張偉業(yè) 宋浩志 劉興健 李軼女 張志芳

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081）

口蹄疫（Foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD）是一種急性、高度傳染性的接觸性的偶蹄動物傳染?。?］，被國際獸醫(yī)局（OIE）和聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）列為18 種A 類傳染病之首［2］。口蹄疫可影響牛、水牛、豬、綿羊、山羊及70 種以上野生動物［3］?？谔阋卟《荆‵oot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV）為單股正鏈RNA 病毒，屬小 RNA 病毒科口蹄疫病毒屬成員［4-5］?；蚪M突變率非常高，F(xiàn)MD 幾乎在世界各地都有發(fā)現(xiàn)［6-8］。在O 型FMDV 中存在5 個宿主識別位點，其中有3 個在VP1 結(jié)構(gòu)蛋白上，是決定病毒抗原性的主要成分［9］。

鐵蛋白（Ferritin）是參與和調(diào)控鐵的儲存與釋放的重要功能蛋白，是一類廣泛存在于動植物及微生物細(xì)胞中的高含鐵量的蛋白質(zhì)［10］。由24 個亞基高度對稱性地組成內(nèi)空腔結(jié)構(gòu)［11］。在構(gòu)成鐵蛋白外殼的 24 個亞基中，每個亞基的N 端暴露于鐵蛋白外殼的外表面，而C 端伸入到鐵蛋白內(nèi)腔的內(nèi)表面，因此可以利用這種特殊結(jié)構(gòu)，在外表面、內(nèi)表面及相鄰亞基間3 個界面對鐵蛋白進(jìn)行生物或化學(xué)修飾［12］。鐵蛋白具有很好的自組裝能力，有尺寸小、形態(tài)穩(wěn)固、形態(tài)結(jié)構(gòu)高度對稱、亞基數(shù)量固定、生物體相容性較好、應(yīng)用性范圍廣等多種優(yōu)勢，已被廣泛用作模型系統(tǒng)以研究大分子復(fù)合物的自組裝，并已成為了納米材料的反應(yīng)器［13-14］。

現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展促進(jìn)了口蹄疫疫苗從傳統(tǒng)疫苗向新型疫苗發(fā)展，以期為FMD 的防控提供一種安全有效的疫苗［15］。本研究利用鐵蛋白的結(jié)構(gòu)特點和口蹄疫病毒VP1 結(jié)構(gòu)蛋白的免疫原性，設(shè)計構(gòu)建了VP1 與鐵蛋白亞基的融合基因，在大腸桿菌進(jìn)行了表達(dá)。表達(dá)的融合蛋白在透射電鏡下可以觀察到大小約為20 nm 的納米顆粒結(jié)構(gòu)，本研究旨為新型FMD 疫苗的研制提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

基因由南京金斯瑞生物科技有限公司優(yōu)化合成；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞TOP10 和鼠源鐵蛋白多克隆抗體由本實驗室保存；限制性內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶購于Promega 公司；山羊抗鼠IgG 抗體均購于Abcam 公司；2K Plus Maker 購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；BSA 購自羅氏公司；BeyoECL Plus 購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 口蹄疫病毒VP1 與鐵蛋白的優(yōu)化與合成 從NCBI 數(shù)據(jù)庫中挑選2015 年東南亞地區(qū)流行的10 種O 型口蹄疫毒株VP1 氨基酸序列，分析后選用口蹄疫病毒VP1 蛋白基因序列（GenBank：KY399466.1）。因為Kanekiyo 等［16］利用鐵蛋白制備了的自組裝流感納米顆粒疫苗具有很好的廣譜性和大幅度提高了疫苗免疫抗體水平，所以本研究借鑒該文章中的幽門螺桿菌鐵蛋白（GenBank NP_223316）5-167 氨基酸序列，同時也將該基因進(jìn)行點突變（N19Q）消除N-糖基化位點，將絲氨酸-甘氨酸-甘氨酸（Ser-Gly-Gly）linker 插入到編碼鐵蛋白的基因前端。利用密碼子偏好性、去除常用的限制性內(nèi)切酶位點等對兩個基因分別進(jìn)行優(yōu)化，而編碼氨基酸序列不變，不影響其生物活性，無信號肽和跨膜區(qū)存在。通過酶切分析，在兩個基因序列兩端分別加入BamHI、EcoRI 酶切位點。優(yōu)化合成后，插入到pUC-57 載體上，形成兩個重組質(zhì)粒pUC-57-FMDV-VP1、pUC-57-Ferritin。

1.2.2 重組大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建

1.2.2.1 引物設(shè)計 根據(jù)優(yōu)化基因序列以及融合蛋白的基因結(jié)構(gòu)，設(shè)計融合PCR 引物序列（表1），并送到北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。

表1 融合PCR 擴(kuò)增VP1-Ferritin 用引物

1.2.2.2 融合基因的獲得 以pUC-57 FMDV-VP1、pUC-57-Ferritin 為模板，利用上述引物，采用融合PCR 技術(shù)獲得FMDV-VP1-Ferritin 融合基因，并通過引物設(shè)計在融合基因上下游引入BamHI、EcoRI酶切位點，用于后續(xù)酶切連接到大腸桿菌表達(dá)載體pET-28a 上。將融合PCR 獲得的產(chǎn)物FMDV-VP1-Ferritin 基因序列瓊脂糖凝膠電泳，然后用玻璃奶法進(jìn)行回收，-20℃保存。

1.2.2.3 表達(dá)載體的構(gòu)建 將融合PCR 獲得的融合基 因FMDV-VP1-Ferritin 由BamHI 和EcoRI 進(jìn) 行 雙酶切，T4 DNA 連接酶連接到pET-28a 載體上并轉(zhuǎn)入TOP10 感受態(tài)細(xì)胞，用堿裂解法提取質(zhì)粒。經(jīng)北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測序，鑒定結(jié)果一致的重組質(zhì)粒命名為pET-28a-VP1-Ferritin。

1.2.3 融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

1.2.3.1 表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE 電泳 將上述構(gòu)建正確的pET-28a-VP1-Ferritin，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞。分別挑7 個單菌落過夜搖菌，菌液按1%轉(zhuǎn)接4 h，0.5 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)6 h，并將pET-28a 空載體作為空白對照和未經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)的重組質(zhì)粒作陰性對照，SDS-PAGE 蛋白電泳檢測，挑選出表達(dá)量高的菌加入50%甘油-80℃保存。

1.2.3.2 重組蛋白純化 挑取單菌落過夜搖菌，將菌液按照1%轉(zhuǎn)接到200 mL LB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600值在0.6-0.8 之間時誘導(dǎo)表達(dá)。全部集菌后用蒸餾水洗菌液兩次，裂解破碎。將破碎的樣品離心，收集沉淀用包涵體洗滌液Ⅰ和包涵體洗滌液Ⅱ依次洗滌，用含脲的NTA-0 Buffer 重懸，4℃過夜。通過在大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pET-28a 上的His 標(biāo)簽，利用鎳柱親和層析純化重組蛋白，分別用含脲的不同濃度咪唑的NTA Buffer（NTA-25、NTA-50、NTA-100、NTA-250、NTA-500）洗脫液洗脫蛋白，SDS-PAGE蛋白電泳檢測。

1.2.4 重組蛋白鑒定

1.2.4.1 Western blotting 檢測 將純化好的樣品進(jìn)行SDS-PAGE 蛋白凝膠電泳；用濕轉(zhuǎn)法將凝膠上的蛋白樣品轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上；將PVDF 膜取出用PBST洗液清洗3 次，用3%的BSA 封閉1.5 h；封閉結(jié)束后用PBST 洗液清洗3 次，再用500 倍稀釋鼠源鐵蛋白多抗作為一抗孵育2 h，PBST 清洗3 次后，稀釋1 000 倍用HRP 標(biāo)記的羊抗小鼠IgG 孵育2 h；PBST 清洗3 次后用BeyoECL plus AB 混合液顯色觀察。

1.2.4.2 質(zhì)譜鑒定 將純化樣品SDS-PAGE 電泳獲得的正確的單一的條帶切取，放入EP 管中，加入蛋白電泳液保護(hù)膠塊，送至上海鹿明生物科技有限公司進(jìn)行LC-MSMS 質(zhì)譜分析。

1.2.4.3 電鏡觀察 將純化好的重組蛋白樣品和空白對照樣品分別放入被活化的3 500 Da 的透析袋中，分別用8、6、4、2、1 和0 mol/L 的尿素對透析袋進(jìn)行透析，每種濃度透析4 h，使重組蛋白恢復(fù)其正常的高級結(jié)構(gòu)。送中國科學(xué)院動物研究所電鏡室，利用負(fù)染色法，將樣品懸浮液用1%的醋酸鈾染色液染色晾干后，使用HITACHI TEM-H7500 透射電鏡觀察記錄。

2 結(jié)果

2.1 融合基因的獲得

2.1.1 FMDV VP1-Ferritin 基因序列PCR 擴(kuò)增 以pUC-57 FMDV VP1 核酸序列和pUC-57 Ferritin 核酸序列為模板，經(jīng)過PCR 反應(yīng)擴(kuò)增出FMDV-VP1 基因序列和Ferritin 基因序列，各自序列大小分別為677 bp 和531 bp，瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果（圖1）。在相應(yīng)地位置出現(xiàn)了明顯的條帶，與設(shè)計序列大小相符。

將獲得的FMDV-VP1 基因序列和Ferritin 基因序列作為模板，通過融合PCR 獲得FMDV-VP1-Ferritin 基因序列，長度為1 160 bp。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果（圖2）。在約1 000 bp 處存在一條與目的序列分子量大小接近的清晰單一條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。

圖1 FMDV VP1 與Ferritin 的PCR 擴(kuò)增結(jié)果

圖2 FMDV VP1-Ferritin 的PCR 擴(kuò)增

2.1.2 表達(dá)載體的構(gòu)建 將融合基因FMDV-VP1-Ferritin 插入到表達(dá)載體pET-28a 的BamHI 和EcoRI位點之間，獲得表達(dá)載體pET-28a-VP1-Ferritin，對其進(jìn)行酶切鑒定，結(jié)果如圖3 所示，有兩條明顯的條帶出現(xiàn)，大小與預(yù)期結(jié)果一致（1 160 bp 和5 369 bp），對酶切鑒定正確的質(zhì)粒進(jìn)行測序鑒定，進(jìn)一步確證了表達(dá)載體pET-28a-VP1-Ferritin 構(gòu)建正確，用于后續(xù)的蛋白表達(dá)。

圖5 重組蛋白VP1-Ferritin 純化后洗脫結(jié)果

2.2 原核表達(dá)重組蛋白

2.2.1 表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE 電泳 測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中表達(dá)，進(jìn)行SDS-PAGE 電泳檢測重組蛋白表達(dá)結(jié)果。由于表達(dá)蛋白序列前存在一段含有His-Tag 的序列，預(yù)測的目的蛋白表達(dá)序列VP1-Ferritin 為46.3 Da，顯示與預(yù)測結(jié)果相符（圖4）。

圖4 pET-28a VP1-Ferritin 表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE 電泳檢測結(jié)果

2.2.2 鎳柱親和層析純化表達(dá)蛋白 將表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行鎳柱親和層析純化，各濃度洗脫液進(jìn)行洗脫后進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳檢測。pET-28a-VP1-Ferritin 在含100 mmol/L 咪唑的洗脫液中存在較多的重組蛋白（圖5）。經(jīng)BCA 蛋白濃度檢測，最終可獲得約0.753 mg 重組蛋白。

圖3 重組質(zhì)粒酶切驗證結(jié)果

2.2.3 重組蛋白的Western blotting 分析 NTA100 洗脫的純化樣品的Western blotting 檢測結(jié)果如圖6 所示，在樣品相應(yīng)位置上有明顯的條帶，而在陰性對照中并沒有特異性條帶出現(xiàn)，可知樣品中有特異性表達(dá)產(chǎn)物存在。

圖6 重組蛋白His-VP1-Ferritin 的Western blotting 分析結(jié)果

2.2.4 表達(dá)蛋白的質(zhì)譜鑒定 將SDS-PAGE 電泳結(jié)果中的目的條帶切下，進(jìn)行LC-MSMS 質(zhì)譜分析，其分析結(jié)果與預(yù)期的重組蛋白肽段序列相匹配，覆蓋率高達(dá)78%，由此進(jìn)一步驗證了重組蛋白His-VP1-Ferritin 的表達(dá)結(jié)果正確（表2）。

2.2.5 電鏡觀察重組蛋白 將純化樣品復(fù)性后，使用透射電鏡觀察。發(fā)現(xiàn)FMDV-VP1-Ferritin 組裝的顆粒結(jié)構(gòu)大小在20 nm 左右，大于鐵蛋白納米顆粒的12 nm。而在對照電鏡結(jié)果中未發(fā)現(xiàn)有同樣的顆粒（圖7）。由此初步推斷，可能將VP1 結(jié)構(gòu)蛋白組裝到了鐵蛋白籠狀結(jié)構(gòu)外表面。

表2 重組蛋白His-VP1-Ferritin 的質(zhì)譜鑒定結(jié)果

圖7 原核表達(dá)His-VP1-Ferritin 和空白對照蛋白樣品電鏡觀察圖（scale bars=50 nm）

3 討論

口蹄疫是由小核糖核酸病毒科口蹄疫病毒（FMDV）引起的具有高度傳染性、對經(jīng)濟(jì)影響重大的動物疾病［17］，極大地影響了國際間家畜及動物源性食品的貿(mào)易，一直都是各國政府防控和消滅的重中之重。由于FMDV 的聚合酶缺乏校對能力，使其基因組具有非常高的突變率［18］。通過不同血清型的差異將該病毒分成了兩個群，在群間同源性只達(dá)到了25%-45%［9］，在不同血清型間沒有交叉免疫現(xiàn)象，這也為針對FMD 疫苗的研制與防疫帶來是很大的困難。FMD 傳播非常迅速，對于一些變異種，人也容易受到感染［19］，并可以將病毒傳染給接觸的家畜?，F(xiàn)在最常用FMDV 滅活疫苗主要還是利用1962年的BHK-21 細(xì)胞系制備［20］。隨后，又有研究獲得多種FMD 滅活二聯(lián)苗［21］。李光金等［22］利用口蹄疫病毒VP1 結(jié)構(gòu)蛋白研制出了抗豬O 型口蹄疫基因工程疫苗，該疫苗免疫動物后可產(chǎn)生4-5 個月的保護(hù)?，F(xiàn)在對于FMD 的疫苗仍然以滅活疫苗為主，但存在著很多缺陷性和危險性。而對于新型疫苗的研制也一直在繼續(xù)，并獲得具有更廣譜的免疫保護(hù)［23-26］，但是對于在實際應(yīng)用中獲得一種安全高效、可大規(guī)模生產(chǎn)的穩(wěn)定疫苗仍然存在著一定的差距。

鐵蛋白是由24 個亞基經(jīng)自組裝構(gòu)成一個中空的球狀結(jié)構(gòu)，每個亞基的N 末端都暴露在鐵蛋白球形的外表面，均可用于修飾，這使得鐵蛋白納米顆粒成為了疫苗開發(fā)和抗原遞呈的新平臺［27］。鐵蛋白可以和多種蛋白融合表達(dá)，自組裝成納米顆粒［28］。有研究表明，將蛋白質(zhì)作為抗原進(jìn)行遞呈，可誘導(dǎo)出較強的免疫反應(yīng)［29］。例如，Kanekiyo 等［16］利用鐵蛋白此特性，將流感病毒血凝素修飾到鐵蛋白外表面構(gòu)成的血凝素納米抗原其誘導(dǎo)的中和抗體水平是傳統(tǒng)的滅活疫苗的10 倍以上，并可以對流行跨度長達(dá)70 多年的各年代的典型的人流感病毒的毒株產(chǎn)生保護(hù)作用。此外，還有研究人員將輪狀病毒VP6蛋白與鐵蛋白融合，通過大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)并自組裝成納米疫苗，有效地誘導(dǎo)體液免疫和粘膜免疫［30］。基于FMD 疫苗的研究現(xiàn)狀，本研究選用鐵蛋白作為納米微粒，利用鐵蛋白亞基N 末端的可修飾性，與鐵蛋白的可自組裝的結(jié)構(gòu)特性，將口蹄疫相關(guān)抗原蛋白展示在鐵蛋白外殼的外表面，以期獲得具有高的病毒免疫效力和廣譜性的口蹄疫納米疫苗。

在O 型FMDV 中最重要的抗原位點位于VP1 結(jié)構(gòu)蛋白上［9］，可用于誘導(dǎo)細(xì)胞免疫與體液免疫，產(chǎn)生具有保護(hù)性的中和性抗體［31］。幽門螺桿菌鐵蛋白與哺乳動物相比有高度趨異序列，在接種疫苗后將誘導(dǎo)自身免疫的可能性最小化［32］。因此，本研究選用GenBank：KY399466.1 的口蹄疫病毒VP1 蛋白基因序列和GenBank：NP_223316 的鐵蛋白基因序列。

本研究表達(dá)的融合蛋白VP1-Ferritin 在電鏡下可觀察到約20 nm 的球狀顆粒，并且球狀顆粒大于鐵蛋白的12 nm，因此可初步推斷可能是VP1 組裝到了鐵蛋白籠狀結(jié)構(gòu)外表面而導(dǎo)致顆粒直徑變大，尚需進(jìn)一步的結(jié)果進(jìn)行確定。利用鐵蛋白自組裝成納米顆粒的特性，將抗原蛋白與其融合表達(dá)，從而將抗原蛋白展示在納米顆粒的表面，以提高抗原的免疫原性，本研究為新型疫苗的研制提供了一種新思路。

4 結(jié)論

本研究利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)成功的表達(dá)了VP1-Ferritin 蛋白，通過電鏡觀察可初步認(rèn)定VP1 被組裝到了鐵蛋白籠狀結(jié)構(gòu)外表面，但尚需開展進(jìn)一步的研究進(jìn)行確定。同時，利用鐵蛋白自組裝的特性表面展示抗原蛋白，增強抗原的免疫原性，為研制更為廣譜、高效的疫苗提供了技術(shù)支持。