唐取來，顧力行，周勇，吳寒，祝海川，顧潮江，周經嬌，羅學剛，張同存,

(1.天津科技大學生物工程學院，天津市工業(yè)微生物重點實驗室，天津 300457；2.武漢科技大學生命科學與健康學院，湖北 武漢 430065)

嵌合抗原受體T細胞(chimeric antigen receptor T-Cell,CAR-T)是通過基因改造技術，讓T細胞表達嵌合抗原受體，使效應T細胞的靶向性、殺傷性和持久性均較常規(guī)應用的免疫細胞高，同時可以克服腫瘤局部免疫抑制微環(huán)境和打破宿主免疫耐受狀態(tài)。慢病毒載體是CAR-T基因治療的重要載體，相比一般的逆轉錄病毒載體具有更高的安全性和高效性[1]。近年來，慢病毒載體已被廣泛應用于傳染性疾病、基因功能及惡性腫瘤的基因治療領域[2-3]。探索藥品生產質量管理規(guī)范(good manufacturing practice,GMP )級別規(guī)模化和可重復的慢病毒生產工藝，是臨床試驗和商業(yè)生產的迫切需求[4]。293T細胞是由293細胞派生出來的表達SV40大T抗原的人腎上皮細胞系。作為最常用的慢病毒包裝細胞系，293T采用傳統(tǒng)單層貼壁血清培養(yǎng)方式[5]。但是，血清貼壁培養(yǎng)存在成分復雜、含有動物成分且批次差異等問題[6]，同時貼壁培養(yǎng)過程中胰酶的使用會增加細胞脆性，導致細胞膜破裂。孫克寧等[7]研究表明胰酶的使用會降低慢病毒生產效率。相比較之下，無血清懸浮培養(yǎng)無動物來源的組分，減少了產物外源物質污染的風險，簡化了下游純化工藝，大大推進了其向臨床級別產品的轉變，且重復性好，生產效率高，可大規(guī)模高密度懸浮細胞培養(yǎng)，是哺乳動物細胞培養(yǎng)技術的發(fā)展方向[6]。目前，工業(yè)上使用懸浮細胞系替代貼壁細胞進行生產已經成為趨勢，如MDCK細胞、BHK21細胞[8]以及CHO細胞等[9]。

機械攪拌式生物反應器是比較常見的生物反應器，具有重復滅菌操作、低成本的優(yōu)勢，多用于微生物和動物細胞培養(yǎng)，根據(jù)動物細胞特點，其操作與微生物發(fā)酵罐相似，簡單易行[10]。近年來，機械攪拌式生物反應器逐漸應用于生物制藥行業(yè)[11-12]。攪拌式動物細胞反應器整套系統(tǒng)可智能遠程控制攪拌速度、溫度、pH值和溶氧值[13]等因素。王妍等[14]通過機械攪拌式生物反應器對CHO細胞進行了40 d的培養(yǎng)，得到重組人干擾素。馮二凱等[15]同樣采用攪拌生物反應器對Vero細胞進行培養(yǎng)，得到水貂犬瘟熱活疫苗。然而，機械攪拌式生物反應器細胞培養(yǎng)十分依賴于微載體，在增加成本的同時增加了下游檢測項目，且罕見有用于293T細胞生產慢病毒載體的研究。

機械攪拌式生物反應器L型導管大泡通氣系統(tǒng)可以將大泡經過攪拌變成細小的氣泡，使得混合氣體分散完全，但相比微泡通氣系統(tǒng)存在較高的剪切力和較差的溶氧效果。293T細胞作為貼壁細胞對培養(yǎng)條件極為敏感，因此在不添加微載體前提下用大泡通氣系統(tǒng)攪拌式動物細胞反應器對懸浮293T細胞進行培養(yǎng)和慢病毒包裝具有一定的挑戰(zhàn)[16]。本研究采用馴化的293T懸浮細胞在15 L三葉輪機械攪拌式生物反應器中高密度培養(yǎng)，初步建立了高效、低成本的L型大泡通氣系統(tǒng)機械攪拌式生物反應器293T懸浮細胞慢病毒生產工藝，為慢病毒擴大規(guī)模生產奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞和質粒

貼壁 293T細胞購買于美國模式菌種收集中心(American Type Culture Collection，ATCC)。慢病毒包裝體系及研究平臺由武漢波睿達生物科技有限公司提供。

1.2 培養(yǎng)基和補料

原培養(yǎng)基：體積分數(shù)90%DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)和體積分數(shù)10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)(Gibco公司)；新培養(yǎng)基：體積分數(shù)50%293 CD05 Medium無血清基礎培養(yǎng)基(上海奧浦邁生物科技有限公司)和體積分數(shù)50%SMM293-TⅡ培養(yǎng)基(北京義翹神州生物有限公司)。補料培養(yǎng)基為CHO PFF06培養(yǎng)基(上海奧浦邁生物科技有限公司)。

1.3 貼壁細胞馴化

參照井蓮娜等[17]方法并略有改動。293T貼壁細胞，采用體積分數(shù)0.25%胰酶消化后，細胞活率大于90%按照如下操作。適應馴化的指標細胞活率大于等于90%，且所有細胞3 d完成1次傳代。如表1所示。

表1 293T懸浮細胞馴化的方案Table 1 Protocol of acclimation 293 T suspension cells

方法1：原培養(yǎng)基替換成體積分數(shù)100%新培養(yǎng)基，以6×105個·mL-1細胞密度接種至工作體積為20 mL的125 mL搖瓶。搖床(sk-r1807-S，美國賽洛捷克公司)培養(yǎng)條件為130 r·min-1，體積分數(shù)5% CO2，37 ℃。

方法2：原培養(yǎng)基替換成體積分數(shù)100%新培養(yǎng)基，以4×105個·mL-1細胞密度接種至10 mL的T75方瓶靜置。培養(yǎng)條件為體積分數(shù)5%CO2，37 ℃。

方法3：原培養(yǎng)基替換為體積分數(shù)75%原有培養(yǎng)基和體積分數(shù)25%新培養(yǎng)基，以4×105個·mL-1細胞密度方瓶靜置培養(yǎng)。

方法4：原培養(yǎng)基替換為體積分數(shù)75%原培養(yǎng)基和體積分數(shù)25%新培養(yǎng)基，以6×105個·mL-1細胞密度搖瓶靜置培養(yǎng)。

1.4 慢病毒包裝

靶向CD30蛋白表達質粒(CAR)及包裝質粒(GAG，VSVG，REV) 4株DH5α，振蕩培養(yǎng)過夜后用大提試劑盒提取質粒。四質粒包裝系統(tǒng)利用PEI轉染細胞。293T貼壁細胞以1.4×108細胞總數(shù)接種至細胞工廠(Conning公司)，并且生長匯合至 50%～70%進行轉染，不進行補液，72 h收獲上清液；293T懸浮細胞在搖瓶和生物反應器培養(yǎng)，培養(yǎng)2 d后流加質粒復合物和補料培養(yǎng)基，48 h收獲發(fā)酵液的上清液。

1.5 種子復蘇擴培

馴化后野生型293T懸浮細胞從液氮中取出快速復蘇，37 ℃，置于搖床培養(yǎng)，轉速為130 r·min-1。經傳代逐步放大培養(yǎng)后，接種至機械攪拌式生物反應器。293T貼壁細胞從液氮中取出快速復蘇，37 ℃，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)。經傳代逐步放大培養(yǎng)后，接種至細胞工廠。

1.6 機械攪拌式生物反應器培養(yǎng)

采用15 L三葉輪L型大泡通風系統(tǒng)攪拌型Applikon生物反應器(荷蘭，Z4AEZ0015M)，工作體積為5.5 L。以細胞密度3.5×105～5.0×105個·mL-1接種，添加體積分數(shù)0.1%細胞保護劑(Pluronic?F-68，sigma)溶液后，CO2調節(jié) pH值 7.0～7.2。通過L型大泡通氣系統(tǒng)通入O2/CO2/空氣的混合氣體將溶氧(dissolved oxygen，DO)控制在 40%～70%，全程轉速130 r·min-1，溫度37 ℃，12 h取樣，記錄細胞密度及細胞活率。細胞密度達1.5×106個·mL-1進行慢病毒包裝，24 h流加補料，48 h后收獲培養(yǎng)液。

1.7 檢測方法

細胞計數(shù)和活率檢測[18]：采用血球計數(shù)板點樣計算細胞密度，臺盼藍拒染法計算細胞活率，計數(shù)3次取平均值。

慢病毒包裝效率檢測[19]:將293T貼壁細胞以5×105個·mL-1接種于貼壁6孔板，然后加入3 000×g高速離心25 min(Microfuge 20R，Beckman公司)后的培養(yǎng)液上清和4 mg·L-1polybrene混合物進行培養(yǎng)。3 d后流式測定慢病毒活性滴度。貼壁感染后293T細胞用versene(Gibco公司)消化，用體積分數(shù)2%FBS(Gibco公司)的磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)(Gibco公司)終止消化后300×g離心5 min，山羊抗兔IgG二抗 (HRP)(北京義翹神州科技有限公司)抗體4 ℃避光染色0.5 h，染色后的細胞用PBS，300×g離心5 min。Anti-Mouse FMC63 scFv mAb(BioSwan)抗體與細胞按照V(抗體)∶V(細胞)=1∶50染色，4 ℃避光0.5 h，用PBS，300×g離心5 min，通過流式細胞儀(BD Biosciences公司)測CD30-CAR的陽性細胞(CD30-CAR+)比例，即CD30-CAR慢病毒的包裝效率。通過流式細胞術檢測293T細胞轉染效率并計算活性滴度公式如下：

(1)

式中：q為病毒滴度，指可以感染并進入到細胞中的病毒基因組數(shù)，單位為TU·mL-1，即每mL病毒液中含有具有生物活性的病毒顆粒數(shù)；X為陽性細胞比例；N為病毒終體積，單位為μL。

1.8 統(tǒng)計學分析

應用V10版本Flowjo軟件和8.0版本GraphPad軟件進行圖像處理和數(shù)據(jù)顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 貼壁293T細胞馴化結果

采用4種馴化方法，從貼壁293T細胞中馴化出野生型懸浮293T細胞。如圖1-A所示，方法2和方法4在馴化第1代細胞活率低于30%，與馴化前細胞相比顯著影響細胞活率(P<0.01)。方法3的細胞活率隨培養(yǎng)代數(shù)的增加逐漸下降，在培養(yǎng)到第3代細胞活率低于30%，與馴化前細胞活率相比其影響顯著(P<0.01)。采用方法1馴化的細胞，培養(yǎng)4代細胞活率均大于90%，與馴化前細胞活率相比沒有顯著差異(P>0.05)。試驗采用直接替換培養(yǎng)基和培養(yǎng)器皿的方法1對貼壁293T細胞進行多次馴化，結果一致。復蘇后的懸浮細胞在搖瓶連續(xù)培養(yǎng)14代，如圖1-B所示細胞密度均大于3×106個·mL-1，且細胞活率均大于90%。試驗證明貼壁細胞成功馴化為懸浮293T細胞。

注：A：不同馴化方法下各代293T細胞活率；B：連續(xù)培養(yǎng)14代的細胞生長密度和細胞活率曲線。NS：P>0.05，差異不顯著；*：P<0.05，差異顯著；**：P<0.01，差異極其顯著。下同。Note：A to B：each passage of cell viable with different domestical method(A),the cell density and viable curve with 14 passages(B).NS:P>0.05,no significant difference;*:P<0.05,significant difference;**:P<0.01,highly significant difference .The same as below.圖1 293T懸浮細胞馴化結果Fig.1 Result of acclimation of 293 T suspension cells

2.2 懸浮293T細胞慢病毒包裝效率

懸浮細胞慢病毒包裝效率用流式細胞術檢測，試驗結果如圖 2所示。用 0、0.5、1.0、3.0、10.0、30.0 μL細胞培養(yǎng)病毒原液轉染293T貼壁細胞，其CD30-CAR+細胞比例分別為0%、1.7%、4.0%、10.6%、28.5%和53.7%，通過公式(1)計算得出病毒原液的滴度為1.8×107TU·mL-1，該結果證明馴化后的懸浮293T細胞具有慢病毒包裝能力。

注：圖中比例為流式細胞術分析不同病毒添加體積感染293T貼壁細胞后CD30-CAR+細胞比例。Note：The ratio in figure means flow-based analysis of the ratio of CD30-CAR+ cells after 293T adherent cells were infected with different volume of virus.圖2 搖瓶生產CD30-CAR慢病毒的轉染效率Fig.2 Transfection efficiency of the CD30-CAR lentivirus production in shake flask

2.3 懸浮293T細胞種子擴增

按照1.5的方法，對懸浮293T細胞種子進行擴增，建立1條細胞種子擴增鏈。如表2所示，種子擴增鏈要求每代細胞活率大于90%，細胞密度大于3.0×106個·mL-1。經過二級種子擴增后，得到2.3×109個細胞能夠滿足5.5 L工作體積的生物反應器細胞培養(yǎng)和慢病毒包裝。

表2 293T懸浮細胞搖床培養(yǎng)種子擴增鏈Table 2 Seed train process of 293 T suspension cells using shaking culture

2.4 機械攪拌式生物反應器懸浮培養(yǎng)293T細胞

馴化后的293T懸浮細胞以3.5×105～5.0×105個·mL-1的接種密度，與無血清基礎培養(yǎng)基組成5.5 L的培養(yǎng)體系，在機械攪拌式生物反應器中進行培養(yǎng)。如圖3所示，每12 h取樣計算細胞活率和細胞密度并繪制細胞生長曲線。在5.5 d左右細胞密度隨時間的增加而增加，且細胞活率均大于90%，與種子細胞活率相比沒有顯著差異(P>0.05)；在5.5 d后細胞密度和活率直線下降，6.5 d時細胞密度低于2×106個·mL-1,細胞活率低于30%(P<0.01)。試驗證明經馴化的293T懸浮細胞以5.5 L的培養(yǎng)體系在機械攪拌式生物反應器中培養(yǎng)時間為5.5 d。

圖3 生物反應器中293T懸浮細胞生長曲線和細胞活率Fig.3 Cell growth curve and viability of 293T suspension cells in the bioreactor

2.5 機械攪拌式生物反應器包裝慢病毒

用 0、1、3、10、30、100 μL細胞培養(yǎng)病毒原液轉染293T貼壁細胞流式細胞術檢測結果如圖 4-A所示，CD30-CAR+細胞比例分別為0%、13.7%、36.4%、65.7%、92.4%和95.1%，通過公式(1)計算得出病毒原液的滴度為 6.5×107TU·mL-1。

2.6 細胞工廠和反應器慢病毒包裝效率的比較

用0、20、50、100、500和1 000 μL細胞工廠培養(yǎng)病毒原液轉染293T貼壁細胞流式細胞術檢測結果如圖4-B所示，CD30-CAR+細胞比例為0%、8.7%、18.3%、37.0%、86.0%、94.1%，通過公式(1)計算得出病毒原液滴度為 1.9×106TU·mL-1。

注：流式細胞術分析機械攪拌式生物反應器(A)和細胞工廠(B)生產的不同體積病毒感染293T貼壁細胞后CD30-CAR+細胞比例。Note：Flow-based analysis of the ratio of CD30-CAR+ cells after 293T adherent cells were infected with different volume of virus produced in bioreactor(A) and cell factory(B).圖4 生物反應器和細胞工廠生產CD30-CAR慢病毒的轉染效率Fig.4 Transfection efficiency of the CD30-CAR lentivirus production in bioreactor and cell factory

細胞工廠和機械攪拌式生物反應器包裝5.5 L慢病毒原液的比較如表3所示。生物反應器生產的慢病毒活性滴度為細胞工廠的34倍，其轉染密度是細胞工廠的58倍，其細胞產毒率是細胞工廠的6倍；細胞工廠在耗材成本(培養(yǎng)基和培養(yǎng)器皿等一次性損耗品)是反應器的5倍。

表3 細胞工廠和機械攪拌式生物反應器生產5.5 L慢病毒原液的比較Table 3 Comparison of 5.5 L lentiviral stoste production in cell factory and bioreactor

3 結論與討論

人類免疫缺陷病毒(HIV-1)來源的慢病毒載體作為基因遞送工具在細胞治療、遺傳性疾病治療中顯示出廣泛的用途。目前，以CAR-T 治療方法為代表的血液腫瘤的細胞治療藥物已經走進了臨床[20-21]。作為腫瘤的個體化精準治療方法，CAR-T細胞的生產工藝影響到細胞的質量及治療的效果，而CAR-T的生產工藝最核心在慢病毒的生產，其生產工藝的放大顯得極為重要[22]。293T細胞懸浮狀態(tài)下可直接用于病毒包裝，節(jié)省了細胞消化時間，同時充分利用立體空間，實現(xiàn)高密度培養(yǎng)，解決了貼壁狀態(tài)下生產空間需求大、人工成本高、產品批次質量不穩(wěn)定以及在規(guī)模擴大上受限等問題[23]。孟其麟等[6]采用分步適應的方法40 d完成HEK293 細胞無血清培養(yǎng)基的適應。本研究實現(xiàn)了293T貼壁細胞在7 d左右被馴化成懸浮細胞，且在未添加固定載體和抗接團劑條件下完成大規(guī)模慢病毒包裝，在搖瓶小規(guī)模試驗中包裝滴度是細胞工廠貼壁細胞的10倍。

本研究證明，馴化293T懸浮細胞在機械生物反應中能夠高密度倍增生長，同時進行慢病毒包裝生產的滴度高于搖瓶3.6倍、細胞工廠34倍，在成本和產毒效率上與細胞工廠工藝相比，均具有較強的競爭力。馴化293T懸浮細胞采用機械攪拌式生物反應器生產5.5 L的6.5×107TU·mL-1活性慢病毒，按照下游純化20%～65%的回收率[24]，可以得到至少7.2×1010TU活性慢病毒。陳思毅等[25]發(fā)現(xiàn)1個患者需要最高劑量為2×108～3×108個CAR-T細胞。葉麗偉等[26]在成熟T淋巴細胞中重組慢病毒1～10感染復數(shù)。以T細胞10的感染復數(shù)計算，5.5 L大規(guī)模機械生物反應器生產一批慢病毒預計最低可供71人份，這將大大簡化生產和質檢的工作，降低生產CAR-T的成本，同時保證患者所需慢病毒來源于同一批次。本研究初步建立了利用大泡通氣系統(tǒng)機械攪拌式生物反應器懸浮高密度培養(yǎng)293T細胞生產慢病毒的工藝，同時為慢病毒擴大規(guī)模生產奠定基礎，對其他類型的293T懸浮培養(yǎng)產品的生產也具有參考意義。