潘銀來(lái) 邱春輝 王藝?yán)?張子平，5

（1. 大黃魚(yú)育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧德 352103；2. 福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，福州 350001；3. 福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福州 350001；4. 集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廈門(mén) 361021；5. 福建農(nóng)林大學(xué)海洋研究院 福建省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350001）

核酸藥物是一類(lèi)具有不同功能的DNA 或RNA，其具有特定的靶點(diǎn)和作用機(jī)制，通常在基因或其表達(dá)水平上發(fā)揮作用［1］。這些藥物具有很高的特異性，可以靶向選定的基因、mRNA 和非編碼RNA，而且副作用比傳統(tǒng)的藥物?。?］。一般包括核酸適配體（Aptamer）、抗基因（Antigene）、核酶（Ribozyme）、反 義 寡 核 苷 酸（Antisense oligonucleotide，ASO）、RNA 干擾劑等［3］。在過(guò)去的25 年里，用RNA 分子作為治療藥物從概念走向了臨床。早期因?yàn)镽NA 分子不穩(wěn)定易被降解，在體內(nèi)有相對(duì)較短的半衰期［4］，被認(rèn)為其難以作為有效的治療藥物。近年來(lái)，隨著化學(xué)穩(wěn)定性的改進(jìn)如作為第一代核酸藥物的硫代磷酸修飾［5］、堿基修飾［6］及藥物遞送載體，如脂質(zhì)體遞送系統(tǒng)［7］及納米載體結(jié)合細(xì)胞穿透肽［8］等新的遞送系統(tǒng)的開(kāi)發(fā)，使得半衰期較短的RNA 分子成為臨床藥物研究的新寵，在生物制藥領(lǐng)域掀起了一股RNA 藥物的熱潮。

近年來(lái)，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，成為世界食物生產(chǎn)發(fā)展最快的產(chǎn)業(yè)之一。然而由于飼養(yǎng)密度的提高，養(yǎng)殖環(huán)境的惡化造成了水產(chǎn)養(yǎng)殖生物病害的頻發(fā)。疾病暴發(fā)已成為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要制約因素［9］。例如，病毒能引起大量水產(chǎn)動(dòng)物的病害。在脊椎動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的幾乎所有類(lèi)型的病毒家族現(xiàn)在都可以在魚(yú)類(lèi)中被找到［10］。有研究團(tuán)隊(duì)對(duì)9 個(gè)動(dòng)物門(mén)中220 多種無(wú)脊椎動(dòng)物標(biāo)本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)了1 445 種全新的RNA 病毒，其中包括一些足以構(gòu)成新家族的RNA 病毒［11］。最近，Shi 等［10］在兩棲類(lèi)、肺魚(yú)、輻鰭魚(yú)、軟骨魚(yú)和無(wú)顎魚(yú)中確定了214個(gè)獨(dú)特的、以前從未描述過(guò)的脊椎動(dòng)物病毒種類(lèi)，其中196 個(gè)特異地存在于爬行動(dòng)物中。寄生蟲(chóng)也常引起病害，如幾乎所有海水硬骨魚(yú)均會(huì)被刺激隱核蟲(chóng)感染，對(duì)于海水魚(yú)苗的感染率和死亡率有時(shí)可達(dá)100%［12］。由于目前尚無(wú)合適、有效針對(duì)刺激隱核蟲(chóng)的藥物，導(dǎo)致一旦蟲(chóng)害爆發(fā)，造成的經(jīng)濟(jì)損失巨大。

RNA 藥物在水產(chǎn)養(yǎng)殖病害的防治方面有重大的應(yīng)用前景。在這篇綜述中，我們首先簡(jiǎn)要回顧了RNAi 和CRISPR/Cas9 技術(shù)的起源、原理與應(yīng)用，總結(jié)了RNA 藥物的發(fā)展與應(yīng)用。接著我們將重點(diǎn)放在該技術(shù)在抑制水產(chǎn)病毒和寄生蟲(chóng)方面的研究進(jìn)展。最后結(jié)合我們團(tuán)隊(duì)的最新成果，討論了RNA 藥物的進(jìn)一步發(fā)展，特別是在水產(chǎn)上的應(yīng)用前景和未來(lái)方向。

1 RNAi 技術(shù)

RNAi 是指與相關(guān)基因或編碼區(qū)域相對(duì)應(yīng)的雙鏈RNA（dsRNA）被引入細(xì)胞中，導(dǎo)致相應(yīng)mRNA 降解的轉(zhuǎn)錄后基因沉默［13］。Guo 等［14］將par-1基因的正、反義鏈RNA 注射到秀麗隱桿線蟲(chóng)（Caenorhabditis elegans）中，發(fā)現(xiàn)其能阻斷該基因的表達(dá)，意外地觀察到了雙鏈RNA 在動(dòng)物細(xì)胞中特異地抑制基因的表達(dá)。隨后Fire 等［15］將mex-3基因的dsRNA 注射到秀麗隱桿線蟲(chóng)發(fā)現(xiàn)，dsRNA 能夠高效特異性地抑制線蟲(chóng)中目的基因表達(dá)，并將這種效應(yīng)稱(chēng)之為RNA干涉（RNA interference，RNAi）。隨后多個(gè)團(tuán)隊(duì)在植物［16］、昆蟲(chóng)［17］、水產(chǎn)動(dòng)物［18］等多種生物中也報(bào)道了類(lèi)似的結(jié)果。

RNAi 作用原理可分為起始階段和效應(yīng)階段，有些低等物種如秀麗隱桿線蟲(chóng)［19］和擬南芥［20］還存在級(jí)聯(lián)放大階段，其簡(jiǎn)明原理圖如圖1。起始階段：由RNA 病毒入侵，轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)錄，基因組中反向重復(fù)序列轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的dsRNA 分子在細(xì)胞內(nèi)被RNaseIII 家族中的Dicer 酶或其同源物剪成21-23 nt 的小干擾RNA（Small interference RNA，siRNA）。效應(yīng)階段：siRNA 被裝載至其他一些相關(guān)蛋白復(fù)合物中如RNAi特異性的核酸外切酶、內(nèi)切酶及輔助識(shí)別同源序列蛋白等，并形成RNA 誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RNA-induced silencing complex，RISC）。當(dāng)RISC 結(jié)合上siRNA 后被活化并通過(guò)解旋酶的作用打開(kāi)siRNA 的雙鏈結(jié)構(gòu)，形成單鏈siRNA。RISC 被活化后通過(guò)siRNA 反義鏈去尋找潛在的能與其互補(bǔ)的靶mRNA 序列并與之結(jié)合，然后RISC 復(fù)合物中的RNase 在靶mRNA與siRNA 結(jié)合區(qū)域的中間切斷標(biāo)靶mRNA，引發(fā)靶mRNA 的特異性降解。級(jí)聯(lián)放大［21］：在RNA 依賴(lài)性RNA 聚合酶（RDRs）的作用下，以mRNA 為模板，siRNA 為引物，擴(kuò)增產(chǎn)生足夠數(shù)量的dsRNA 作為底物提供給Dicer 酶，產(chǎn)生更多的siRNA，從而使效應(yīng)階段反復(fù)發(fā)生。

RNAi 具有特異性地沉默靶基因的能力，已被廣泛地用于通過(guò)降低表達(dá)而不改變基因型來(lái)研究特定基因的功能［22］。我們團(tuán)隊(duì)利用RNAi 研究了一些水產(chǎn)動(dòng)物基因的功能。例如，在雜色鮑（Haliotis diversicolor）胚胎發(fā)育過(guò)程中加入其胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白7（Insulin-like growth factor binding protein 7，IGFBP7）的dsRNA 會(huì)引起發(fā)育的異常［23］；在體外培養(yǎng)的雜色鮑血淋巴中加入saIGFBP7的dsRNA 會(huì)顯著影響培養(yǎng)的鮑血細(xì)胞中IGFBP7 的mRNA 和蛋白質(zhì)表達(dá)并顯著降低血淋巴的數(shù)量［24］。通過(guò)RNAi 技術(shù)我們還驗(yàn)證了暴露于缺氧，熱應(yīng)激，缺氧加熱應(yīng)激條件下的雜色鮑血淋巴中參與對(duì)低氧/熱應(yīng)激的免疫應(yīng)答的基因和信號(hào)通路［25］。在研究缺氧應(yīng)激后細(xì)菌感染引起的雜色鮑的免疫抑制的機(jī)制中通過(guò)RNAi 技術(shù)我們發(fā)現(xiàn)HdAKT 被抑制后PI3K-AKT 信號(hào)通路的多數(shù)基因受到抑制［26］。dsRNA 可通過(guò)細(xì)胞微管在細(xì)胞間傳遞，RNAi 不僅可用于研究基因功能、基因的表達(dá)調(diào)控，還可用于基因治療、鑒定藥物靶點(diǎn)和候選疫苗［27］，以及作為RNA 藥物通過(guò)干擾病原體的傳播，發(fā)育和增殖來(lái)控制傳染?。?8］。

圖1 RNAi 簡(jiǎn)明原理圖

2 CRISPR/Cas9 技術(shù)

成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）是一個(gè)特殊的DNA 重復(fù)序列家族，其廣泛分布于細(xì)菌和古細(xì)菌基因組中。Cas9 是一種在很多細(xì)菌中都可以表達(dá)的核酸內(nèi)切酶，它在細(xì)菌中發(fā)揮著一種防御作用以避免外源DNA 如病毒或者質(zhì)粒等的入侵。隨后的研究發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9 系統(tǒng)是針對(duì)入侵病毒病原體的一種細(xì)菌和古細(xì)菌的適應(yīng)性免疫防御系統(tǒng)，其使用源自過(guò)去感染的病毒的RNA 片段經(jīng)RNA 引導(dǎo)的核酸酶作用，通過(guò)互補(bǔ)堿基配對(duì)靶向切割病毒DNA［29］。根據(jù)核酸內(nèi)切酶的識(shí)別和切割機(jī)制的不同，CRISPR/Cas 系統(tǒng)可分為Ⅰ型、II 型和Ⅲ型［30］。其中來(lái)自化膿鏈球菌的II 型CRISPRCas9 系統(tǒng)由于其組成簡(jiǎn)單，已被改造成為最簡(jiǎn)單和應(yīng)用最廣泛的基因組靶向編輯工具。其核心組分是RuvC 蛋白結(jié)構(gòu)域和HNH 核酸酶結(jié)構(gòu)域的內(nèi)切核酸酶Cas9［31］，以及結(jié)合CRISPR RNA（crRNA）和反式激活crRNA（tra-crRNA）。crRNA 是由前體 crRNA經(jīng)反式激活crRNA 和RNase ⅢNase 的［32］。crRNA將Cas9 蛋白引導(dǎo)到目標(biāo)DNA 雙鏈上并發(fā)揮核酸內(nèi)切酶的作用，tra-crRNA 與crRNA 進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)，其中前20 個(gè)堿基確定Cas9 核酸內(nèi)切酶的特異性。在與crRNA 指導(dǎo)序列互補(bǔ)的位點(diǎn)處，Cas9 的HNH核酸酶結(jié)構(gòu)域切割互補(bǔ)鏈，而Cas9 的RuvC 蛋白結(jié)構(gòu)域切割非互補(bǔ)鏈［33］，其機(jī)制圖如圖2。該系統(tǒng)發(fā)揮作用不僅需要crRNA 中存在與目標(biāo)基因堿基互補(bǔ)配對(duì)的序列，還需要在目標(biāo)基因的靶向結(jié)合區(qū)的下游存在前間區(qū)序列鄰近基序（Protospacer adjacent motif，PAM）［34］。只 有 當(dāng) 適 當(dāng) 的PAM 位 于 目 標(biāo)序列后面時(shí)，crRNA-tracrRNA 復(fù)合體才能夠引導(dǎo)Cas9［35］。在不同的生物體中，PAM 序列不同。在研究廣泛的化膿性鏈球菌中，PAM 序列為NGG［36］。

圖2 CRISPR 原理模式圖

隨著研究的深入，研究人員用sgRNA［37］代替了crRNA 和tra-crRNA，sgRNA 序列中有一個(gè)模擬crRNA-tra-crRNA 復(fù)合體的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。sgRNA 由3部分組成：堿基互補(bǔ)配對(duì)區(qū)（Base-pairing region）、Cas9 把 手（Cas9 handle）和 終 止 子（terminator）。Cas9-sgRNA 在同源的靶序列中引入位點(diǎn)特異性雙鏈DNA 斷裂（Double strand break，DSB）后，細(xì)胞可以通過(guò)非同源末端連接（Non-homologous end joining，NHEJ）和同源定向修復(fù)（Homology-directed repair，HDR）兩種方式對(duì)DNA 進(jìn)行修復(fù)。NHEJ 修復(fù)途徑誘導(dǎo)產(chǎn)生小的隨機(jī)插入或缺失突變（插入缺失），使得靶基因編碼區(qū)中的密碼子發(fā)生移位，導(dǎo)致編碼的基因功能的喪失［38-39］；HDR 途徑是當(dāng)質(zhì)?；騿捂湽押塑账幔ü丫郏┠０逡泊嬖跁r(shí)，基因組 DNA 通過(guò)與外源提供的DNA 模板進(jìn)行同源重組引入特定靶位點(diǎn)的點(diǎn)突變或所需序列的插入/缺失，造成靶位點(diǎn)的糾正或者靶向插入外源基因，從而產(chǎn)生特異性和精確的核苷酸或序列替換［40］。

CRISPR/Cas9 系統(tǒng)代表了一種功能強(qiáng)大，高度特異性和適應(yīng)性強(qiáng)的工具，可以糾正或治療因細(xì)胞突變引起的癌癥，如直接靶向癌基因受體酪氨酸激酶Erb2［41］。通過(guò)多重Cas9 永久性切除45-55外顯子有望治愈杜興氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥（Duchenne muscular dystrophy，DMD）［42］。一些病毒病原體也已采用CRISPR 系統(tǒng)對(duì)病毒DNA 進(jìn)行破壞，如使用針對(duì)性編輯多個(gè)基因來(lái)減少乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）核心和表面蛋白的產(chǎn)生［43］，靶向人乳頭瘤病毒（Human papilloma virus，HPV）的E6和E7 基因從而抑制病毒［44］。靶向基因產(chǎn)生功能缺失突變體是一種基于反向遺傳學(xué)來(lái)闡明其功能的常用方法。在水產(chǎn)動(dòng)物方面，Sun 等［45］用CRISPR /Cas9 工具敲除對(duì)蝦中的幾丁質(zhì)酶基因（EcChi4），然后用副溶血弧菌或嗜水鏈球菌攻擊時(shí)發(fā)現(xiàn)，EcChi4基因缺失組的蝦死亡率顯著高于野生型蝦，證實(shí)了幾丁質(zhì)酶基因在免疫防御中的功能。該技術(shù)將來(lái)可以研究其他十足動(dòng)物無(wú)法輕易解決的重要生物學(xué)問(wèn)題。Cai 等［46］使用CRISPR / Cas9 獲得缺氧誘導(dǎo)因子抑制因子（Factor-inhibiting HIF，F(xiàn)IH）突變的斑馬魚(yú)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)IH缺失型的斑馬魚(yú)相比野生型對(duì)低氧條件的耐受性更高。Zhang 等［47］在對(duì)蝦中采用CRISPR / Cas9 技術(shù)對(duì)EcMIH基因進(jìn)行敲除發(fā)現(xiàn)，EcMIH基因敲除的對(duì)蝦體長(zhǎng)增加，并且發(fā)育時(shí)間縮短。同時(shí)，EcMIH的敲除沒(méi)有引起諸如早期死亡或畸形的健康問(wèn)題。使得CRISPR / Cas9 技術(shù)在水產(chǎn)育種中也具有廣闊的應(yīng)用前景。

在華中科技大學(xué)水電學(xué)院，黨委統(tǒng)籌，細(xì)化分工，研究工作，羅列清單，各司其責(zé)，分層指導(dǎo)，聯(lián)合構(gòu)建關(guān)工委工作大平臺(tái)。學(xué)院通過(guò)切實(shí)加強(qiáng)基層黨建帶動(dòng)二級(jí)關(guān)工委的建設(shè)，黨政工橫向合力，黨委書(shū)記、分管學(xué)生思政副書(shū)記、離退休支部書(shū)記、老協(xié)負(fù)責(zé)人，以及工會(huì)主席齊抓共管，將關(guān)工委工作納入各自日常工作；通過(guò)抓關(guān)鍵人，抓書(shū)記、抓執(zhí)行主任，構(gòu)建二級(jí)關(guān)工委工作平臺(tái)，打造品牌固化成果；不斷完善青年學(xué)生志愿者流動(dòng)服務(wù)制度，加強(qiáng)研討影響老同志參與關(guān)工委工作的因素和新時(shí)代大學(xué)生的要求，發(fā)揮老同志余熱，著力培養(yǎng)“六有”大學(xué)生。

3 RNA 藥物的發(fā)展與應(yīng)用

寡核苷酸是一類(lèi)20 個(gè)左右堿基的短鏈核苷酸（包括DNA 和RNA）的總稱(chēng)［48］。寡核苷酸可以很容易地和它們的互補(bǔ)鏈結(jié)合，所以常用來(lái)作為探針確定DNA 或RNA 的結(jié)構(gòu)；而其作為藥物候選應(yīng)用的研究則始于大約30 年前，包括了ASO［49］，Aptamer等［50］及近15 年來(lái)對(duì)各類(lèi)siRNA 的研究。在這期間，醫(yī)藥工業(yè)界開(kāi)展了大量的臨床試驗(yàn)。

3.1 RNA藥物在醫(yī)藥工業(yè)界的發(fā)展與應(yīng)用

早在1998 年美國(guó)藥物管理局（FDA）就批準(zhǔn)了其首個(gè)基因沉默“反義療法”，一種名為Vitravene（fomivirsen）的藥物，用于治療免疫系統(tǒng)較弱的個(gè)體的巨細(xì)胞病毒感染。2013 年，賽諾菲（Sanofi）旗下的健贊公司（Genzyme Corporation）的寡核苷酸藥物Mipomersen 上市，掀起了全球RNA 藥物研發(fā)的熱潮。RNA 藥物將正式加入藥物大軍，成為繼化學(xué)藥物、生物蛋白藥物之后的第三大新藥類(lèi)型。目前RNA 的藥物主要有4 類(lèi)：siRNA、ASO、Aptamer 和miRNA。其作用機(jī)理如表1。

表1 RNA 的藥物的作用機(jī)理

RNA 藥物用途廣泛，可以治療癌癥、傳染病、激素性疾病甚至亨廷頓病等神經(jīng)性疾病，目前全球有多家RNA 藥物研發(fā)公司在進(jìn)行相關(guān)RNA 藥物研發(fā)。2018 年8 月10 日FDA 批準(zhǔn)了阿里拉姆制藥公司（Alnylam）的RNAi 藥物Onpattro（主要成分為Patisiran），其通過(guò)靜脈注射用于治療轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白淀粉樣變性（Hereditary transthyretin-mediated，hATTR）引起的神經(jīng)損傷。這是美國(guó)上市的第一個(gè)RNAi藥物、也是第一個(gè)上市用于治療hATTR的藥物。該藥將成為RNAi 現(xiàn)象被發(fā)現(xiàn)整整20 年以來(lái)上市的首款RNAi 藥物［53］。

盡管RNA 藥物的研發(fā)已有30 年歷史，但目前市場(chǎng)上被批準(zhǔn)生產(chǎn)的RNA 相關(guān)藥物卻很少（表2），而相關(guān)的用于農(nóng)業(yè)病害防治的RNA 藥物就更少了。

3.2 RNA農(nóng)藥在重要經(jīng)濟(jì)農(nóng)作物害蟲(chóng)方面的研究與應(yīng)用

小分子RNA 是RNA 藥物的核心。目前主要是基于RNA 干擾技術(shù)和最新的CRISPR/Cas9 技術(shù)，兩者都能用于抑制特定基因，阻止病害生物進(jìn)行相關(guān)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄、翻譯、表達(dá)。一些研究表明，dsRNA 可以通過(guò)人工飼料喂養(yǎng)昆蟲(chóng)或在轉(zhuǎn)基因寄主植物中表達(dá)，導(dǎo)致目標(biāo)物種的死亡［61-62］。目前研究和開(kāi)發(fā)的重點(diǎn)是抗經(jīng)濟(jì)作物的重要害蟲(chóng)，包括西方玉米根蟲(chóng)（Diabrotica virgifera virgifera，WCR），南方玉米根蟲(chóng)（Diabrotica undecimpunctata howardii，SCR）、科羅拉多馬鈴薯甲蟲(chóng)（Leptinotarsa decemlineata）［61］、棉鈴蟲(chóng)（Helicoverpa armigera）［63］、甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）［64］和褐飛虱（Nilaparvata lugens）［65］的RNA 藥物。玉米根蟲(chóng)是北美最主要的農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)之一，其幼蟲(chóng)侵食玉米根部，引起玉米枯萎死亡，造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。早在2003 年孟都山公司就進(jìn)行大量投資，研發(fā)抗玉米根蟲(chóng)的產(chǎn)品?；赗NA 干擾技術(shù)，設(shè)計(jì)出Snf7直向同源物（DvSnf7）的dsRNA 來(lái)防治玉米根蟲(chóng)。有研究對(duì)DvSnf7 RNA 進(jìn)行了詳細(xì)的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，表明其具有針對(duì)西方玉米根蟲(chóng)的靶向活性，與對(duì)照相比對(duì)生態(tài)不造成影響［66］。且對(duì)其他昆蟲(chóng)如DvSnf7的dsRNA 喂養(yǎng)的蜜蜂幼蟲(chóng)和成蟲(chóng)均未有任何不良影響［67］。2017 年6 月15 日美環(huán)保署批準(zhǔn)了第一個(gè)以RNA 干擾技術(shù)為基礎(chǔ)的一種特殊殺蟲(chóng)劑＜DvSnf7 dsRNA。這是RNA 藥物正式應(yīng)用在農(nóng)業(yè)的首例。與傳統(tǒng)殺菌劑需要噴施不同，該技術(shù)通過(guò)將DvSnf7 dsRNA 編碼信息加入到SmartStax Pro 轉(zhuǎn)基因玉米中。當(dāng)西方玉米根蟲(chóng)開(kāi)始取食植物時(shí)，這種植物自己產(chǎn)生的dsRNA 能夠干擾玉米根蟲(chóng)的Snf7 基因，進(jìn)而殺死害蟲(chóng)。當(dāng)施用于土壤時(shí)，DvSnf7 RNA 會(huì)迅速降解，不會(huì)在環(huán)境中持續(xù)存在或積累［68］。DvSnf7 dsRNA的快速降解為未來(lái)基于RNA 的農(nóng)產(chǎn)品的生態(tài)安全提供了依據(jù)。有研究將dsRNA 摻入水和沉積物的水柱中模擬未結(jié)合的dsRNA 或噴霧至植物組織引起的漂移，測(cè)定dsRNA 在水柱中的消散和分配至沉淀物的動(dòng)態(tài)情況。發(fā)現(xiàn)dsRNA 在水柱中快速消散，并在96 h 后低于檢測(cè)限，表明在分配到沉積物之前dsRNA已經(jīng)在水柱中快速降解［69］。與轉(zhuǎn)基因作物和化學(xué)農(nóng)藥不同的是，此類(lèi)RNA 噴劑僅僅是讓小分子的干擾RNA 覆蓋在作物表層，殺死食用作物的害蟲(chóng)，整個(gè)技術(shù)也只是在基因表達(dá)的水平上進(jìn)行調(diào)控，不對(duì)植物基因進(jìn)行修飾，同時(shí)，RNA 干擾引起的基因沉默效應(yīng)通常只會(huì)持續(xù)幾天或者幾周，不會(huì)出現(xiàn)毒素的累積。RNA 藥物具有高效性、特異性，且不污染環(huán)境，無(wú)殘留，因此具有很高的實(shí)用價(jià)值。

表2 已被批準(zhǔn)上市生產(chǎn)RNA 相關(guān)藥物

4 核酸藥物基礎(chǔ)技術(shù)在抑制水產(chǎn)病毒中的應(yīng)用

4.1 RNAi參與動(dòng)物的天然抗病毒防御機(jī)制

大多數(shù)生物在進(jìn)化過(guò)程中已經(jīng)發(fā)展出幾種防御機(jī)制來(lái)感知和對(duì)抗病毒的感染。其中包括干擾素（Interferon，IFN）介導(dǎo)的［70］及如前所述的基于RNAi 的抗病毒機(jī)制［71］。

在病毒基因組中通常是在病毒復(fù)制期間產(chǎn)生的dsRNA 被宿主識(shí)別為與病毒感染相關(guān)的分子模式，誘導(dǎo)一系列免疫反應(yīng)［72］。在脊椎動(dòng)物細(xì)胞中，長(zhǎng)dsRNA 的引入通常誘導(dǎo)先天性免疫反應(yīng)，構(gòu)成限制病毒復(fù)制的第一道防線［73］。病毒的dsRNA 在細(xì)胞內(nèi)存在激活Toll 樣受體3（TLR3）途徑以及dsRNA識(shí)別蛋白（dsRNA 依賴(lài)性蛋白激酶PKR 和20-50 寡腺苷酸/核糖核酸酶L），導(dǎo)致RNA 轉(zhuǎn)錄物的非特異性降解，即IFN 反應(yīng)的產(chǎn)生和宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的整體關(guān)閉［74］。

由激活I(lǐng)FN 途徑引起的非特異性抑制效應(yīng)最初阻礙了RNAi 在脊椎動(dòng)物細(xì)胞中的應(yīng)用。Elbashir等［51］后來(lái)解決了這個(gè)問(wèn)題，他們發(fā)現(xiàn)siRNA（大約20-25 bp）而不是長(zhǎng)dsRNA（＞ 30 bp）可有效地敲低特定基因的轉(zhuǎn)錄物的量而不激活I(lǐng)FN 系統(tǒng)。因?yàn)楦邼舛鹊膕iRNA 被證明可以激活I(lǐng)FN 系統(tǒng)的成分故經(jīng)常推薦使用最小的有效siRNA 劑量［75-76］。

4.2 抑制鯉皰疹病毒

皰疹病毒是有囊膜的雙鏈線性DNA 病毒，感染對(duì)象包括哺乳動(dòng)物、兩棲類(lèi)和魚(yú)類(lèi)等脊柱動(dòng)物。鯉皰疹病毒屬包含感染鯉魚(yú)的I 型、II 型和Ⅲ型鯉皰疹病毒。Gotesman 等［78］在感染Ⅲ型鯉皰疹病毒的鯉魚(yú)腦細(xì)胞中采用siRNA 抑制與Ⅲ型鯉皰疹病毒（Cyprinid herpesvirus Ⅲ，CyHV-3）復(fù)制相關(guān)的胸苷激酶（Thymidine kinase，TK）和DNA 聚合酶（DNA polymerase，DP）的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，用靶向TK或DP基因的siRNA 處理感染了病毒的CCB 細(xì)胞能夠減少病毒顆粒的釋放，進(jìn)而抑制CyHV-3 病毒的感染。在2016 年，Zhao 等［79］通 過(guò)CRISPR/Cas9 技術(shù)也對(duì)CyHV-3 病毒的基因TK和DP進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，Cas9-TK 能夠抑制細(xì)胞中病毒DNA 的復(fù)制，但不能阻斷病毒的釋放；而Cas9-DP 誘導(dǎo)的病毒抑制作用雖然不如Cas9-TK 的效果強(qiáng)，但它卻能阻斷CyHV-3 病毒的釋放，證實(shí)了CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在防治CyHV-3病毒方面的有效性。

4.3 抑制對(duì)蝦白斑綜合癥病毒

有幾項(xiàng)研究表明，在病毒攻擊之前施用病原體特異性dsRNA/siRNA 可以顯著防止幾種病毒種類(lèi)如黃頭病毒（Yellow head virus，YHV）［80-81］；桃拉綜合征病毒（Taura syndrome virus，TSV）［82-83］和對(duì)蝦白斑綜合癥病毒（White spot syndrome virus，WSSV）［84-85］的復(fù)制。

WSSV 病毒是一種雙鏈環(huán)狀DNA 桿狀型病毒，一旦感染對(duì)蝦，病毒顆粒會(huì)遍布蝦的體表和大多數(shù)組織并在血淋巴中無(wú)處不在地循環(huán)，病毒感染后3-7 d 內(nèi)蝦的死亡率可高達(dá) 100%。WSSV 基因組測(cè)序揭示了其為292 967 個(gè)堿基對(duì)構(gòu)成的環(huán)狀序列［86］。WSSV 病毒粒子由5 個(gè)主要的和約13 個(gè)次要的蛋白組成［87］。Xu 等［88］用一種特異性的21 bp 短干擾RNA（vp28-siRNA）處理感染W(wǎng)SSV 病毒的對(duì)蝦發(fā)現(xiàn)，其能有效地降低感染W(wǎng)SSV 的蝦的死亡率。在3 次注射vp28-siRNA 后，病毒可從被感染的蝦體內(nèi)被完全根除。序列特異性的vp28-siRNA 對(duì)vp28 基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的抑制導(dǎo)致病毒DNA 復(fù)制的抑制或延遲，表明VP28 蛋白參與蝦的WSSV 感染。Alenton等［89］利用RNAi 技術(shù)去干擾WSSV 基因的非結(jié)構(gòu)蛋白VP9 的功能，發(fā)現(xiàn)用VP9-dsRNA 和GFP-dsRNA注射的WSSV 感染的蝦分別顯示出80%和70%的存活率，相比之下，在25 dpi（Days post infection，感染后天數(shù)）時(shí)PBS 注射的蝦的存活率為0%。使用較高的病毒濃度重新同時(shí)感染存活的蝦和PBS 對(duì)照組未感染的新蝦，與GFP-dsRNA 和PBS 組相比，VP9-dsRNA 的存活率為67%，而GFP-dsRNA 和PBS組的存活率為0%。表明VP9 基因在WSSV 的復(fù)制中發(fā)揮重要作用，能抑制WSSV 的感染，可開(kāi)發(fā)為RNAi 治療WSSV 感染的蝦的有效靶基因。

4.4 抑制虹彩病毒

真鯛虹彩病毒（Red seabream iridovirus，RSIV）屬于虹彩病毒科中的虹彩病毒屬，是一種雙鏈DNA病毒。該病毒基因組編碼一個(gè)主衣殼蛋白（Major capsid protein，MCP）基因和92 個(gè)特定的開(kāi)放讀碼框架［90］，能感染真鯛等海水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)，造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。目前對(duì)真鯛虹彩病毒還沒(méi)有很好的治療方法，因此很有必要研究一種新的途徑來(lái)抑制真鯛虹彩病毒的復(fù)制。Dang 等［91］針對(duì)真鯛虹彩病毒的MCP 基因設(shè)計(jì)siRNA（siR-MCP），用不同濃度的siR-MCP 或MCP 轉(zhuǎn)染感染RSIV 病毒的比目魚(yú)胚胎細(xì)胞（Hirame natural embryo，HINAE）發(fā)現(xiàn)，其對(duì)MCP mRNA 的表達(dá)有顯著的影響，在病毒感染后84 和96 h，siR-MCP 分別使MCP 基因的表達(dá)降低了55.2%和97.1%，同時(shí)可檢測(cè)到RSIV 的復(fù)制量的下降。siR-MCP 使MCP 基因的表達(dá)下降有效地和特異性地抑制了RSIV 復(fù)制，并阻礙細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中病毒的產(chǎn)生，充分說(shuō)明RNAi 抗真鯛虹彩病毒的高效性。

虎紋蛙虹彩病毒（Iridovirus-tiger frog virus，TFV）屬于虹彩病毒科、蛙病毒屬。主要感染蛙類(lèi)，導(dǎo)致其大量死亡，造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。由于虎紋蛙虹彩病毒免疫原性很低，常規(guī)的疫苗接種效果一般都不理想。RNAi具有高效降解同源mRNA 的特點(diǎn)，能有效地解決疫苗接種效果差的問(wèn)題。Xie 等［92］通過(guò)表達(dá)的靶向MCP基因的siRNA 轉(zhuǎn)染已感染TFV病毒的肥頭鯉（Fathead minnow，F(xiàn)HM）肌肉細(xì)胞，通過(guò)定量PCR 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)MCP 的mRNA 表達(dá)水平降低、出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)推遲、細(xì)胞中TFV 滴度和病毒顆粒減少，表明靶向MCP基因的siRNA 的方法能有效抑制魚(yú)類(lèi)細(xì)胞中的TFV 復(fù)制，為養(yǎng)殖鯉魚(yú)病毒的治療提供了潛在的方法。

4.5 抑制草魚(yú)呼腸孤病毒

草魚(yú)呼腸孤病毒（Grass carp reovirus，GCRV）為無(wú)囊膜病毒，該病毒的二十面體衣殼含有由11 個(gè)片段組成的線性雙鏈RNA 基因組，共編碼7 種結(jié)構(gòu)蛋白和5 種非結(jié)構(gòu)蛋白。草魚(yú)呼腸孤病毒是危害性最大的草魚(yú)病原體，能引起草魚(yú)病毒性出血，常在水溫25-30℃感染當(dāng)年生的草魚(yú)種，死亡率高。

Ma 等［93］在感染GCRV 病毒的草魚(yú)腎細(xì)胞系（Ctenopharyngodon idelluskidney cell，CIK）中，針對(duì)草魚(yú)呼腸孤病毒的連接黏附受體-A（Junctional adhesion molecule-A，JAM-A） 的DNA 序列用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)進(jìn)行特異性的敲除發(fā)現(xiàn)，其能有效地抑制多種不同基因型的GCRV，表明草魚(yú)JAM-A 對(duì)于GCRV 的感染是必需的，而特異性地敲除JAM-A 能有效地抑制病毒，是控制草魚(yú)呼腸孤病毒的一種潛在方法。

5 在寄生蟲(chóng)防治的應(yīng)用

在寄生蟲(chóng)病防治方面，通過(guò)RNAi 分析寄生蟲(chóng)基因功能不僅可以用來(lái)研究寄主與寄生蟲(chóng)之間的相互作用，而且還可以用來(lái)探索特定基因?qū)纳x(chóng)存活的影響。Ohashi 等［94］首次在新貝尼登蟲(chóng)（Neobenedenia girellae）通過(guò)浸泡dsRNA 來(lái)介導(dǎo)血管相關(guān)基因vlg1 和vlg2 的沉默發(fā)現(xiàn)，能降低該寄生蟲(chóng)的孵化率，證實(shí)RNAi 能成功干擾新貝尼登蟲(chóng)基因，也可用來(lái)研究寄生蟲(chóng)基因的功能。有研究采用RNAi技術(shù)針對(duì)魚(yú)虱幾丁質(zhì)酶2（Chitinases 2，Chi2）基因和血紅素過(guò)氧化物酶（Heme peroxidase 1，HPX1）基因的進(jìn)行干擾發(fā)現(xiàn)，均能降低魚(yú)虱幼蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)能力、降低其對(duì)宿主的感染能力［95］。這些研究有助于鑒定和驗(yàn)證新的抗寄生蟲(chóng)藥的靶標(biāo)和進(jìn)一步發(fā)展基于RNAi 的水產(chǎn)抗寄生蟲(chóng)藥物。

自從發(fā)現(xiàn)CRISPR 技術(shù)以來(lái)，在寄生蟲(chóng)學(xué)領(lǐng)域，CRISPR / Cas9 技術(shù)的使用一直在迅速發(fā)展。Peng 等［96］通過(guò)用Cas9 編碼質(zhì)粒和體外轉(zhuǎn)錄的sgRNA 共轉(zhuǎn)染克氏錐蟲(chóng)（Trypanosoma cruzi）證明了CRISPR / Cas9 系統(tǒng)在寄生蟲(chóng)領(lǐng)域的可行性。目前CRISPR / Cas9 已成功地適應(yīng)許多寄生蟲(chóng)系統(tǒng)，包括弓形蟲(chóng)（Toxoplasma gondii）［97］、隱孢子蟲(chóng)（Cryptosporidium parvum）［98］和陰道毛滴蟲(chóng)（Trichomonas vaginalis）［99］。

Crawford 等［100］通過(guò)用重組SpCas9，體外轉(zhuǎn)錄的sgRNA 和200 個(gè)核苷酸的單鏈寡脫氧核苷酸（用于DNA 修復(fù)）轉(zhuǎn)染惡性瘧原蟲(chóng)，實(shí)現(xiàn)了惡性瘧原蟲(chóng)的基因組編輯。但是，這項(xiàng)研究報(bào)道只有23%的轉(zhuǎn)染產(chǎn)生了正確編輯的寄生蟲(chóng)。Shrivastava 等［101］使用CRISPR-Cas9 系統(tǒng)刪除利什曼原蟲(chóng)（Leishmaniaspp）前鞭毛體中的單個(gè)LeishIF4E-3基因，產(chǎn)生具有降低LeishIF4E-3表達(dá)的異源缺失突變體。該突變體表現(xiàn)出新生蛋白合成和生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)的下降、形態(tài)的改變和感染性的減弱。

目前有效治療弓形蟲(chóng)感染的藥物只有磺胺類(lèi)藥物，但由于磺胺類(lèi)藥物不僅副作用大，還無(wú)法有效治療隱形感染階段的幼蟲(chóng)，因此需要一種新的有效藥物來(lái)代替。Zheng 等［102］利用CRISP/Cas9 基因編輯技術(shù)敲除編碼弓形蟲(chóng)的亮氨酸氨基肽酶基因后能影響弓形蟲(chóng)的生長(zhǎng)復(fù)制，雖未能完全阻斷寄生蟲(chóng)的發(fā)育、毒力或酶活性，但對(duì)弓形蟲(chóng)入侵宿主細(xì)胞起到了重要的抑制作用，可以作為用來(lái)治療弓形蟲(chóng)病的輔助藥物靶標(biāo)。對(duì)寄生蟲(chóng)疫苗的研究仍處于早期階段，迄今尚未有成功的方法來(lái)生產(chǎn)有效的市售疫苗來(lái)防治魚(yú)類(lèi)寄生蟲(chóng)。

6 結(jié)語(yǔ)

水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治主要有藥物防治、微生態(tài)制劑、免疫預(yù)防，以及最近新興的RNA 生物農(nóng)藥治療等方法。但其中可使用的疫苗或有效藥物非常有限。常規(guī)的藥物防治以化學(xué)農(nóng)藥和抗生素為主，雖然具有防治方法簡(jiǎn)便、可控性好等優(yōu)點(diǎn)，但潛在的風(fēng)險(xiǎn)也大，藥物殘留問(wèn)題引起各種食品安全以及對(duì)生態(tài)環(huán)境的破壞等問(wèn)題。微生態(tài)制劑不僅克服了有毒物質(zhì)在動(dòng)物體內(nèi)的累積，而且還能提高養(yǎng)殖對(duì)象的免疫力。但目前大多數(shù)微生態(tài)制劑還是為陸地動(dòng)物設(shè)計(jì)的。免疫預(yù)防現(xiàn)階段只停留在實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ诫A段，目前在水產(chǎn)方面的商品化疫苗只有草魚(yú)出血病滅活疫苗，但通過(guò)疫苗來(lái)進(jìn)行免疫預(yù)防需要進(jìn)行逐一注射，耗時(shí)費(fèi)力。已經(jīng)有學(xué)者提出，基于RNAi 的RNA 藥物可應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖以對(duì)抗由病毒和寄生蟲(chóng)引起的各類(lèi)疾?。?03-104］。RNA 藥物在水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治中與傳統(tǒng)化學(xué)藥物相比具有以下優(yōu)勢(shì)：（1）不會(huì)以任何形式改變宿主的遺傳結(jié)構(gòu)；（2）具有可以生物降解的優(yōu)點(diǎn)，在野外會(huì)迅速分解；（3）克服了動(dòng)物體內(nèi)有毒物質(zhì)的積累，在提高動(dòng)物特異性免疫水平的同時(shí)亦能增強(qiáng)機(jī)體的抗應(yīng)激能力；（4）符合不污染環(huán)境、水產(chǎn)食品無(wú)藥物殘留的要求。此外，RNA藥物還具有如下的優(yōu)勢(shì)：（1）易于構(gòu)建、制備和大量生產(chǎn)。Ongvarrasopone 等［105］使用RNaseIII 缺陷型大腸桿菌菌株（HT115）提出了一種簡(jiǎn)單而經(jīng)濟(jì)的體內(nèi)生成大量dsRNA 的系統(tǒng)。通過(guò)該方法，表達(dá)dsRNA 的細(xì)菌可以通過(guò)純化步驟以分離所需的dsRNA，或者直接摻入到顆粒飼料中經(jīng)口服遞送。基于該方法，Saksmerprome 等［106］修改后也成功生產(chǎn)了大量的穩(wěn)定的基于載體的發(fā)夾dsRNA。目前認(rèn)為經(jīng)口服遞送是RNA 藥物在水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治中最可行的遞送方法［107］。（2）特異性；（3）本身具有佐劑的功效［108-109］。RNAi 和CRISPR/Cas 介導(dǎo)的干擾［110］，以及使用小分子促進(jìn)內(nèi)源宿主對(duì)病毒感染的反應(yīng)［111-112］是處理水生醫(yī)學(xué)疾病的強(qiáng)大新興治療策略。

目前在水產(chǎn)方面的RNA 藥物尚未發(fā)展出商品化的藥物，但在抗水產(chǎn)動(dòng)物病原的實(shí)驗(yàn)研究階段已出現(xiàn)了很好的前景，進(jìn)一步的深入研究有可能研發(fā)出可克服成本高，很難大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)和廣泛的推廣應(yīng)用的困難，為水產(chǎn)業(yè)的病害防治提供一條新的解決途徑。