關(guān)靖 王皓 周俊 劉旭

惡性腫瘤是造成死亡的最主要原因，肺癌作為惡性腫瘤之一，其發(fā)病率高達(dá)17%，是目前發(fā)病率第一的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅人類的健康[1-2]。目前，肺癌的治療方法除了傳統(tǒng)的手術(shù)治療外，還有化療和放療，但腫瘤化療耐藥、放療敏感性降低、腫瘤復(fù)發(fā)、腫瘤轉(zhuǎn)移等問題一直阻礙著肺癌的臨床治療[3-5]，所以急需探究更多的腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制，尋找新型的腫瘤診斷和治療靶點(diǎn)。

外泌體是由多種活細(xì)胞分泌的粒徑在30～100 nm之間的納米級囊泡，可在體液中穩(wěn)定存在而發(fā)揮細(xì)胞間信息傳遞的作用。腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境中的重要組成部分，可調(diào)控腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，其中腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞外泌體，已經(jīng)被研究在肝癌和膠質(zhì)瘤中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，然而其在肺癌中尚無研究，所以本文主要探究了腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞外泌體對肺癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移的作用，旨在為肺癌的臨床治療和研究提供幫助。

資料與方法

一、材料

人肺癌細(xì)胞A549(中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)；收集20例肺癌患者的組織樣本(經(jīng)我院倫理委員會批準(zhǔn)，患者簽署知情同意書)，Transwell小室(福麥斯生物技術(shù)有限公司)；CCK8試劑盒、細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(沈陽萬類生物技術(shù)有限公司)；α-SMA、FSP-1、FAP、Vimentin、p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR、GAPDH一抗、IgG二抗(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)。

二、細(xì)胞分離與培養(yǎng)

肺癌細(xì)胞的培養(yǎng)：取液氮保存的肺癌細(xì)胞A549，于37 ℃水浴鍋中迅速解凍，然后接種于100 mm2的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞生長至匯合率達(dá)80%時(shí)，加入胰蛋白酶消化，進(jìn)行細(xì)胞傳代。

原代成纖維細(xì)胞和腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞的分離：從手術(shù)室取出肺癌組織和癌旁組織，用無菌的PBS溶液沖洗3次，然后在超凈工作臺中，將組織樣本剪碎，用膠原酶、中性蛋白酶、透明質(zhì)酸酶的混合溶液消化30～50 min，1 500 rpm離心5 min，組織沉淀用少量12% FBS的DMEM/F12完全培養(yǎng)基重懸，并接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)3天后更換培養(yǎng)基，洗掉組織碎片和沒有貼壁的細(xì)胞。培養(yǎng)通過胰蛋白酶消化的方法除去上皮細(xì)胞，留下成纖維細(xì)胞。

三、Western blot

消化各組細(xì)胞1×107個(gè)消化于離心管中，使用RIPA蛋白裂解液，提取細(xì)胞總蛋白，根據(jù)BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量，然后加入上樣緩沖液沸水浴30 min，使蛋白變性，然后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，用5%的脫脂牛奶對PVDF膜封閉2 h，然后以1 ∶1 000比例稀釋后的一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜后二抗室溫孵育1.5 h，再用TBST洗膜后按照ECL試劑盒說明書配置發(fā)光液，并將PVDF膜浸入發(fā)光液中反應(yīng)半分鐘，曝光并拍照，用Image J軟件對曝光結(jié)果進(jìn)行定量分析。

四、NFs和CAFs鑒定

Western blot和免疫熒光檢測NFs和CAFs中α-SMA、FSP-1、FAP、Vimentin表達(dá)，免疫熒光主要步驟為：將細(xì)胞接種至激光共聚焦皿中，使用4%的甲醛溶液固定，然后加入血清封閉2 h，加入適量α-SMA、FSP-1、FAP、Vimentin一抗，37 ℃孵育1 h；然后用PBS 漂洗，以洗去多余抗體，然后加入適量濃度的帶有CY3標(biāo)記的二抗溶液，37 ℃室溫孵育1 h，然后使用DAPI染細(xì)胞核，然后于激光共聚焦顯微鏡下觀察蛋白表達(dá)。

五、外泌體的提取與鑒定

使用差速離心法提取細(xì)胞培養(yǎng)上清中的外泌體，首先將細(xì)胞培養(yǎng)基更換為含10%無外泌體胎牛血清的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，將上清液3 000×g，4 ℃離心15 min去除死細(xì)胞；然后將上清液6 000×g離心40 min，去除細(xì)胞碎片；10 000×g離心1 h，取上清；100 000×g離心1 h，收集沉淀即為外泌體，用400 μl PBS重懸外泌體，并放在-80 ℃保存。

外泌體的鑒定：于透射電鏡下觀察外泌體的結(jié)構(gòu)特征，Western blot檢測外泌體標(biāo)志蛋白CD9、CD63、TSG101。

六、CCK8實(shí)驗(yàn)

CCK8實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖能力，用含無外泌體胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基將A549細(xì)胞稀釋至1×105個(gè)/mL，96孔板中每孔接種100 μl上述細(xì)胞，每孔加入外泌體，使其終濃度為10 μg/mL，每組5個(gè)復(fù)孔，并設(shè)置24、48、72 h時(shí)間點(diǎn)的96孔板，然后將上述96孔板于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在各時(shí)間點(diǎn)取出96孔板，每孔加入10 μl CCK8溶液，37 ℃條件下孵育4 h，然后使用酶標(biāo)儀在450 nm波長條件下檢測各空光密度值(OD值)。

七、細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

使用不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋A549細(xì)胞，細(xì)胞細(xì)胞接種至Transwell小室中，每孔1×104個(gè)/200 μl細(xì)胞，每孔加入外泌體，使其終濃度為10 μg/mL，小室放置于24孔板，24孔板每孔加入600 μl DMEM完全培養(yǎng)基，然后將24孔板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中24 h，Transwell小室底部用結(jié)晶紫染色10 min，然后在顯微鏡下觀察并拍照，比較各組細(xì)胞遷移數(shù)。

八、細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

用Transwell小室法檢測細(xì)胞侵襲能力，主要過程為：將Matrigel膠4 ℃融化后，取20 μl平鋪于Transwell小室中然后置于37 ℃培養(yǎng)箱中凝固1 h，用DMEM空白培養(yǎng)基重懸A549細(xì)胞，細(xì)胞接種至Transwell小室中，每孔1×104個(gè)200 μl細(xì)胞，每孔加入外泌體，使其終濃度為10 μg/mL，小室放置于24孔板，24孔板每孔加入600 μl DMEM完全培養(yǎng)基，然后將24孔板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中24 h，Transwell小室底部用結(jié)晶紫染色10 min，然后在顯微鏡下觀察并拍照，比較各組細(xì)胞侵襲數(shù)。

九、細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)

將A549細(xì)胞與各組外泌體共孵育24 h后，根據(jù)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，取5×105個(gè)細(xì)胞于離心管中，用500 μl的Binding Buffer重懸細(xì)胞成單細(xì)胞懸液，而后添加5 μl的Annexin V-FLTC和5 μl的PI染料，混勻后室溫避光孵育15 min，并設(shè)置Annexin V-FLTC和PI單陽性管用于調(diào)熒光補(bǔ)償，空白管用于調(diào)電壓；使用流式細(xì)胞儀檢測上述各樣品的熒光值，使用FlowJo v5.573軟件分析細(xì)胞凋亡數(shù)。

十、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞的鑒定

免疫熒光檢測和Western blot檢測α-SMA、FSP-1、FAP、Vimentin表達(dá)結(jié)果(見圖1、2)，所提取的CAFs表達(dá)α-SMA、FSP-1、FAP、Vimentin，而NFs細(xì)胞中α-SMA、FSP-1、FAP、Vimentin表達(dá)較弱，符合CAFs和NFs的特征，說明所提取的CAFs和NFs可用于后續(xù)研究。

二、外泌體鑒定結(jié)果

透射電鏡觀察外泌體結(jié)果(見圖3)顯示，所提取的外泌體粒徑在30～100nm之間，具有雙層膜結(jié)構(gòu)，形態(tài)呈“杯托”樣，符合外泌體的結(jié)構(gòu)特征，Western blot檢測外泌體標(biāo)志蛋白CD9、CD63、TSG101(見圖4)。所提取的外泌體表達(dá)CD9、CD63、TSG101，符合外泌體的生物學(xué)特征。

圖1 免疫熒光鑒定CAFs和NFs結(jié)果(×20)

圖2 Western blot鑒定CAFs和NFs細(xì)胞α-SMA、FSP-1、FAP、Vimentin表達(dá)

圖3 透射電鏡觀察外泌體形態(tài)結(jié)構(gòu)

圖4 Western blot檢測外泌體CD9、CD63、TSG101表達(dá)

三、CAFs外泌體促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖

為了探究CAFs外泌體對A549細(xì)胞增殖能力的影響，將PBS、NFs exo、CAFs exo與A549細(xì)胞共孵育，CCK8法檢測細(xì)胞增殖能力的變化，結(jié)果(見圖5)，相比于PBS組，NFs exo組A549細(xì)胞增殖能力無顯著差異，CAFs exo組A549細(xì)胞增殖能力顯著增加(P<0.001)，說明CAFs外泌體能夠顯著促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖。

四、CAFs外泌體促進(jìn)肺癌細(xì)胞遷移

Transwell小室法檢測細(xì)胞遷移結(jié)果(見圖6)顯示。相比于PBS組，NFs exo組A549細(xì)胞遷移能力無顯著變化(P>0.05)，而與CAFs exo共孵育后A549細(xì)胞遷移能力顯著增加(P<0.001)，提示腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞外泌體能夠顯著促進(jìn)肺癌細(xì)胞的遷移能力。

圖5 CCK8法檢測外泌體對A549細(xì)胞增殖能力的影響 (與PBS組相比，***P<0.001)

五、CAFs外泌體促進(jìn)肺癌細(xì)胞侵襲

Transwell小室法檢測腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞外泌體對A549細(xì)胞的影響，檢測結(jié)果(見圖7)。與NFs exo共孵育后，A549細(xì)胞侵襲能力無顯著變化(P>0.05)，與CAFs exo共孵育后A549細(xì)胞侵襲能力顯著增加(P<0.001)，說明腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞外泌體能夠顯著促進(jìn)肺癌細(xì)胞的侵襲能力。

六、CAFs外泌體抑制肺癌細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果(見圖8)顯示，與NFs外泌體共孵育后A549細(xì)胞凋亡水平與PBS組相比無顯著變化(P>0.05)，與CAFs外泌體共孵育后，A549細(xì)胞凋亡水平顯著低于PBS組(P<0.001)，說明腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞外泌體能夠抑制肺癌細(xì)胞凋亡。

圖6 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)檢測外泌體對A549對細(xì)胞遷移能力的影響(與PBS組相比，***P<0.001)(×20)

圖7 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測外泌體對A549細(xì)胞侵襲能力的影響(與PBS組相比，***P<0.001)(×20)

圖8 流式細(xì)胞術(shù)檢測外泌體對各組細(xì)胞凋亡水平的影響(與PBS組相比，***P<0.001)

七、CAFs外泌體激活PI3K/AKT/mTOR信號通路

Western blot檢測外泌體對PI3K/AKT/mTOR信號通路的影響，結(jié)果如圖9所示，相比于PBS組，NFs exo組A549細(xì)胞中PI3K、AKT、mTOR磷酸化水平無顯著差異(P>0.05)，CAFs exo組A549細(xì)胞中PI3K、AKT、mTOR磷酸化水平顯著增加(P<0.001)，說明CAFs外泌體可激活PI3K/AKT/mTOR信號通路而促進(jìn)肺癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。

圖9 Western blot檢測外泌體對PI3K/AKT/mTOR信號通路的影響(與PBS組相比，***P<0.001)

討 論

CAFs是肺癌腫瘤微環(huán)境的的重要基質(zhì)細(xì)胞之一[6]，可通過旁分泌在腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移、血管新生、免疫逃逸、腫瘤耐藥中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[7-8]，CAFs可重塑細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)以及腫瘤微環(huán)境而調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展[9]。腫瘤微環(huán)境中的多種基質(zhì)細(xì)胞均可通過分泌外泌體，局部或全身性的參與細(xì)胞間的信息傳遞，CAFs和腫瘤細(xì)胞之間也可通過外泌體進(jìn)行信息交流，進(jìn)而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展[10-11]。如食管癌CAFs可以通過分泌外泌體而調(diào)控食管癌細(xì)胞的粘附、細(xì)胞內(nèi)吞以及細(xì)胞連接等[12]。在胰腺癌中，CAFs外泌體可調(diào)控胰腺癌的增殖和吉西他濱的耐藥[13]。然而CAFs外泌體對肺癌的影響尚無報(bào)道，所以本文將研究定位于肺癌中CAFs分泌的外泌體對肺癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移的研究，旨在發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境調(diào)控肺癌的新機(jī)制。

本研究首先分別從肺癌組織和癌旁組織中提取分離了纖維細(xì)胞，然后利用免疫熒光和Western blot鑒定了CAFs中高表達(dá)α-SMA、FSP-1、FAP、Vimentin，說明肺癌組織中的成纖維細(xì)胞為腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞，為了探究CAFs外泌體的功能，體外培養(yǎng)CAFs和NFs后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，提取并鑒定外泌體后將外泌體與肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞共孵育，檢測外泌體對肺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果顯示，CAFs細(xì)胞所分泌的外泌體能夠顯著促進(jìn)A549細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力，降低A549細(xì)胞的凋亡水平，而NFs外泌體對A549細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲、凋亡則無顯著影響，說明CAFs外泌體能夠調(diào)控肺癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移能力。

PI3K/AKT/mTOR信號通路是腫瘤研究中的經(jīng)典信號通路[14-15]，已經(jīng)被證明可在多種腫瘤中異常激活，該通路的異常激活可引起腫瘤的異常轉(zhuǎn)化、促進(jìn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，影響腫瘤血管新生等，在腫瘤的臨床治療中該通路的關(guān)鍵因子的活化還可作為評價(jià)患者預(yù)后的指標(biāo)[16-17]，已有研究表明，非小細(xì)胞肺癌中PI3K、AKT、mTOR基因表達(dá)均上調(diào)[18-20]。本研究發(fā)現(xiàn)，CAFs外泌體與A549細(xì)胞共孵育后，A549細(xì)胞中PI3K、AKT、mTOR磷酸化水平均顯著增加，即PI3K/AKT/mTOR信號通路激活，而NFs外泌體則對該通路無顯著影響，說明腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞能夠通過激活PI3K/AKT/mTOR信號通路而促進(jìn)肺癌的生長和轉(zhuǎn)移。

綜上所述，在肺癌中，腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞分泌的外泌體能夠促進(jìn)肺癌的生長及轉(zhuǎn)移，其機(jī)制為激活PI3K/AKT/mTOR信號通路，但是外泌體中何種物質(zhì)發(fā)揮的調(diào)控功能，還需進(jìn)一步研究。