王珊珊 孫敏 王永霞 李惟棟 韓春超

（山東中醫(yī)藥大學藥學院，濟南 250355）

雞腿蘑（Coprinus comatus），學名毛頭鬼傘，是一種新型栽培的藥用和食用蘑菇［1］。由于其豐富的營養(yǎng)價值和良好的口感，被譽為具“天然、營養(yǎng)、保健”3 種機能為一體的16 種珍稀食用菌之一［2］。多糖是雞腿蘑中天然存在的物質，是其生理功能的重要組成部分。據(jù)報道，雞腿蘑子實體中的多糖含量為57.65%，其中還原糖含量為53.64%［3］。研究報道雞腿蘑多糖具有多種生物活性功能，如降血糖［4-5］、抗氧化［6-7］、抗腫瘤［8］及免疫調(diào)節(jié)作用［8-9］等。目前，對于雞腿蘑多糖的研究主要集中在雞腿蘑多糖的藥用價值、雞腿蘑多糖發(fā)酵培養(yǎng)條件及提取工藝優(yōu)化的方面，涉及雞腿蘑多糖結構方面的研究很少，且還沒有雞腿蘑多糖結構與功能相關性的文獻報道。

液態(tài)深層發(fā)酵是目前開發(fā)雞腿蘑活性成分的有效手段［2］。研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵是一個動態(tài)變化的過程，發(fā)酵過程（如時間）可使發(fā)酵產(chǎn)物的含量、結構和活性更多樣化［10-12］。然而，目前對于發(fā)酵多糖的研究集中在多糖含量的動態(tài)積累變化［12-14］，較少涉及到多糖的結構及活性的改變。多糖的生物活性取決于它的化學結構和其他理化性質，包括單糖組成、鏈構象、支鏈情況、空間構型、相對分子質量及溶解度等［15-16］。因此，本研究擬對不同發(fā)酵時間的雞腿蘑胞外粗多糖的單糖組成、形貌結構及分子量分布進行測定，并進一步探討與抗氧化活性的相關性，旨在為雞腿蘑液體發(fā)酵生產(chǎn)提供理論參考，也為雞腿蘑多糖在新藥研發(fā)和功能性食品開發(fā)等方面開創(chuàng)新的應用領域。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 雞腿蘑菌株（R2000）由山東省農(nóng)業(yè)科學院提供。

1.1.2 試 劑 1，1- 二 苯 基-2- 三 硝 基 苯 肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、D-半乳糖：上海麥克林生物化學技術有限公司；總抗氧化劑能力試劑盒：南京建城生物工程研究所；磷酸二氫鉀（KH2PO4）、硫酸鎂（MgSO4）、L-鼠李糖、D-葡萄糖：國藥集團化學試劑有限公司；D-甘露糖、D-阿拉伯糖：上海源葉生物科技有限公司。

1.1.3 儀器設備 UV-6100 雙光束分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；Essentia LC-16 型高效液相色譜儀：日本shimadzu 公司；ThermoApreo 掃描電子顯微鏡：美國ThermoFisher 公司；MultiMode 原子力顯微鏡：美國Bruker 公司；ELEOS System 凝膠色譜儀：美國Wyatt 公司。

1.2 方法

1.2.1 雞腿蘑胞外粗多糖的樣品制備 用接種棒從獲得的雞腿蘑菌株中勾取3-4 塊（1 cm2）菌絲體接種至PDA 斜面培養(yǎng)基（20%馬鈴薯提取物，2%葡萄糖，2%瓊脂）上，并在26℃下孵育7 d，使其恢復活性。勾取10 塊（1 cm2）活化好的菌絲體轉移到裝有50 mL 液體種子培養(yǎng)基（20%馬鈴薯提取物，2%麩皮提取物，2%葡萄糖，0.1% KH2PO4，0.1%MgSO4·7H2O）的100 mL 錐形瓶中，于26℃、170 r/min下孵育3 d。最后，將30 mL 液體種子（10%的接種量）轉移到裝有300 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基（20%馬鈴薯提取物，5%麩皮提取物，2%葡萄糖，0.1% KH2PO4，0.1%MgSO4·7H2O）的500 mL 錐形瓶中，于26℃、160 r/min 下分別孵育不同的時間。杜宇等［17］以胞外多糖產(chǎn)量為指標確定雞腿蘑胞外多糖的最優(yōu)發(fā)酵時間為96 h。因此，本課題擬對發(fā)酵時間為24 h、48 h、72 h、96 h、120 h 和144 h 的雞腿蘑胞外多糖進行研究。但實際上考慮到在發(fā)酵前48 h 內(nèi)培養(yǎng)基中的多糖影響較大；其次發(fā)酵144 h 的發(fā)酵液顏色已經(jīng)發(fā)黑。因此在本研究中只體現(xiàn)了發(fā)酵72 h、96 h 和120 h 的胞外多糖的性質。

達到發(fā)酵時間后，通過抽濾分離菌絲體和發(fā)酵液，發(fā)酵液用于進一步提取胞外粗多糖。發(fā)酵液經(jīng)濃縮，80%乙醇醇沉，4℃下靜置過夜。醇沉物在4 000 r/min 下離心10 min，沉淀用丙酮和無水乙醇洗滌并溶解于水中。隨后，采用Sevage 法脫除蛋白，并再次用80%乙醇沉淀12 h。醇沉物在4 000 r/min下離心10 min，沉淀用丙酮和石油醚洗滌并溶解于水中。最后，將水溶性部分揮發(fā)除去有機試劑后，冷凍干燥即得發(fā)酵時間為72 h、96 h 和120 h 的雞腿蘑胞外粗多糖［18］。

1.2.2 雞腿蘑胞外多糖的單糖分析 通過PMP（1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮）柱前衍生化-高效液相色譜（High performance liquid chromatography，HPLC）法分析雞腿蘑胞外多糖的單糖組成［19］。

1.2.2.1 HPLC 色譜條件 色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18 HPLC column（4.6 × 250 mm，5-Micron，Agilent，USA）；柱溫：25℃；檢測波長：250 nm；流速：0.8 mL/min；進樣體積：20 μL；流動相：0.5%磷酸鹽（KH2PO4-NaOH，pH 6.8），緩沖液∶乙腈，體積比83∶17（0-22.5 min）和83.5∶16.5（22.5-35 min，%，V/ V），梯度洗脫。

1.2.2.2 標準品的制備 取500 μL 混合標準液（D-甘露糖、L-鼠李糖、D-葡萄糖、D-半乳糖和D-阿拉伯糖標準品的水溶液濃度均為300 mg/mL）與500 μL 的0.6 mol/L 的氫氧化鈉溶液混勻后，精密吸取250 μL 的混合液與250 μL 的0.5 mol/L 的PMP 甲醇溶液均勻混合，于70℃烘箱中反應120 min，取出，冷卻至室溫。加入250 μL 的0.3 mol/L 的鹽酸中和過量的氫氧化鈉至pH 7，加水稀釋至5 mL，再加入等體積的氯仿溶液，充分渦旋，4 000 r/min 離心10 min，棄氯仿層，萃取 3 次，加水定容至10 mL，過0.45 μm 微孔濾膜，進行HPLC 分析。

1.2.2.3 供試品的制備 準確稱取不同發(fā)酵時間的雞腿蘑粗胞外多糖300 mg 置于安瓿瓶中，加入4 mol/L 的三氟乙酸溶液5 mL，混勻、封口，放入烘箱中于120℃條件下水解4 h，冷卻至室溫，向其加5 mL 甲醇，氮氣吹干，重復3-4 次以除去多余的三氟乙酸，然后用0.3 mol/L 的氫氧化鈉溶液溶解，定容至10 mL 容量瓶中，得雞腿蘑胞外多糖水解液。水解液按照1.2.2.2 的方法進行衍生化操作。

1.2.3 雞腿蘑胞外多糖的形貌結構 通過掃描電子顯微鏡和原子力顯微鏡來觀察胞外多糖的形貌結構。

1.2.3.1 掃描電子顯微鏡（Scanning electron microscope，SEM）分析 SEM 用于檢測雞腿蘑胞外多糖的表面形態(tài)。用導電黏合劑將樣品撒在樣品臺上，用橡膠吸球吹掃黏附在表面上的樣品。樣品噴金后，在掃描電子顯微鏡下觀察。

1.2.3.2 原子力顯微鏡（Atomic force microscope，AFM）分析 通過AFM 可觀察雞腿蘑胞外多糖的超微結構。取適量樣品溶液滴到云母表面上，吸附一定時間，然后用超純水洗滌。用濾紙吸去云母表面多余的液體，并用氮氣輕輕吹掃云母表面以獲得干燥的樣品。將干燥的樣品放置在樣品臺上，在原子力顯微鏡下觀察。實驗中采用輕敲模式，所使用的探針是TESP 硅探針，其彈性系數(shù)為42 N/m，針尖半徑約為10 nm。為了獲得高質量的圖像，實驗過程中掃描速率均小于1 Hz，分辨率為512×512，掃描角度為0°。

1.2.4 雞腿蘑胞外多糖的分子量分布 采用高效凝膠過濾色譜法（High performance gel filtration chromatography，HPGFC）分析雞腿蘑胞外多糖的相對分子質量及分子量分布情況。HPGFC 的色譜條件如下。色譜柱：Shodex OHpak 系列 SB-806 串803，流動相：0.05 mol/L 硫酸鈉 + 0.02% NaN3，流速：1 mL/min，示差折光檢測器，柱溫：40℃。將樣品溶解在液相中，用微孔濾膜過濾，進樣量為500 μL。

1.2.5 雞腿蘑胞外多糖的體外抗氧化能力測定 測定雞腿蘑胞外多糖的總抗氧化能力和對DPPH 自由基的清除能力。

1.2.5.1 總抗氧化能力測定 根據(jù)試劑盒說明書來測定胞外多糖樣品的總抗氧化能力。在樣品管中加入2.0-10.0 mg/mL 的樣品溶液（0.2 mL），隨后依次加入試劑1（1.0 mL），試劑2（2.0 mL）和試劑3（0.5 mL），37℃水浴30 min。最后加入試劑4（0.2 mL）和試劑5（0.2 mL）后充分混合，室溫下放置10 min，在520 nm 處測量吸光度。對照管除在加入試劑5 之前添加樣品溶液外，其余操作與樣品管相同。多糖樣品的總抗氧化能力通過下面公式計算：

式中：A1為樣品管的吸光度；A2為對照管的吸光度。

1.2.5.2 DPPH 自由基清除能力測定 根據(jù)文獻［20］報道的方法對雞腿蘑胞外多糖的DPPH 自由基清除能力進行測定。精密稱取5.0 mg 的DPPH 用無水乙醇定容至100 mL，于4℃下避光保存。在樣品管中加入1.0 mL 的蒸餾水，隨后依次加入1.0 mL 不同濃度（2.0-10.0 mg/mL）的多糖樣品溶液和2.0 mL 新鮮配制的DPPH 溶液。同時，在對照管中依次加入1.0 mL 的蒸餾水、1.0 mL 不同濃度的多糖樣品溶液和2.0 mL 的無水乙醇溶液，空白管中加入2.0 mL 的蒸餾水和2.0 mL 的DPPH 溶液?；旌暇鶆蚝?，在室溫下避光反應30 min，517 nm 處測量吸光度。根據(jù)下式計算DPPH 自由基清除率：

式中：A0為空白管的吸光度；A1為樣品管的吸光度；A2為對照管的吸光度。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 所有數(shù)據(jù)均以3 次實驗結果的均值±標準差表示。

2 結果

2.1 雞腿蘑胞外多糖的單糖組成分析

2.1.1 混合單糖與雞腿蘑胞外多糖的HPLC 色譜圖 根據(jù)1.2.2 項下操作，將混合單糖和樣品多糖進行 HPLC 分析，色譜圖見圖1。由圖可知，發(fā)酵72 h、96 h 和120 h 雞腿蘑胞外多糖的單糖組成是一致的，均由D-甘露糖、L-鼠李糖、D-葡萄糖、D-半乳糖和D-阿拉伯糖組成。

2.1.2 雞腿蘑胞外多糖的相對摩爾比 根據(jù)1.2.2.2項下操作，同時對不同濃度的各單糖的標準溶液進行HPLC 分析。根據(jù)各單糖的質量濃度對應的峰面積進行線性回歸分析，進而獲得各單糖的回歸方程。結果表明，5 種單糖標準品在相應濃度范圍內(nèi)線性關系均較好，結果如表1。根據(jù)回歸方程及樣品多糖的峰面積進一步計算得出不同發(fā)酵時間的雞腿蘑胞外多糖各單糖的相對摩爾比，結果見表2。由表可知，雞腿蘑胞外多糖是以半乳糖為主的雜多糖，且發(fā)酵72 h/96 h 和120 h 雞腿蘑胞外多糖的單糖組成沒有差異，但各單糖的相對摩爾比不同。

圖1 混合單糖與雞腿蘑胞外多糖的HPLC 色譜圖

表1 五種單糖的線性范圍和回歸方程

2.2 雞腿蘑胞外多糖的形貌結構分析

2.2.1 SEM 結果分析 SEM 1000×下的雞腿蘑胞外多糖的形態(tài)如圖2 所示。由圖可知，雞腿蘑胞外多糖呈板狀，且表面粗糙，有大量孔洞。發(fā)酵過程中胞外多糖的形態(tài)有很明顯的變化。發(fā)酵120 h 的多糖片段較發(fā)酵72 h 和96 h 的多糖均勻，且其板狀結構也更規(guī)則。

2.2.2 AFM 結果分析 圖3 顯示了在AFM 下觀察到的雞腿蘑胞外多糖的分子形態(tài)。平面圖像中有許多球形和不均勻的團塊，發(fā)酵120 h 的多糖團塊較發(fā)酵72 h 和96 h 的多糖大。從三維圖像中可以看出發(fā)酵過程中多糖的分子形態(tài)有很明顯的變化，發(fā)酵120 h 時多糖分子的聚集程度最高。SEM 和AFM 在結果上是一致的。

2.3 雞腿蘑胞外多糖的分子量分布分析

HPGFC 結果表明雞腿蘑胞外多糖在發(fā)酵72 h、96 h 和120 h 時的分子量（Mw）分別為1.7 kD、6 kD 和58 kD?？梢姲l(fā)酵過程中雞腿蘑胞外多糖的分子量在變大。圖4 顯示了發(fā)酵72 h、96 h 和120 h的胞外多糖的分子量分布情況。由圖可知，發(fā)酵時間越長，胞外多糖的分子量分布范圍越廣。發(fā)酵72 h 多糖的分子量分布范圍為0.46-65 kD，且主要集中在1.7-2.8 kD 之間。發(fā)酵96 h 多糖的分子量分布范圍處于0.76-259 kD 間，其分子量分布范圍更廣，且在0.76-3.8 kD 之間比較集中。而發(fā)酵120 h 多糖的分子量分布范圍為5.8-522 kD，多集中在46-96 kD 范圍內(nèi)，且有少數(shù)的多糖分子量大于96 kD。

2.4 雞腿蘑胞外多糖的體外抗氧化能力分析

2.4.1 總抗氧化能力分析 總抗氧化劑能力是評估樣品抗氧化能力的綜合指標。如圖5-A 所示，雞腿蘑胞外多糖呈現(xiàn)出濃度依賴性，在2.0-10.0 mg/mL范圍內(nèi)各種樣品的總抗氧化能力隨濃度的增加而增大。顯然，發(fā)酵時間為120 h 的多糖的總抗氧化活性最強，總抗氧化能力的強弱順序為：120 h ＞96 h ＞72 h。濃度為10 mg/mL 時，發(fā)酵72 h 的多糖總抗氧化能力為2.42 ± 0.18 U/mL，96 h 時為2.96 ±0.19 U/mL，120 h 時為4.63 ± 0.10 U/mL。

表2 雞腿蘑胞外多糖的單糖組成及摩爾比

圖2 雞腿蘑胞外多糖的SEM 圖像

圖3 雞腿蘑胞外多糖的AFM 圖像

2.4.2 DPPH 自由基清除能力分析 由圖5-B 可知，雞腿蘑胞外多糖對DPPH 自由基的清除能力呈濃度依賴性，在2.0-10.0 mg/mL 范圍內(nèi)，清除率隨樣品濃度的增加而增強。發(fā)酵120 h 的胞外多糖對DPPH自由基的清除率最高，發(fā)酵72 h 和96 h 的清除能力相當。濃度為10 mg/mL 時，雞腿蘑胞外多糖在發(fā)酵72 h、96 h 和120 h 的清除率分別為（26.52±0.84）%、（27.57±0.65）%、（54.80±0.64）%。

圖4 雞腿蘑胞外多糖的分子量分布

圖5 雞腿蘑胞外多糖的抗氧化活性

3 討論

發(fā)酵是一個動態(tài)變化的過程，目前對發(fā)酵過程中多糖的研究主要集中于多糖含量的動態(tài)積累變化，對結構和活性變化的研究較少。因此，確定發(fā)酵過程中多糖的結構和生物活性的動態(tài)變化，并在此基礎上探討結構與活性的關系，對建立發(fā)酵過程中多糖的構-效關系有很重要的意義。本研究對不同發(fā)酵時間的雞腿蘑胞外粗多糖的單糖組成、形貌結構和分子量分布進行闡述，并建立了與抗氧化活性的聯(lián)系。HPLC 分析結果表明雞腿蘑胞外多糖是以半乳糖為主的雜多糖。發(fā)酵時間為72 h、96 h 和120 h胞外多糖的單糖組成是一致的，但各單糖的相對摩爾比不同。通過掃描電子顯微鏡和原子力顯微鏡確定了發(fā)酵72 h、96 h 和120 h 胞外多糖的形態(tài)，可進一步分析得到多糖的鏈構象［21］。SEM 下胞外多糖呈板狀，表面粗糙，說明其分支較多，復水性能好［22］。板狀結構表明形成這些多糖聚集的鍵很強［23］。發(fā)酵120 h 胞外多糖的板狀結構更規(guī)則，說明此時構成多糖聚合的鍵要比發(fā)酵72 h 和96 h 的多糖強，其緊密構型反映了高度支化的多糖鏈間的強交互作用［24］。AFM 是觀察生物大分子的空間結構和表面形態(tài)的有力工具，可以觀察某些線性和支鏈多糖的微觀形態(tài)［24-25］。平面圖像中的多糖團塊表明雞腿蘑胞外多糖的分子鏈在水溶液中團聚成球形顆粒，支持其支鏈結構，且團塊的大小與多糖分子聚集的強弱有關［26］。從三維圖像中可以看出發(fā)酵120 h 的多糖分子聚合度最高，這種多糖分子的聚合現(xiàn)象是由于羥基在分子內(nèi)和分子間的強烈相互作用而產(chǎn)生的［27］。形貌結構分析表明雞腿蘑胞外多糖是一種支鏈多糖，發(fā)酵時間對其鏈構象有一定的影響。采用HPGFC 分析得到了雞腿蘑胞外多糖的相對分子質量及分子量分布范圍，結果顯示發(fā)酵過程中雞腿蘑胞外多糖的分子量變大，分子量分布范圍變廣。楊仁智研究發(fā)現(xiàn)毛頭鬼傘多糖的分子量在10-100 kD 之間和＞750 kD 比較集中，且以小分子量多糖為主［28］。本研究中發(fā)酵120 h 的多糖分子量集中在23-96 kD，可推測得知此時的胞外多糖較成熟。Wang 等［21］研究發(fā)現(xiàn)分子量大的多糖，其分子聚集作用也強，本研究中發(fā)酵120 h 多糖的分子量最大，其多糖分子的聚集度也最高，與Wang 等［21］的研究結果一致。體外抗氧化試驗結果表明雞腿蘑胞外多糖呈現(xiàn)出濃度依賴性，在測試范圍內(nèi)各種樣品的抗氧化能力隨濃度的增加而增大，與Cao 等［29］的研究一致。在相同濃度下，發(fā)酵120 h 多糖的抗氧化能力要高于發(fā)酵72 h 和96 h 的多糖。

研究報道多糖的抗氧化作用與其結構有關，多糖鏈構象、分子結構、單糖組成、分子量和溶解度等都會影響到活性［30-31］。本研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵72 h、96 h 和120 h 雞腿蘑胞外多糖的單糖組成沒有顯著差異，但其形貌結構和分子量分布有顯著不同。因此，發(fā)酵120 h 雞腿蘑胞外多糖優(yōu)越的抗氧化活性可能與其獨特的形貌結構和分子量分布有關。推測發(fā)酵120 h 胞外多糖的多糖鏈間的強交互作用以及多糖分子的高度聚集使得其抗氧化活性更強。其次，有研究報道分子量過大的多糖一般無活性，而分子量過低的多糖不能形成活性聚合物結構，所以活性多糖具有一定的分子量范圍［32］。發(fā)酵120 h 的多糖分子量分布較廣，且以低分子量為主，這可能也是其抗氧化活性較高的原因。然而，由于本研究是采用傳統(tǒng)的制備粗多糖的方法來制備雞腿蘑胞外粗多糖的，目前主要是為了考察胞外粗多糖的基本理化性質與抗氧化活性是否存在相關性，因此未對粗多糖的化學成分和純度進行測定。對粗多糖做進一步的純化處理，并更深入地對其進行結構鑒定及其他功能考察是本課題下一步研究工作的重點。

4 結論

本課題對發(fā)酵時間為72 h、96 h 和120 h 的雞腿蘑胞外粗多糖的單糖組成，形貌結構和分子量分布進行表征，并進一步探討與抗氧化活性的聯(lián)系。單糖組成分析結果表明不同發(fā)酵時間雞腿蘑胞外多糖的單糖組成是一致的，但各單糖的相對摩爾比不同。形貌結構分析表明，發(fā)酵120 h 雞腿蘑胞外多糖的板狀結構更加規(guī)則，分子聚集作用更強。分子量分布結果表明，發(fā)酵120 h 胞外多糖的分子量更大，分子量分布范圍也更廣?？寡趸囼灲Y果表明發(fā)酵120 h 多糖的抗氧化活性更強。推測發(fā)酵120 h 胞外多糖的多糖鏈的緊密構象、多糖分子的高度聚集以及較廣的分子量分布使得其抗氧化活性較發(fā)酵72 h和96 h 的多糖優(yōu)越。因此，本研究表明雞腿蘑胞外粗多糖的抗氧化活性可能與形貌結構和分子量分布有關。