于可心，劉夢(mèng)菂

（南京林業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京210037）

葉片是植物光合作用的主要器官，其中葉脈承擔(dān)著運(yùn)輸水分、養(yǎng)分和光合產(chǎn)物的重要任務(wù)。對(duì)葉脈的脈絡(luò)模式、拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)與其功能間相互關(guān)系的研究具有重要生態(tài)學(xué)意義，但由于葉脈提取難度的限制，當(dāng)前的理論成果尚不成熟，相關(guān)研究難以突破。

傳統(tǒng)的葉脈提取方法是利用Sobel算子提取葉脈邊緣信息，其主要原理是檢測(cè)圖像中灰度值發(fā)生跳變的像素區(qū)域。對(duì)于葉片而言，葉邊緣和脈絡(luò)是重要的特征信息，一些脈絡(luò)屬于邊界像素，但部分脈絡(luò)的像素灰度變化平緩；同時(shí)脈絡(luò)的像素寬度較窄，通常只有幾個(gè)像素。因此，運(yùn)用傳統(tǒng)的邊緣檢測(cè)方法經(jīng)常無法得到令人滿意的結(jié)果。李燦燦等提出一種基于改進(jìn)的Sobel算子和色調(diào)信息相結(jié)合的葉脈提取方法。但該方法不適用于沒有圖像分析經(jīng)驗(yàn)的研究人員，且不能大量處理葉脈材料。有學(xué)者提出，使用色調(diào)和強(qiáng)度信息的快速葉脈提取方法，該方法將葉片圖像分為葉脈與葉肉顏色有明顯差別和無明顯差別兩類，有顯著差異的葉片圖像可以在HIS（Hue Saturation Intensity）顏色空間下使用色調(diào)信息進(jìn)行提取，無顯著差異的葉片圖像則需要同時(shí)使用色調(diào)和強(qiáng)度信息，該方法能提高葉脈提取的速度。但該方法不能明顯區(qū)分顏色是否有顯著差異，需要人工輔助。

基于已有的葉脈提取方法技術(shù)要求高，算法復(fù)雜，處理葉片數(shù)量有限等難題，本文以木蘭科含笑（

Michelia figo

）為例，介紹一種大批量處理植物葉片、提取植物葉脈的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

2019年9月13日，在江蘇省南京市南京林業(yè)大學(xué)校園內(nèi)（118°48′52″E，32°03′09″N）選擇生長(zhǎng)健康的含笑，采集完全展開且沒有病蟲害的含笑葉片，采到的葉片用塑封袋（28 cm×20 cm）保存，防止蒸騰作用造成的葉片卷曲皺縮。采完后立即回到實(shí)驗(yàn)室，擦拭干凈并確認(rèn)葉片完整，對(duì)葉片進(jìn)行編號(hào)。

1.2 設(shè)備與用具

固體NaOH、番紅溶液、標(biāo)簽牌、細(xì)眼網(wǎng)袋（15 cm×10 cm，25 cm×15 cm）、塑料盆、SUPOR ST24P1不銹鋼鍋（蘇泊爾）、SUPOR-SDHCB9E8-210電磁爐（蘇泊爾）、EPSON-V550掃描儀（愛普生）。

1.3 操作步驟

1.3.1 化學(xué)方法處理葉片

（1）標(biāo)簽編號(hào)。將采回的葉片擦拭干凈，確認(rèn)葉片完整后進(jìn)行編號(hào)。標(biāo)簽牌系于葉柄處并寫上葉片的標(biāo)號(hào)；標(biāo)簽與葉片排列整齊后裝入細(xì)眼網(wǎng)袋，打結(jié)系緊。

（2）配制溶液。用固體NaOH配制濃度為5%～10%的NaOH溶液，并倒入不銹鋼鍋。

（3）葉片煮沸。將裝入葉片的袋子放入NaOH溶液中加熱煮沸至葉肉腐爛，時(shí)長(zhǎng)約30 min。加熱過程中要定時(shí)檢查葉肉的腐爛程度，避免加熱過長(zhǎng)使葉脈和葉肉無法分離。加熱的過程中不要加蓋，防止沸騰時(shí)NaOH溶液溢出。

（4）去除葉肉。煮好的葉片置于清水中多次清洗，順著葉脈方向洗去葉肉。清洗過程中動(dòng)作要輕柔，避免用力過度破壞葉脈的完整性。

（5）葉脈染色。將清洗干凈的葉脈平整地浸泡在番紅溶液中，使葉脈能夠均勻著色；同時(shí)，葉片間保持有序擺放，避免標(biāo)簽纏繞。2 h后將葉脈放入清水，多次清洗去掉浮色后取出。

（6）葉脈干燥。將染色完畢的葉脈展平在報(bào)紙上自然晾干，葉脈近干時(shí)夾在書本中或用重物壓住，防止自然風(fēng)干時(shí)葉脈卷曲翹起。

（7）掃描葉脈。葉脈完全干透后用掃描儀掃描（如圖1），后續(xù)用LEAF GUI（Leaf Extraction and Analysis Framework Graphical User Interface）軟件處理。

圖1 化學(xué)方法處理后的含笑葉片

1.3.2 LEAF GUI軟件使用方法

LEAF GUI是一項(xiàng)基于MATLAB編程環(huán)境開發(fā)的、分析植物葉脈宏觀結(jié)構(gòu)的軟件（見圖2）。它能通過一系列閾值、清除和分割算法，提取葉脈及周圍網(wǎng)眼尺寸和位置的描述性統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，包括葉脈的長(zhǎng)度、面積、各級(jí)脈絡(luò)的連接度和網(wǎng)眼的面積、形狀等一系列葉脈信息。該軟件相比于其他的圖像分析軟件，能讓使用者在短時(shí)間內(nèi)獲得數(shù)以千計(jì)的與葉脈相關(guān)的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。LEAF GUI作為一項(xiàng)交互式的圖像分析軟件，其最大的優(yōu)點(diǎn)是可以使沒有圖像分析技能專長(zhǎng)的人員通過幾個(gè)按鈕的操作直接提取圖像中的葉脈信息，量化整個(gè)葉脈網(wǎng)絡(luò)的幾何結(jié)構(gòu)，克服了由于葉脈的大小和復(fù)雜性產(chǎn)生的困難。主窗口共有設(shè)置比例和裁剪（Set Scale and Crop）、過濾（Filtering）、閾值（Thresholding）、圖像存儲(chǔ)（Image Storage）、清除二進(jìn)制圖像（Clean Binary Image）、圖像分割（Image Segmentation）和統(tǒng)計(jì)匯總（Summary Statistic）7個(gè)面板。

圖2 LEAF GUI軟件操作界面主窗口及使用按鈕

本文將對(duì)所要用到的面板進(jìn)行簡(jiǎn)要的介紹和操作說明：

（1）導(dǎo)入圖像。使用文件（File）-＞打開圖像（Open Image）或Ctrl＋O導(dǎo)入已掃描的圖像。主窗口同時(shí)出現(xiàn)四個(gè)圖像，分別為原始圖像（Original Image）、原始圖像放大（Original Zoom）、修改后圖像（Modified Image）、修改圖像放大（Modified Zoom）。

（2）設(shè)置比例。比例尺已知時(shí)，可直接在設(shè)置比例與裁剪面板測(cè)量比例（Measure Scale）按鈕右側(cè)方框中輸入比例尺；比例尺未知時(shí)，需要手動(dòng)測(cè)量。導(dǎo)入一段已知刻度的比例尺圖像后，在方框中輸入比例尺的實(shí)際長(zhǎng)度（以mm為單位），單擊測(cè)量比例按鈕。先點(diǎn)擊比例尺的一端，然后拖動(dòng)光標(biāo)，使其與比例尺的另一端對(duì)齊，雙擊比例尺，相應(yīng)的比例會(huì)自動(dòng)出現(xiàn)在方框中。

（3）調(diào)整閾值。通過調(diào)整閾值將導(dǎo)入的RGB圖像或灰度圖像轉(zhuǎn)化為二進(jìn)制圖像。閾值面板下有自適應(yīng)閾值（Adaptive Threshold）和全局閾值（Global Threshold）兩個(gè)板塊。其中自適應(yīng)閾值傾向于更好地捕獲較小的葉脈，而全局閾值更傾向于捕獲較大的葉脈。首先，調(diào)整自適應(yīng)閾值的大小，通過右側(cè)的窗口觀察葉脈的清晰度，得到清晰完整的葉脈圖片；其次，點(diǎn)擊清除區(qū)域（Remove Regions）去掉圖像中多余的噪點(diǎn)（具體像素值根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整）；最后，勾選合并板塊（Combination）中的自適應(yīng)圖像方框保存。全局閾值的操作同上，最后點(diǎn)擊組合（Combine）按鈕，主窗口修改后圖像會(huì)出現(xiàn)新的組合圖像。

（4）導(dǎo)出數(shù)據(jù)。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)面板共有面積數(shù)據(jù)（Area Stats）、網(wǎng)眼數(shù)據(jù)（Areole Stats）和葉脈數(shù)據(jù)（Vein Stats）三個(gè)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)功能。先選擇面板下方的.xls單選按鈕，單擊網(wǎng)眼數(shù)據(jù)（Areole Stats）按鈕，彈出一個(gè)對(duì)話框，詢問圖像是否被背景包圍，點(diǎn)擊“是”后自動(dòng)保存為一個(gè)名稱為葉片編號(hào)+Areole Stats的Excel表格。導(dǎo)出葉脈相關(guān)的數(shù)據(jù)時(shí)，單擊葉脈數(shù)據(jù)（Vein Stats）按鈕后，自動(dòng)保存為一個(gè)名稱為葉片編號(hào)+Vein Stats的Excel表格。導(dǎo)出葉面積相關(guān)數(shù)據(jù)前，先將全局閾值處的閾值調(diào)至最高255，單擊閾值按鈕后，修改后圖像會(huì)變成葉片部分全白背景全黑。此時(shí)圖像和背景中都含有噪聲，將移除區(qū)域右側(cè)方框中的像素值改為10 000 bpi，單擊移除區(qū)域按鈕去除背景中的噪聲。當(dāng)葉脈的有些空隙沒有被填充時(shí)，使用下拉菜單中清除二進(jìn)制（Clean Binary）-＞填充孔隙（Fill Holes）功能將葉片補(bǔ)充完整，單擊面積數(shù)據(jù)按鈕后自動(dòng)保存為一個(gè)名稱為葉片編號(hào)+Area Stats的Excel表格。

2 輸出結(jié)果

2.1 網(wǎng)孔數(shù)據(jù)

導(dǎo)出的網(wǎng)孔統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)（如圖3）包括：

（1）網(wǎng)孔編號(hào)（Areole Number）：某一網(wǎng)孔唯一的數(shù)字編號(hào)，從1到n共有n個(gè)。

（2）網(wǎng)孔面積（Areole Area，mm）：該網(wǎng)孔的像素點(diǎn)所圍成的區(qū)域面積。

（3）凸包面積（Convex Area，mm）：網(wǎng)孔像素點(diǎn)構(gòu)成的凸包區(qū)域的面積。

（4）離心率（Eccentricity）：橢圓焦點(diǎn)與主軸之間距離的比值。

（5）可靠性（Solidity）：網(wǎng)孔真實(shí)面積與凸包面積的比值。

（6）周長(zhǎng)（Perimeter，mm）：該網(wǎng)孔的周長(zhǎng)。

（7）當(dāng)量直徑（Equivalent Diameter，mm）：與該網(wǎng)孔具有相同歸一化第二中心矩的圓的直徑。

（8）長(zhǎng)軸（Major Axis，mm）：與該網(wǎng)孔具有相同歸一化第二中心矩的橢圓的長(zhǎng)軸長(zhǎng)度。

（9）短軸（Minor Axis，mm）：與該網(wǎng)孔具有相同歸一化第二中心矩的橢圓的短軸長(zhǎng)度。

（10）形心（Centroid）：該網(wǎng)孔形心的坐標(biāo)，Centroid 1表示橫坐標(biāo)，Centroid 2表示縱坐標(biāo)。

（11）平均距離（Mean Distance，mm）：每個(gè)網(wǎng)孔像素與最近葉脈像素之間的平均歐氏距離。

（12）方差距離（Variance Distance，mm）：平均距離的方差。

圖3 網(wǎng)孔統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)

2.2 葉脈數(shù)據(jù)

導(dǎo)出的葉脈數(shù)據(jù)包括葉脈的每個(gè)單獨(dú)脈段的測(cè)量數(shù)據(jù)（如圖4）和匯總統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)（Summary Stats）（如圖5）兩個(gè)表格。

圖4 葉脈單獨(dú)脈段測(cè)量數(shù)據(jù)

圖5 脈匯總數(shù)據(jù)

單獨(dú)脈段測(cè)量數(shù)據(jù)包括：

（1）葉脈編號(hào)（Edge）：該段葉脈唯一的數(shù)字編號(hào)，從1到n共有n個(gè)。

（2）節(jié)點(diǎn)編號(hào)（Node）：該段葉脈連接的兩個(gè)節(jié)點(diǎn)的編號(hào)。

（3）長(zhǎng)度（Length，mm）：葉脈的長(zhǎng)度，計(jì)算該脈段沿脈絡(luò)方向的像素點(diǎn)的數(shù)量，通過像素與實(shí)際長(zhǎng)度的比例換算得出。

（4）寬度（Width，mm）：該段葉脈的平均寬度，每個(gè)葉脈像素到兩邊網(wǎng)眼的半徑距離加倍后乘以比例，得到該點(diǎn)處的直徑，所有直徑的平均值即為該葉脈的寬度。

（5）二維面積（2D Area，mm）：該脈段長(zhǎng)度與平均寬度之積。

（6）三維表面積（3D surface area，mm）：通過該脈段的長(zhǎng)度、平均寬度和圓柱體表面積公式得到。

（7）體積（Volume，mm）：通過該脈段的長(zhǎng)度、平均寬度和圓柱體體積公式得到。

（8）形心（Centroid）：該脈段中心點(diǎn)和兩個(gè)節(jié)點(diǎn)的坐標(biāo)。

葉脈的匯總數(shù)據(jù)包括：

（1）葉脈數(shù)量（Number of Edges）：該葉片所有的葉脈的小段數(shù)。

（2）節(jié)點(diǎn)數(shù)量（Number of Nodes）：該葉片所有葉脈節(jié)點(diǎn)的數(shù)量。

（3）葉脈總長(zhǎng)度（Total Network Length，mm）：所有小段葉脈的長(zhǎng)度累加。

（4）葉脈總面積（Total Network Area，mm）：所有小段葉脈的面積累加。

（5）平均葉脈長(zhǎng)度（Mean Edge Length，mm）：各小段葉脈的平均長(zhǎng)度。

（6）平均寬度（Mean Width，mm）：各小段葉脈的平均寬度。

（7）平均二維面積（Mean 2D Area，mm）：各小段葉脈的平均二維面積。

（8）平均三維表面積（Mean 3D Surface Area，mm）：各小段葉脈的平均三維表面積。

（9）平均體積（Mean Volume，mm）：各小段葉脈的平均體積。

2.3 面積、周長(zhǎng)數(shù)據(jù)

導(dǎo)出的網(wǎng)孔統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)（如圖6）包括：

（1）面積（Area，mm）：該葉片的總面積。

（2）周長(zhǎng)（Perimeter，mm）：該葉片的周長(zhǎng)。

（3）比例（Scale，pixels per mm）：輸入或手動(dòng)測(cè)量的實(shí)際距離與像素值的比值。

圖6 面積、周長(zhǎng)數(shù)據(jù)

3 討論

相對(duì)于傳統(tǒng)的葉脈提取方法，LEAF GUI軟件對(duì)于大批量處理葉片具有更準(zhǔn)確、更易操作的特點(diǎn)，有助于解決部分已經(jīng)提出卻未能證實(shí)的葉脈結(jié)構(gòu)相關(guān)的理論。陳靜等在研究車桑子（

Dodonaea viscosa

）葉脈密度與葉氮含量關(guān)系時(shí)，用顯微鏡選擇拍攝每個(gè)葉片的兩端及中間部位3個(gè)視野的圖像，采取Motic Images Plus 2.0軟件獲得各個(gè)照片中葉脈的總長(zhǎng)度。由于不同大小和不同位置的葉脈特征存在一定差異性，用該方法計(jì)算的葉脈密度與用LEAF GUI軟件處理得到的完整葉片密度相比，誤差較大，數(shù)據(jù)分析缺乏代表性，使得研究結(jié)論停留在定性說明而非定量分析。LEAF GUI軟件對(duì)圖片清晰度有較高的要求，圖像與背景之間的對(duì)比度越高，越有利于葉脈的提取。該軟件也并非完全精確測(cè)量，進(jìn)一步提升圖像處理的質(zhì)量還有待于科研人員更新改進(jìn)算法。

（致謝：本文在寫作過程中得到導(dǎo)師時(shí)培建副教授的指導(dǎo)，特此表示感謝?。?/p>