印證，證實(shí)雜交種F1為陽(yáng)性，為真實(shí)雜交種。

3 討論與結(jié)論

目前，各種作物利用常規(guī)雜交選育技術(shù)選育新品種仍然是主要方法，但也遇到了諸如親本遺傳資源狹窄以及難于選育突破性品種的局面。雖然遠(yuǎn)緣雜交在一定程度上可以獲得成功，但是其后代還無(wú)法按照育種家設(shè)想的方向整合雙親優(yōu)良性狀并穩(wěn)定遺傳，這需要我們進(jìn)一步探索其內(nèi)在規(guī)律。本研究以‘金花葵3號(hào)’和‘邯818’為親本進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交，同時(shí)獲得了‘金花葵3號(hào)’以及雜交種的染色體倍性和數(shù)量，首次證實(shí)‘金花葵3號(hào)’為基因組含有66條染色體的二倍體植物，為今后繼續(xù)研究遠(yuǎn)緣雜交提供了理論和物質(zhì)基礎(chǔ)。以異源四倍體陸地棉‘邯818’為母本，和‘金花葵3號(hào)’無(wú)論是直接雜交還是注射營(yíng)養(yǎng)液均無(wú)法得到正常發(fā)育的雜交鈴。這一研究結(jié)果和許鳳等[2]的研究結(jié)果相似。以‘金花葵3號(hào)’為母本，雖然直接雜交可以獲得雜交鈴，但是雜交鈴未見(jiàn)正常發(fā)育的雜交種F1籽粒，而注射營(yíng)養(yǎng)液后卻得到了正常發(fā)育的雜交種F1籽粒，且F1可以正常生長(zhǎng)，但是無(wú)法結(jié)實(shí)。由此可見(jiàn)，營(yíng)養(yǎng)液在雜交后幼胚發(fā)育初期有助于幼胚的發(fā)育。因此，在遠(yuǎn)緣雜交研究中，親本的合理選擇對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響很大，這一現(xiàn)象是否與雙親染色體數(shù)目有關(guān)，值得進(jìn)一步研究。我們大膽推測(cè)，以染色體數(shù)量較多的親本為母本，在授粉后外施營(yíng)養(yǎng)液，會(huì)有助于提高雜交成功率和結(jié)實(shí)率。下一步，將通過(guò)染色體加倍技術(shù)使雜交種F1染色體獲得加倍，以期得到花粉可育、性狀穩(wěn)定遺傳的新種質(zhì)。

圖8 自然生長(zhǎng)金花葵自花授粉后發(fā)育成的金花葵成鈴